CN102580001A - 固本抑瘤ⅱ号含药血清诱导肿瘤细胞自噬的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了固本抑瘤II号含药血清诱导肿瘤细胞自噬的用途。所述的固本抑瘤II号含药血清可用作自噬诱导物,应用于抗肿瘤药物的研发,开拓了固本抑瘤II号的新用途,为制备通过调控自噬抗肿瘤的药物提供了新选择。
Description
技术领域
本发明涉及一种中药制剂的新用途,具体涉及一种固本抑瘤II号含药血清诱导肿瘤细胞自噬的用途。
背景技术
固本抑瘤II号是郁仁存等国家级名老中医在多年临床经验基础上提出的配合放、化疗治疗肿瘤的重要方剂(郁仁存,王笑民,徐咏梅等,郁仁存,中国中医药出版社[M].2007.11)。经初步研究,据称本方能降低患者的异常的血液流变学指标,提高免疫功能,减轻骨髓抑制及肠胃反应。
固本抑瘤II号由党参、茯苓、生白术、生黄芪、川芎、鸡血藤等13味药组成。根据功效,将全方拆分为三组,益气组由党参、茯苓、白术、生黄芪、女贞子、枸杞子、仙灵脾组成,活血组由川芎、鸡血藤、莪术组成,解毒组由苦参、肿节风、浙贝母组成。前期实验发现该方中活血药鸡血藤其黄酮类成分促进细胞非凋亡性程序死亡(唐勇,王笑民,何薇等,鸡血藤提取物体外抗肿瘤实验研究,中国中医基础医学杂志,2007,13(4):306-308)。
“药物血清”的概念由80年代日本昭和药科大学田代真一教授首次提出(田代真一,和汉药の实验的研究における诸问题-invitrog实验の问题[J],和汉医药学会志,1991,8,218.)。中药血清药理学,是通过给动物灌服中药或中药复方,经过一段时间后采血、然后分离血清,用含有药物成分的动物血清进行体外实验的一种技术。能最大程度地模拟中药经口服途径进入体内,通过神经、体液(如细胞因子、免疫系统等)等机制作用于病变部位的过程。
研究发现多种中药单体具有诱导肿瘤自噬的作用,如槲皮素(quercetin)等黄酮类化合物能诱导结肠腺癌细胞自噬性死亡(Psahoulia FH,Moumtzi S,RobertsML,Sasazuki T,Shirasawa S,PintzasA.Quercetin mediates preferentialdegradation of oncogenicRas and causes autophagy in Ha-RAS-transformed humancolon cells[J].Carcinogenesis,2007,28(5):1021-1031.)。
中药含药血清体外抗肿瘤的研究主要集中在诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞端粒酶活性、抑制肿瘤细胞体外增殖、协同细胞毒化疗药物作用、形成肿瘤细胞周期阻滞等方面,有关中药对细胞自噬机制研究主要集中在中药单体对肿瘤方面的研究,而中药复方对肿瘤细胞自噬干预作用的研究尚未见报道。
临床研究表明固本抑瘤II号能降低外周血中的血栓素TXB和纤维蛋白原水平,改善机体血液高凝状态;提高NK细胞活性和T4/T8比值,进而增强免疫功能,小鼠实验发现60~120g·kg/d的固本抑瘤II号具有化疗增效作用,全方和行气活血组水提物能抑制A549细胞生长,与DDP具有增效作用,能使肿瘤细胞生长阻滞于G0/G1期。
张青等(固本抑瘤II号配合化学药物动脉灌注治疗中晚期肝癌58例临床研究,张青等,中医杂志,2007年,第48卷第03期)观察固本抑瘤II号配合化学药物动脉灌注治疗原发性肝癌的疗效,针对112例原发性肝癌患者,随机分为治疗组(固本抑瘤II号配合化学药物动脉灌注)58例、对照组(化学药物动脉灌注)54例;3~4周灌注1次,每组患者至少完成3次治疗。治疗组的稳定率为89.7%,一年生存率为68.9%,二年生存率为51.7%,均明显高于对照组(P<0.05);并可缓解化疗药物的毒副反应,保护肝脏功能,改善患者的生活质量,固本抑瘤II号配合化学药物动脉灌注治疗原发性肝癌有较好的减毒增效作用。
杨国旺等(固本抑瘤II号联合化疗治疗晚期乳腺癌28例临床观察,杨国旺等,中医杂志,2008年,第49卷第12期)观察中药固本抑瘤II号在晚期乳腺癌治疗中的作用,针对55例复发或转移性乳腺癌患者随机分为治疗组和对照组,两组均采用NP(去甲长春花碱+顺铂)方案化疗,治疗组同时加服中药固本抑瘤II号。结果显示,治疗组肿瘤缓解率、临床获益率分别为50.0%和92.9%,对照组两指标分别为40.7%和81.5%;治疗组在乏力、肢体麻木、腰膝酸软3个证候的改善及稳定率优于对照组(P<0.05或P<0.01),固本抑瘤II号在晚期乳腺癌的治疗中可以发挥增效减毒作用,益气活血解毒中药可能作为化疗增敏剂。
张青等(固本抑瘤II号配合化学药物动脉灌注治疗晚期胰腺癌的临床观察,张青等,中国中西医结合杂志,2007年,第27卷第05期)观察固本抑瘤II号配合化学药物动脉灌注治疗晚期胰腺癌的疗效,针对65例晚期胰腺癌患者,随机分为治疗组(固本抑瘤II号配合化学药物动脉灌注)35例、对照组(化学药物动脉灌注)30例。经2个月治疗,治疗组与对照组临床有效率分别为17.1%、13.3%,临床获益率分别为54.2%、40.0%,两组比较差异有显著性(P<0.05);对晚期胰腺癌的疼痛有效率分别为64.5%、59.2%,组间差异无显著性。固本抑瘤II号有明显的减毒增效作用,其配合化学药物动脉灌注治疗晚期胰腺癌有较好的疗效。
唐武军等(固本抑瘤II号联合MVP方案治疗晚期NSCLC,唐武军等,中国中医药信息杂志,2001年第8卷第07期)观察中药固本抑瘤II号联合MVP方案化疗治疗晚期非小细胞肺癌(NSCLC)的疗效、毒性反应、免疫功能变化及生活质量的改善情况。方法:将90例晚期NSCLC患者随机分为治疗组(A组:MVP方案化疗,同时服用中药固本抑瘤II号)及对照组(B组:MVP方案化疗,不服中药),至少治疗2个周期后评估疗效及不良反应。结果:A、B两组有效率(CR+PR)分别为40.0%和28.6%(P>0.05),稳定率分别为80.0%和52.4%(P<0.05);中位生存期A组29周,B组27周(P>0.05);生存质量的改善A组优于B组(P<0.05);血液学毒性反应、恶心呕吐及发热症状A组明显少于B组(P<0.05);免疫功能及血流变学指标A组优于B组(P<0.05)。固本抑瘤II号联合MVP方案化疗治疗晚期NSCLC能增强机体免疫功能,改善血液高凝状态,减轻化疗毒副反应,改善患者生存质量。
然而,现有技术中尚未有研究发现固本抑瘤II号含药血清具有诱导肿瘤细胞自噬的作用。
发明内容
本发明的目的在于提供固本抑瘤II号含药血清具有诱导肿瘤细胞自噬的新用途,具体说其含药血清可以用于诱导肿瘤细胞II型程序性死亡的新用途,可用于固本抑瘤II号全方或单体及其组合物诱导自噬的新用途,可以用于固本抑瘤II号通过调控自噬抑制肿瘤细胞的新用途,也可以用于研发固本抑瘤II号通过调控自噬抗肿瘤临床药物的新用途。
本发明系统地研究了固本抑瘤II号(下称GY II)及其拆方含药血清诱导人乳腺癌细胞MCF7发生自噬的现象,以在人乳腺癌MCF-7细胞中为例,阐述了固本抑瘤II号及其拆方诱导的自噬各种检测手段,对细胞周期以及细胞凋亡的影响,确定了其不同于现有技术,也未被所属技术领域所发现的新用途。
本实验发现固本抑瘤II号含药血清具有诱导MCF7细胞自噬的作用,MDC及Hoechst 33342双染色在荧光显微镜下显示,活血组、解毒组、鸡血藤组含药血清干预MCF7细胞24h后,MDC染色阳性细胞率明显高于空白血清组,MDC阳性见核周区域呈绿色点状染色。
MAPI-LC-3II染色激光共聚焦结果显示,活血组、解毒组、鸡血藤组含药血清作用于MCF7细胞24h后,LC-3II染色阳性细胞率明显高于空白血清组,阳性细胞可见自噬体绿染,细胞核红染。
MAPI-LC-3II/DNA双参数流式细胞术同步分析细胞自噬与细胞周期结果显示:MCF7细胞中加入含药血清干预后,活血组、解毒组、鸡血藤组含药血清作用于MCF7细胞24h后,LC-3II染色阳性细胞率明显高于空白血清组,其中以活血组、鸡血藤组含药血清诱导自噬作用最强。透射电镜观察可见,活血组和鸡血藤组含药血清干预MCF7细胞24h后,电镜下可见大量空泡状双层膜包绕的自噬体,解毒组亦可见少量自噬体。
GY II全方20%含药血清虽较10%含药血清诱导MCF7细胞凋亡率有明显提高,但是与同浓度正常血清组比较却无明显差异,进一步行AV-PI法检测GY II以及拆方含药血清诱导凋亡结果发现,全方组、益气组、活血组、解毒组、鸡血藤组含药血清诱导MCF7细胞少量早期凋亡(不超过5%)。
基于以上实验,本发明申请人发现:
固本抑瘤II号作为制备调控自噬抗肿瘤药物的应用。
所述调控自噬抗肿瘤药物为诱导肿瘤细胞自噬性死亡药物,生物毒化疗药物增敏的药物,自噬性免疫疗法抗肿瘤药物,和/或诱导自噬缺陷细胞死亡的药物。即,
固本抑瘤II号作为制备诱导肿瘤细胞自噬性死亡药物的应用。
固本抑瘤II号作为制备生物毒化疗药物增敏的药物的应用。
固本抑瘤II号作为制备自噬性免疫疗法抗肿瘤药物的应用。
固本抑瘤II号作为制备诱导自噬缺陷细胞死亡的药物的应用。
所述固本抑瘤II号可以是全方组、益气组、活血组、解毒组或鸡血藤组。
所述全方组由党参、茯苓、白术、生黄芪、女贞子、枸杞子、仙灵脾、活川芎、鸡血藤、莪术、苦参、肿节风和浙贝母组成。
优选的,所述全方组由党参15重量份、茯苓10重量份、白术10重量份、生黄芪30重量份、女贞子15重量份、枸杞子15重量份、仙灵脾10重量份、川芎10重量份、鸡血藤30重量份、莪术10重量份、苦参12重量份、肿节风15重量份和浙贝母15重量份组成。
本发明进一步优选,所述全方组由党参15g、茯苓10g、白术10g、生黄芪30g、女贞子15g、枸杞子15g、仙灵脾10g、川芎10g、鸡血藤30g、莪术10g、苦参12g、肿节风15g和浙贝母15g组成。
所述益气组由党参、茯苓、白术、生黄芪、女贞子、枸杞子和仙灵脾组成。
所述活血组由川芎、鸡血藤和莪术组成。
所述解毒组由苦参、肿节风和浙贝母组成。
所述鸡血藤组为单味药鸡血藤。
所述固本抑瘤II号全方组、益气组、解毒组、活血组或鸡血藤组的各组分的具体选择及具体含量,均是现有技术。其可以采用郁仁存等国家级名老中医的复方,也可以采用现有技术中经过改变、替代或者优化的复方。由于上述复方均是现有技术,所属技术领域的技术人员能够自行获知其配方并能自市场购买得到,例如各期刊均披露有固本抑瘤II号的配方,北京中医医院中药房等地也可以购得固本抑瘤II号药物,因此本发明不再就固本抑瘤II号配方及其具体方案做探讨。
本发明的有益技术效果是,所述的固本抑瘤II号含药血清可用作自噬诱导物,应用于抗肿瘤药物的研发,开拓了固本抑瘤II号的新用途,为通过调控自噬抗肿瘤药物提供了新选择。具体的说,在制备固本抑瘤II号诱导肿瘤细胞自噬性死亡药物中的应用;在制备生物毒化疗药物增敏的药物中的应用;在制备自噬性免疫疗法抗肿瘤药物中的应用;在制备诱导自噬缺陷细胞死亡的药物中的应用。
附图说明
图1是本发明GY II及其拆方含药血清对MCF7细胞MDC及Hoechst 33342双染色影响(×400)图。
其中,1-6分别为空白、全方、益气、活血、解毒、鸡血藤含药血清组。
图2是荧光显微镜下GY II及其拆方含药鼠血清对MCF7细胞MDC染色阳性率观察图。
其中,与空白血清组比较,**P<0.01。
图3是激光共聚焦显微镜下GY II及其拆方含药鼠血清对MCF7细胞LC3II蛋白表达的影响图。
其中,1-6分别为空白、全方、益气、活血、解毒、鸡血藤含药血清组。
具体实施方式
下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了,所述实施例仅仅用于帮助理解本发明,不应视为对本发明的具体限制。
实施例1
固本抑瘤II号由党参、茯苓、生白术、生黄芪、川芎、鸡血藤等13味药组成,均购于北京中医医院中药房。全方组分别加10倍水煎煮45分钟,两次,合并药液,浓缩至生药1.5g/mL。益气组(党参、茯苓、白术、生黄芪、女贞子、枸杞子、仙灵脾)水煎浓缩至生药0.825g/mL,活血组(川芎、鸡血藤、莪术)水煎浓缩至生药0.375g/mL,解毒组(肿节风、苦参、浙贝母)水煎浓缩至生药0.315g/mL,鸡血藤组水煎浓缩至生药0.225g/mL。该工作在北京市中医研究所生药室完成。
将Wistar大鼠随机分为6组,每组10只,2-6组大鼠分别按13mL/kg灌胃给予2-6号水煎剂,空白对照组给予等体积生理盐水灌胃,早晚各一次,连续5次。末次灌胃1h后,2%异戊巴比妥钠(0.2mL/100g)麻醉后腹主动脉取血,室温静置2h,3500r/min离心20min,分离分装血清,经56℃灭火30min,-80℃保存备用。
实施例2
实验动物:健康清洁级雌性Wistar大鼠60只,体质量(211±11)g,由中国中医科学院提供,质量合格证号为SCXK(京)2009-0007。
药物:固本抑瘤II号由党参、茯苓、生白术、生黄芪、女贞子、枸杞子、仙灵脾、川芎、鸡血藤、莪术、肿节风、苦参、浙贝母13味药组成,均购于北京中医医院中药房。
分组:固本抑瘤II号全方组(Q)
益气组(Y)(党参、茯苓、白术、生黄芪、女贞子、枸杞子、仙灵脾)
活血组(H)(川芎、鸡血藤、莪术)
解毒组(J)(肿节风、苦参、浙贝母)
鸡血藤组(D)(单味药鸡血藤)
空白对照组(C)
C组给与正常鼠血清;Q、Y、H、J、D组分别给与固本抑瘤II号、益气组、活血组、解毒组、鸡血藤组中药的含药鼠血清。
MDC及Hoechst 33342双染色荧光显微镜观察:细胞爬片培养24h,各组含药血清作用48h后,甲醇固定,0.1mmol/LMDC染液染色,37℃温育60min;MDC染色45min时加入5μL Hoechst 33342(10μg/mL),继续37℃温育60min。PBS洗细胞,吸去上清,封片,荧光显微镜下观察(激发滤色片365nm、分光镜395nm、吸收滤色片420nm),数码相机拍照,在40倍光镜下,随机选择不重叠的10个视野,计数阳性细胞。MDC阳性见核周区域呈绿色点状染色。
实验结果显示:MDC及Hoechst 33342双染色(图1,图2)荧光显微镜结果显示,活血组、解毒组、鸡血藤组含药血清干预MCF7细胞24h后,MDC染色阳性细胞率明显高于空白血清组(P<0.01)。
实施例3
实验动物、药物及分组见实验2。
①细胞爬片培养24h;②加入各组20%含药血清作用48h;③甲醇固定,0.1mmol/L MDC染液染色,37℃温育60min;④MDC染色45min时加入5μLHoechst 33342(10μg/ml),继续37℃温育60min;⑤PBS洗细胞,吸去上清,封片;⑥荧光显微镜下观察(激发滤色片365nm、分光镜395nm、吸收滤色片420nm),数码相机拍照,在40倍光镜下,随机选择不重叠的10个视野,计数阳性细胞。MDC阳性见核周区域呈绿色点状染色。
结果显示,活血组、解毒组、鸡血藤组含药血清作用于MCF7细胞24h后,LC-3II染色阳性细胞率明显高于空白血清组(图3)。
申请人声明,本发明通过上述实施例来说明本发明的详细技术方案,但本发明并不局限于上述详细技术方案,即不意味着本发明必须依赖上述详细技术方案才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了,对本发明的任何改进,对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等,均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (9)
1.一种固本抑瘤II号作为制备调控自噬抗肿瘤药物的应用。
2.如权利要求1所述的应用,其特征在于,所述调控自噬抗肿瘤药物为诱导肿瘤细胞自噬性死亡药物,生物毒化疗药物增敏的药物,自噬性免疫疗法抗肿瘤药物,和/或诱导自噬缺陷细胞死亡的药物。
3.固本抑瘤II号作为制备诱导肿瘤细胞自噬性死亡药物的应用。
4.固本抑瘤II号作为制备生物毒化疗药物增敏的药物的应用。
5.固本抑瘤II号作为制备自噬性免疫疗法抗肿瘤药物的应用。
6.固本抑瘤II号作为制备诱导自噬缺陷细胞死亡的药物的应用。
7.如权利要求1-6任一项所述的应用,其特征在于,所述固本抑瘤II号可以是全方组、益气组、活血组、解毒组或鸡血藤组。
8.如权利要求7所述的应用,其特征在于,所述全方组由党参15重量份、茯苓10重量份、白术10重量份、生黄芪30重量份、女贞子15重量份、枸杞子15重量份、仙灵脾10重量份、川芎10重量份、鸡血藤30重量份、莪术10重量份、苦参12重量份、肿节风15重量份和浙贝母15重量份组成;
所述益气组由党参、茯苓、白术、生黄芪、女贞子、枸杞子和仙灵脾组成;
所述活血组由川芎、鸡血藤和莪术组成;
所述解毒组由苦参、肿节风和浙贝母组成;
所述鸡血藤组为单味药鸡血藤。
9.如权利要求8所述的应用,其特征在于,所述全方组由党参15g、茯苓10g、白术10g、生黄芪30g、女贞子15g、枸杞子15g、仙灵脾10g、川芎10g、鸡血藤30g、莪术10g、苦参12g、肿节风15g和浙贝母15g组成。
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PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20120718 |