CN111018821B - 双黄酮类化合物及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种双黄酮类化合物,为选自式I、式II和式III所示的任一化合物与式I、式II和式III所示的任一化合物通过2'‑2”'的C‑C连接方式连接得到的化合物或者其药学上可接受的盐。本发明提供的双黄酮类化合物中,式VII、式VIII和式IX所示的化合物是从枳椇子中分离得到天然双黄酮类化合物,体外抗呼吸道合胞病毒活性试验以及抗炎活性试验的试验结果表明,本发明提供的式VII、式VIII或式IX所示的双黄酮类化合物具有显著的抗病毒活性和抗炎活性,可用于制备具有抗病毒和/或抗炎功效的药物或食品。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域,具体涉及一种双黄酮类化合物及其制备方法和用途。
背景技术
枳椇子是鼠李科枳椇属植物的干燥、成熟种子,别名拐枣、木蜜、鸡距子等,中医认为其性甘,味平、无毒,具有清热利尿、止渴除烦、解酒保肝的作用,民间常用于保肝、解酒精毒、治疗呃逆和小便不利等症。药理研究表明,黄酮类化合物是枳椇子的药效物质基础,其具有保肝、解酒、抗氧化、抗炎等作用。
王婷婷等发布的论文“拐枣的功效成分及加工利用”(中国食物与营养2018,24(10):20-25)公开,目前从枳椇子中分离出的黄酮类物质主要包括:(2R,3R)-3,5,7,4’,5’-五羟基-3’-甲氧基二氢黄酮(laricetrin)、枳椇素I-III(hovenitin I-III)、北枳椇醇(hovenodutinol)、槲皮素(quercetin)、(2R,3R)-3,3’,5’,5,7-五羟基二氢黄酮、(+)-白蔹素、落叶黄素、杨梅素(myricetin)、(+)-没食子儿茶素((+)-gallocatechin)、(+)-二氢杨梅素(Dihydromyricetin)、山奈酚(kaempferol)等三十多种。但目前分离得到的与枳椇子相关的黄酮类化合物中,双黄酮类化合物未见报道。
现有已从植物中分离得到的双黄酮类天然产物有很多,其连接方式以C-C连接最为普遍,而C-C连接方式中,主要为3'-8”连接和3'-6”连接(详见徐智,束俭辉,谭桂山.双黄酮类化合物研究进展[J].中国现代医学杂志,2004,14(7):88-91.)。双黄酮类天然产物结构复杂,药理活性显著,具有抗氧化、抗炎、抗病毒、抗肿瘤等作用,对双黄酮类化合物开发以及分离出更多的双黄酮类天然化合物,具有广阔的前景。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种双黄酮类化合物,以解决上述技术问题中的至少一个。
本发明的另一个目的在于提供上述双黄酮类化合物在制备抗病毒和/或抗炎药物或食品中的应用,以解决上述技术问题中的至少一个。
本发明的又一个目的在于提供上述双黄酮类化合物的制备方法,以解决上述技术问题中的至少一个。
根据本发明的一个方面,提供了一种双黄酮化合物,为选自下述式I、式II和式III所示的任一化合物与式I、式II和式III所示的任一化合物通过2'-2”'的C-C连接方式连接得到的化合物或者其药学上可接受的盐,其中,其中,R1-R18中的每一个均独立地为羟基、甲基、乙基或乙酰基。
在一些实施方式中,可以为式IV、式V或式VI所示的化合物或其药学上可接受的盐:
其中,R19-R54中的每一个均独立地为羟基、甲基、乙基或乙酰基。
在一些实施方式中,R19-R54中的每一个均为羟基;即,本发明的双黄酮化合物可以为下述式VII、式VIII或式IX所示的化合物或其药学上可接受的盐:
本发明提供的式VII、式VIII和式IX所示的化合物是首次从枳椇子中分离得到的新的双黄酮类天然化合物,且本发明双黄酮类化合物中,两个片段通过C-C连接方式中的2'-2”'连接,结构新颖独特。
根据本发明的另一个方面,提供了上述双黄酮类化合物在制备抗病毒和/或抗炎药物或食品中的应用。
通过体外的抗呼吸道合胞病毒活性试验以及体外的抗炎活性试验,测定了本发明提供的双黄酮类化合物的抗病毒活性和抗炎活性,试验结果表明,本发明提供的双黄酮类化合物具有显著的抗病毒活性和抗炎活性。因此,本发明提供的双黄酮类化合物可用于制备具有抗病毒和/或抗炎功效的药物、保健品、食品、化妆品等。其中,本发明双黄酮类化合物可以单独或与其他活性成分、载体、辅料等以任意比例配伍,用于制备药物、保健品、食品和化妆品。
根据本发明的又一个方面,提供了式VII、式VIII和式IX所示的化合物的制备方法,包括如下步骤:
(1)枳椇子用体积浓度为40%-95%的乙醇-水溶液进行提取,回收提取液得枳椇子乙醇粗提物;
(2)枳椇子乙醇粗提物用大孔吸附树脂色谱法进行分离,以不同体积比的乙醇/水或甲醇/水为洗脱剂进行梯度洗脱,收集目标大孔树脂洗脱物;
(3)将目标大孔树脂洗脱物用硅胶柱色谱法进行分离,以不同体积比的二氯甲烷/甲醇、二氯甲烷/丙酮、氯仿/丙酮、氯仿/甲醇、石油醚/乙酸乙酯或石油醚/丙酮为洗脱剂进行梯度洗脱,收集目标硅胶柱洗脱物;
(4)将目标硅胶柱洗脱物用凝胶柱色谱法进行分离,以甲醇/水为洗脱剂,收集多个馏分并通过质谱鉴定得到含有化合物1-3的目标馏分;
(5)将目标馏分用高效液相色谱法进行分离,以甲醇/水或乙腈/水为流动相,检测波长为200-300nm,得式VII和/或式VIII和/或式IX所示的化合物。
需要说明的是,本发明中,所述的枳椇子为鼠李科(Rhamnaceae)枳椇属枳椇(Hovenia acerba Lindl.)、北枳椇(Hovenia dulcis Thunb.)或者毛果枳椇(Hoveniatrichocarpa)的干燥成熟种子;所述的“溶剂A/溶剂B”表示的是溶剂A与溶剂B以一定的体积比混合得到的混合溶剂,如:“乙醇/水”表示的是乙醇和水以一定的体积比混合得到的乙醇水溶液;“二氯甲烷/甲醇”表示的是二氯甲烷和甲醇以一定的体积比混合得到的混合溶剂。
在一些实施方式中,步骤(1)中的提取方法具体可以为加热回流提取或者超声提取或者渗漉提取1-3次,药材:溶剂的重量体积比可以为1:4-1:15g/mL。优选地,枳椇子与乙醇-水溶液的重量体积比为1:5-1:10g/mL。
在一些实施方式中,步骤(2)中的大孔吸附树脂可以为孔径为25-100nm的D101大孔吸附树脂。
在一些实施方式中,步骤(2)中,乙醇/水或甲醇/水中,乙醇与水的体积比或甲醇与水的体积比可以为3:7-5:5。
在一些实施方式中,步骤(3)中,二氯甲烷/甲醇、氯仿/甲醇中,二氯甲烷与甲醇的体积比或氯仿与甲醇的体积比可以为1:0-1:1;二氯甲烷/丙酮、氯仿/丙酮中,二氯甲烷与丙酮的体积比或氯仿与丙酮的体积比可以为1:0-1:2;石油醚/乙酸乙酯、石油醚/丙酮中,石油醚与乙酸乙酯的体积比或石油醚与丙酮的体积比可以为1:0-0:1。
在一些实施方式中,步骤(4)中,甲醇/水中,甲醇与水的体积比可以为5:5-7:3。
在一些实施方式中,步骤(5)中,甲醇/水或乙腈/水中,甲醇与水的体积比或乙腈与水的体积比可以为15:85-95:5。进一步优选地,甲醇与水的体积比或乙腈与水的体积比可以为35:65-70:30。
附图说明
图1-6依次为化合物1的质谱图、核磁共振氢谱图、核磁共振碳谱图、红外光谱谱图、紫外光谱谱图和CD谱图;
图7-12依次为化合物2的质谱图、核磁共振氢谱图、核磁共振碳谱图、红外光谱谱图、紫外光谱谱图和CD谱图;
图13-18依次为化合物3的质谱图、核磁共振氢谱图、核磁共振碳谱图、红外光谱谱图、紫外光谱谱图和CD谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步详细的说明。
实施例1化合物1-3的制备
(1)取北枳椇干燥成熟种子1000g,粉碎后用5L体积浓度为60%的乙醇-水溶液加热回流提取3次,减压回收提取液得到枳椇子乙醇粗提物;
(2)步骤(1)所得的枳椇子乙醇粗提物用孔径为25-100nm的D101大孔吸附树脂进行分离,分别用体积比为0:1、1:9、3:7、5:5、7:3、9:1的乙醇/水进行梯度洗脱,洗脱过程中通过质谱仪对洗脱物进行监测,并根据待分离的化合物1~3的理化性质,收集以体积浓度为30%的乙醇-水溶液(即体积比为3:7的乙醇/水)为洗脱剂洗脱得到的洗脱物;
(3)将步骤(2)中所得的以体积分数为30%的乙醇为洗脱剂洗脱收集到的洗脱物用硅胶柱色谱法进行分离,以体积比为10:1,9:1,8:2,7:3,6:4,1:1,0:1的二氯甲烷/甲醇进行梯度洗脱,洗脱过程中通过质谱仪对洗脱物进行监测,并根据待分离的化合物1~3的理化性质,收集以体积比为7:3的二氯甲烷/甲醇为洗脱剂洗脱得到的洗脱物;
(4)将步骤(3)中所得的以体积比为7:3的二氯甲烷/甲醇为洗脱剂洗脱收集到的洗脱物用凝胶柱Sephadex LH-20进行进一步分离,以体积比为65:35的甲醇/水为洗脱剂进行洗脱,洗脱过程中通过薄层层析法对洗脱物进行监测并收集和合并不同洗脱物,依次得到12个馏分;
(5)通过质谱仪对各馏分进行鉴定,并根据待分离的化合物1~3的理化性质,步骤(4)所得的馏分3进行高效液相色谱分离,以体积比为40:60的甲醇/水作为流动相,检测波长为280nm,得到化合物1(tR=10min)、化合物2(tR=21min)和化合物3(tR=29min),tR是指色谱峰的保留时间。
化合物2的质谱图、核磁共振氢谱图、核磁共振碳谱图、红外光谱谱图、紫外光谱谱图和CD谱图依次如图7-12所示,经分析,其结构式为:
化合物3的质谱图、核磁共振氢谱图、核磁共振碳谱图、红外光谱谱图、紫外光谱谱图和CD谱图依次如图13-18所示,经分析,其结构式为:
化合物1-3的理化和光谱数据如下:
化合物1:黄色粉末,[α]25 D-127.35(c 0.20,ACN),[α]25 D+90.35(c 0.20,MeOH),CD(ACN)Δε218+18.42,Δε268+7.94,Δε347-10.47;UVλmax(ACN)nm(logε):209(3.99),290(2.94);IRνmax(film):3350,1636,1605,1468,1305,1168,1087,1043;HR-ESI-MS:m/z635.0682[M-H]-(C30H19O16,calcd for 635.0668).
化合物2:黄色粉末,[α]25 D+122.67(c 0.70,ACN),[α]25 D+126.10(c 0.70,MeOH),CD(ACN)Δε220+47.39,Δε245+7.52,Δε265-14.94,Δε340-0.84;UVλmax(ACN)nm(logε):210(4.78),290(4.29);IRνmax(film):3163,1628,1591,1463,1277,1162,1085,1019;HR-ESI-MS:m/z 637.0833[M-H]-(C30H21O16,calcd for 637.0824).
化合物3:黄色粉末,[α]25 D+91.92(c 0.35,ACN),[α]25 D+35.34(c 0.35,MeOH),CD(ACN)Δε216+54.73,Δε266+7.61,Δε293-8.06,Δε340-3.69;UVλmax(ACN)nm(logε):209(3.90),290(2.89);IRνmax(film):3309,1634,1513,1465,1294,1169,1086,1014;HR-ESI-MS:m/z 637.0834[M-H]-(C30H21O16,calcd for 637.0824).
化合物1、2和3的NMR数据归属见表1和表2.
表1双黄酮化合物1-3的13C-NMR数据
NO. | 化合物1 | 化合物2 | 化合物3 | NO. | 化合物1 | 化合物2 | 化合物3 |
2 | 80.4 | 79.9 | 80.4 | 2” | 149.8 | 79.9 | 80.4 |
3 | 71.6 | 71.4 | 70.9 | 3” | 133.1 | 71.4 | 70.9 |
4 | 196.5 | 198.3 | 196.3 | 4” | 175.9 | 198.3 | 196.3 |
5 | 163.3 | 163.0 | 163.3 | 5” | 160.4 | 163.0 | 163.3 |
6 | 95.8 | 95.8 | 95.8 | 6” | 97.8 | 95.8 | 95.8 |
7 | 167.0 | 166.7 | 167.0 | 7” | 163.4 | 166.7 | 167.0 |
8 | 95.0 | 95.1 | 95.1 | 8” | 93.4 | 95.1 | 95.1 |
9 | 162.6 | 162.9 | 162.5 | 9” | 156.3 | 162.9 | 162.5 |
10 | 100.2 | 100.5 | 100.3 | 10” | 103.2 | 100.5 | 100.3 |
1' | 126.2 | 126.4 | 125.7 | 1”' | 120.7 | 126.4 | 125.7 |
2' | 115.7 | 116.6 | 115.7 | 2”' | 116.4 | 116.6 | 115.7 |
3' | 144.2 | 144.8 | 144.0 | 3”' | 144.3 | 144.8 | 144.0 |
4' | 135.8 | 133.2 | 133.9 | 4”' | 136.2 | 133.2 | 133.9 |
5' | 144.3 | 145.2 | 145.2 | 5”' | 145.0 | 145.2 | 145.2 |
6' | 110.2 | 105.3 | 105.6 | 6”' | 104.6 | 105.3 | 105.6 |
表2双黄酮化合物1-3的1H-NMR数据
实施例2
(1)取毛果枳椇干燥成熟种子1500g,粉碎后用10L体积浓度为80%的乙醇-水溶液渗漉提取2次,减压回收提取液得到枳椇子乙醇粗提物;
(2)步骤(1)所得的枳椇子乙醇粗提物用孔径为25-100nm的D101大孔吸附树脂进行分离,分别用体积比为0:1、2:8、4:6、6:4、8:2的甲醇/水进行梯度洗脱,洗脱过程中通过质谱仪对洗脱物进行监测,并根据待分离的化合物1~3的理化性质,收集以体积比为4:6的甲醇/水为洗脱剂洗脱得到的洗脱物;
(3)将步骤(2)中所得的以体积比为4:6的甲醇/水为洗脱剂洗脱收集到的洗脱物用硅胶柱色谱法进行分离,以体积比为1:0,8:2,7:3,6:4,1:1,0:1的氯仿/丙酮进行梯度洗脱,洗脱过程中通过质谱仪对洗脱物进行监测,并根据待分离的化合物1~3的理化性质,收集以体积比为6:4的氯仿/丙酮为洗脱剂洗脱得到的洗脱物;
(4)将步骤(3)中所得的以体积比为6:4的氯仿/丙酮为洗脱剂洗脱收集到的洗脱物用凝胶柱Sephadex LH-20进行进一步分离,以体积比为70:30的甲醇/水为洗脱剂进行洗脱,洗脱过程中通过薄层层析法对洗脱物进行监测并收集和合并不同洗脱物,依次得到10个馏分;
(5)通过质谱仪对各馏分进行鉴定,并根据待分离的化合物1~3的理化性质,取步骤(4)所得的馏分5进行高效液相色谱分离,以体积比为35:65的甲醇/水作为流动相,检测波长为254nm,得到化合物1(tR=14min)、化合物2(tR=28min)和化合物3(tR=36min)。实施例2所得化合物均与实施例1所得化合物吻合。
实施例3
(1)取枳椇干燥成熟种子2000g,粉碎后用14L体积浓度为50%乙醇-水溶液加热超声提取2次,减压回收提取液得到枳椇子乙醇粗提物;
(2)步骤(1)所得的枳椇子乙醇粗提物用孔径为25-100nm的D101大孔吸附树脂进行分离,分别用体积比为0:1、1:9、3:7、5:5、7:3、95:5的乙醇/水进行梯度洗脱,洗脱过程中通过质谱仪对洗脱物进行监测,并根据待分离的化合物1~3的理化性质,收集以体积比为3:7的乙醇/水为洗脱剂洗脱得到的洗脱物;
(3)将步骤(2)中所得的以体积比为3:7的乙醇/水为洗脱剂洗脱收集到的洗脱物用硅胶柱色谱法进行分离,以体积比为1:0,8:2,6:4,1:1,1:2,1:4,0:1的石油醚/乙酸乙酯进行梯度洗脱,洗脱过程中通过质谱仪对洗脱物进行监测,并根据待分离的化合物1~3的理化性质,收集以体积比为1:4的石油醚/乙酸乙酯为洗脱剂洗脱得到的洗脱物;
(4)将步骤(3)中所得的以体积比为1:4的石油醚/乙酸乙酯为洗脱剂洗脱收集到的洗脱物用凝胶柱Sephadex LH-20进行进一步分离,以体积比为50:50的甲醇/水为洗脱剂进行洗脱,洗脱过程中通过薄层层析法对洗脱物进行监测并收集和合并不同洗脱物,依次得到16个馏分;
(5)通过质谱仪对各馏分进行鉴定,并根据待分离的化合物1~3的理化性质,取步骤(4)所得的馏分12进行高效液相色谱分离,以体积比为50:50的甲醇/水作为流动相,检测波长为210nm,得到化合物1(tR=6min)、化合物2(tR=15min)和化合物3(tR=21min)。实施例3所得化合物均与实施例1所得化合物吻合。
试验例1:抗呼吸道合胞病毒(RSV A2)活性试验
用HEp-2细胞系评价化合物1-3的毒性和抗RSV A2病毒活性。HEp-2细胞系传代培养后制备HEp-2细胞悬液。取RSV A2病毒稀释成系列浓度,接种HEp-2细胞制成病毒悬液。设置化合物1-3组和阳性对照组,其中,阳性对照药为利巴韦林(Ribavirin)。化合物1-3和阳性对照药过滤除菌后加入HEp-2细胞悬液中,以MTT法评价药物的细胞毒性(CC50)。化合物1-3和阳性对照药加入病毒悬液中观察药物对RSV病毒致细胞病变的抑制效果,采用空斑减数法测定化合物对病毒在HEp-2细胞中的增值抑制(IC50),结果见表3。
表3双黄酮化合物1-3的抗呼吸道合胞病毒试验结果
药物 | CC<sub>50</sub>(μmol/mL) | IC<sub>50</sub>(μmol/mL) |
化合物1 | >100 | 50.0±5.0 |
化合物2 | >100 | 37.5±2.5 |
化合物3 | >100 | 37.5±2.5 |
Ribavirin | >100 | 12.5±2.5 |
由表3的结果可知,化合物1-3的IC50均低于100,表明本发明提供的双黄酮化合物1-3具有抗流感病毒的活性。
试验例2:抗炎活性试验
取RAW264.7巨噬细胞,复苏培养,视细胞生长状态进行传代后,采用LPS体外诱导建立模型;随机分为空白对照组、模型对照组、给药组和阳性对照组(地塞米松)。空白对照组正常培养小鼠RAW264.7巨噬细胞24小时;模型对照组以10ng/ml LPS诱导RAW264.7巨噬细胞24小时,建立炎症细胞模型;给药组以62、31、15.5μmol/ml化合物和10ng/ml LPS共同处理RAW264.7巨噬细胞模型24小时;阳性对照组以31μmol/ml地塞米松和10ng/ml LPS共同处理RAW264.7巨噬细胞模型24小时。然后收集细胞培养液和细胞,ELISA检测细胞培养上清中的PGE2和细胞因子(IL-1β、IL-6),试验结果见表4。
表4双黄酮化合物1-3的抗炎活性试验结果
由表4的结果可知,本发明提供的双黄酮化合物1-3具有抗炎活性。
以上所述的仅是本发明的一些实施方式。对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明创造构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。
Claims (3)
3.根据权利要求1所述的双黄酮类化合物的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)枳椇子用体积浓度为40%-95%的乙醇-水溶液进行提取,回收提取液得枳椇子乙醇粗提物;所述提取的方法具体为加热回流提取或者超声提取或者渗漉提取1-3次,枳椇子与乙醇-水溶液的重量体积比为1:4-1:15g/mL;
(2)枳椇子乙醇粗提物用大孔吸附树脂色谱法进行分离,以不同体积比的乙醇/水或甲醇/水为洗脱剂进行梯度洗脱,收集目标大孔树脂洗脱物;所述乙醇/水或甲醇/水中,乙醇与水的体积比或甲醇与水的体积比为3:7-5:5;
(3)将目标大孔树脂洗脱物用硅胶柱色谱法进行分离,以不同体积比的二氯甲烷/甲醇、二氯甲烷/丙酮、氯仿/丙酮、氯仿/甲醇、石油醚/乙酸乙酯或石油醚/丙酮为洗脱剂进行梯度洗脱,收集目标硅胶柱洗脱物;所述二氯甲烷/甲醇、氯仿/甲醇中,二氯甲烷与甲醇的体积比或氯仿与甲醇的体积比为1:0-1:1;所述二氯甲烷/丙酮、氯仿/丙酮中,二氯甲烷与丙酮的体积比或氯仿与丙酮的体积比为1:0-1:2;所述石油醚/乙酸乙酯、石油醚/丙酮中,石油醚与乙酸乙酯的体积比或石油醚与丙酮的体积比为1:0-0:1;
(4)将目标硅胶柱洗脱物用凝胶柱色谱法进行分离,以甲醇/水为洗脱剂,收集多个馏分并通过质谱鉴定得到含有化合物1-3的目标馏分;所述甲醇/水中,甲醇与水的体积比为5:5-7:3;
(5)将目标馏分用高效液相色谱法进行分离,以甲醇/水或乙腈/水为流动相,检测波长为200-300nm,得到式VII和/或式VIII和/或式IX所示的化合物;所述甲醇/水或乙腈/水中,甲醇与水的体积比或乙腈与水的体积比为15:85-95:5。
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