CN111849805A - 一种具有抗宫颈癌作用的乳酸片球菌及应用 - Google Patents

一种具有抗宫颈癌作用的乳酸片球菌及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种具有抗宫颈癌作用的乳酸片球菌，所述乳酸片球菌的名称为HAO2018，分类名称为Pediococcus acidilactici，保藏编号为：CGMCC No.16658，保藏日期：2018年10月30日，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。本发明乳酸片球菌可以抑制宫颈癌HeLa细胞增殖，引起HeLa细胞的凋亡，抑制人乳头瘤病毒HPVE6、E7蛋白的表达，抑制Hela细胞中组蛋白的乙酰化修饰。该菌株有很好的抑制宫颈癌细胞的能，所述的乳酸片球菌用于制备抑制宫颈癌的发酵产物,具有非常广泛的应用前景。

Description

一种具有抗宫颈癌作用的乳酸片球菌及应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，尤其是一种具有抗宫颈癌作用的乳酸片球菌及应用。
背景技术
宫颈癌是世界范围内的第二大女性恶性肿瘤，其发病率仅次于乳腺癌。目前公认的宫颈癌主要致病因素为高危型人乳头瘤病毒(HPV)的感染。高危型HPV编码的癌蛋白E6和E7是主要致癌的因素，其表达受到组蛋白修饰的影响。健康女性的阴道菌群主要有厚壁菌门组成，包括：革兰阳性菌、革兰阴性菌等。在正常条件下，阴道菌群是以乳酸菌为主要优势菌群的动态平衡系统并且构成了抵抗病原体的第一道防线。相对于复杂的胃肠道菌群，阴道菌群的构成比较简单，乳酸菌是其优势菌，通过产生乳酸和乳酸菌素维持阴道酸性环境并抑制致病菌生长。
组蛋白是真核生物的细胞中除了DNA以外构成了染色质的部分，是由H2A、H2B、H3以及H4组成的八聚体，并且带有大量呈正电荷的精氨酸以及赖氨酸，可与带负电荷的DNA双螺旋结构非特异性的结合形成核小体。与DNA甲基化相比,组蛋白的修饰更为广泛和复杂,组蛋白的修饰不仅可以改变染色质的结构和功能，而且也能够调控一些DNA的转录，并且在肿瘤发展中起到调节的作用。
阴道菌群失调与宫颈癌之间存在相关性，但是乳酸菌对宫颈癌的抑制作用及其机制仍不明确，因此，本研究旨在观察乳酸菌的抗宫颈癌作用并对其机制进行探讨。阴道菌群失调与女性生殖系统炎症密切相关，与宫颈癌之间也存在相关性，但是乳酸菌对宫颈癌的抑制作用及其机制仍不明确。
目前已公开的专利或专利申请中，虽已有乳酸乳球菌可以分泌细菌素抑制阴道内相关病原菌，并从多方面发挥阴道微生态环境的维护及益生作用的报道。但其机制各不相同，能够抑制E6、E7表达抗宫颈癌作用的乳杆片球菌尚未见报道。因此，筛选具有抗宫颈癌作用的益生菌具有非常重要的应用价值和现实意义。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种具有抗宫颈癌作用的乳酸片球菌及应用。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种具有抗宫颈癌作用的乳酸片球菌，所述乳酸片球菌的名称为HAO2018，分类名称为Pediococcus acidilactici，保藏编号为：CGMCC No.16658，保藏日期：2018年10月30日，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
而且，所述乳酸片球菌在固体平板上菌落呈白色，圆形，表面光滑湿润，边缘整齐、凸起的菌落，在37℃恒温的条件下，在MRS培养基中培养12h达到对数末期。
而且，所述乳酸片球菌具有胞黏附能力；能够显著抑制HeLa细胞的增殖，并且会引起HeLa细胞的凋亡；能够抑制HeLa细胞HPV18E6/E7的表达水平，且HPV18E6/E7的mRNA和蛋白水平随着处理时间的增加而下调，并且能够抑制HeLa细胞中组蛋白的乙酰化修饰。
而且，所述乳酸片球菌能够抑制宫颈癌Hela细胞的生长并引发凋亡。
如上所述的具有抗宫颈癌作用的乳酸片球菌在制备具有抗宫颈癌作用的药物方面中的应用。
本发明取得的优点和积极效果为：
本发明乳酸片球菌可以抑制宫颈癌HeLa细胞增殖，引起HeLa细胞的凋亡，抑制人乳头瘤病毒HPVE6、E7蛋白的表达，抑制Hela细胞中组蛋白的乙酰化修饰。对于该菌抑制宫颈癌的成分进行初步鉴定，发现是菌体细胞壁的成分而不是分泌到培养基的物质。该菌株的菌体裂解液和热灭活菌都有很好的抑制宫颈癌细胞的能力，所述的乳酸片球菌用于制备抑制宫颈癌的微生态制剂，具有非常广泛的应用前景。
附件说明
图1为本发明中革兰氏染色观察到的菌体形态图；
图2为本发明中乳酸片球菌HAO2018菌体裂解液对宫颈癌细胞增殖的影响图；
图3为本发明中乳酸片球菌HAO2018菌体裂解液对宫颈癌细胞凋亡的影响图；
图4为本发明中乳酸片球菌HAO2018菌体裂解液在RNA水平上对细胞中HPV18E6和E7基因表达的影响图；
图5为本发明中乳酸片球菌HAO2018菌体裂解液在蛋白水平上对细胞中HPV18E6和E7基因表达的影响图；
图6为本发明中乳酸片球菌HAO2018菌体裂解液对组蛋白修饰的影响图；
图7为本发明中乳酸片球菌HAO2018热灭活菌对宫颈癌细胞增殖的影响图；
图8为本发明中乳酸片球菌HAO2018热灭活菌对宫颈癌细胞凋亡的影响图；
图9为本发明中乳酸片球菌HAO2018热灭活菌在RNA水平上对细胞中HPV18E6和E7基因表达的影响图；
图10为本发明中乳酸片球菌HAO2018热灭活菌在蛋白水平上对细胞中HPV18E6和E7基因表达的影响图；
图11为本发明中乳酸片球菌HAO2018热灭活菌对组蛋白修饰的影响图。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明进一步说明，下属实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规市售产品，本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域常规方法，本发明所用各物质质量均为常规使用质量。
一种具有抗宫颈癌作用的乳酸片球菌，所述乳酸片球菌的名称为HAO2018，分类名称为Pediococcus acidilactici，保藏编号为：CGMCC No.16658，保藏日期：2018年10月30日，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
较优地，所述乳酸片球菌在固体平板上菌落呈白色，圆形，表面光滑湿润，边缘整齐、凸起的菌落，在37℃恒温的条件下，在MRS培养基中培养12h达到对数末期。
较优地，所述乳酸片球菌具有胞黏附能力；能够显著抑制HeLa细胞的增殖，并且会引起HeLa细胞的凋亡；能够抑制HeLa细胞HPV18E6/E7的表达水平，且HPV18E6/E7的mRNA和蛋白水平随着处理时间的增加而下调，并且能够抑制HeLa细胞中组蛋白的乙酰化修饰。
较优地，所述乳酸片球菌能够抑制宫颈癌Hela细胞的生长并引发凋亡。
如上所述的具有抗宫颈癌作用的乳酸片球菌能够应用在制备具有抗宫颈癌作用的药物方面中。
具体地，相关制备及检测实施例如下：
实施例1：菌株的筛选与鉴定
(1)菌株的分离与纯化
取酱香型白酒酒醅用无菌的PBS缓冲液稀释后涂布于MRS平板培养基，在厌氧条件下37℃培养48h，挑取分离良好的单菌落进行划线。经多次划线挑取单菌落，纯化后的菌株用革兰氏染色法染色，显微镜下观察菌体形态、分布等特征。该株菌为革兰氏染色阳性的圆形球菌，见图1。
将菌液用无菌生理盐水10倍梯度稀释至10-6，取10-4、10-5、10-6三个梯度的稀释液100μl分别涂布于MRS固体平板上，37℃培养48h，挑选不同形态的菌落进行划线分离，直至得到菌落形态一致的纯的单菌落，挑取单菌落接种于5ml MRS液体培养基中，培养过夜，取600μl菌液加入200μl 60％甘油于-80℃保存。
(2)菌株的鉴定
将分离得到的菌株进行PCR扩增16S rDNA，PCR产物送到金唯智进行测序，将测序结果在NCBI中进行核酸序列比对，得到1株乳酸片球菌，命名为乳酸片球菌HAO2018。
(3)培养
将乳酸片球菌接入MRS固体培养基上于37℃厌氧培养48h后，观察菌落形态呈白色，圆形，表面光滑湿润，边缘整齐、凸起。
实施例2：乳酸片球菌HAO2018菌体裂解液对宫颈癌细胞增殖的影响
(1)在超净台内收集处于对数生长期的宫颈癌细胞，用DMEM高糖培养基对细胞的密度进行调整，吸取100μL的细胞悬液至96孔板内，放入5％CO2，37℃的细胞培养箱培养24h。
(2)过夜培养至细胞完全贴壁；待完全贴壁后，除对照组外，其他各组分别加入等体积且不同浓度梯度样的乳酸片球菌HAO2018裂解液上清，设置3到6个复孔，放入培养箱内分别培养培养24、48、72h。
(3)培养至相应时间之后，吸弃培养基并用PBS清洗2到3次，每孔避光加入10μLMTT，孵育4h后，再加入100μL DMSO，摇床上摇10min,使甲瓒充分的溶解，在490nm处检测吸光度。
结果如图2所示，P.acidilactici HAO2018乳酸片球菌HAO2018菌体裂解液上清可以抑制宫颈癌HeLa细胞的增殖。
实施例3：乳酸片球菌HAO2018菌体裂解液对宫颈癌细胞凋亡的影响
接种1×105个HeLa细胞于96孔板中，培养过夜后，除对照孔之外，每孔按10mg/mL的浓度分别加入100uL乳酸片球菌HAO2018裂解液上清处理细胞，48h后收获细胞，4％多聚甲醛固定30min，TritonX-100的细胞渗透剂，室温孵育15min，加入TUNEL检测液，37℃避光孵育60min，每孔加入100μL的DAPI(1:100)溶液，室温避光孵育5min，然后在共聚焦显微镜下观察、拍照。
结果如图3所示，通过TUNEL染色结果可以看出，乳酸片球菌HAO2018裂解液上清能够引起宫颈癌HeLa细胞DNA断裂，染色阳性的细胞数目明显地增加，意味着HAO2018能够引起宫颈癌HeLa细胞的凋亡。
实施例4：乳酸片球菌HAO2018菌体裂解液在RNA和蛋白水平上对细胞中HPV18E6和E7基因表达的影响
将HeLa细胞接种于6孔板，待贴壁后，除对照孔之外，每孔按10mg/mL的浓度分别加入100uL乳酸片球菌HAO2018裂解液上清进行处理，收集处理好的细胞，分别提取其蛋白和mRNA。蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳，之后转移至NC膜上，封入一抗、二抗，用Ody ssey远红外成像仪进行扫膜；mRNA按照表1的反应体系进行实时定量PCR分析。
表1实时定量PCR所需反应体系
Figure BDA0002543326090000051
PCR引物序列：HPV18-E6和HPV18-E7为检测的目的基因，18S rRNA
为内参基因。
Figure BDA0002543326090000052
结果如图4、5所示，乳酸片球菌HAO2018菌体裂解液上清在10mg/mL的浓度能够明显抑制HPV18E6和E7基因的表达，上述结果提示，这株乳酸菌细胞中存在抑制HPV18E6和E7基因表达的成分。
实施例5：乳酸片球菌HAO2018菌体裂解液对组蛋白修饰的影响
将HeLa细胞接种于6孔板，待贴壁后，除对照孔之外，每孔按10mg/mL的浓度分别加入100uL乳酸片球菌HAO2018裂解液上清进行处理，收集处理好的细胞，用蛋白裂解液裂解细胞，使用刮刀收集蛋白样品。收集到的蛋白样品进行SDS-PAGE凝胶电泳，转移至NC膜上，封入一抗、二抗，用Oddysey远红外成像仪进行扫膜。
结果如图6所示，乳酸片球菌HAO2018裂解液显著抑制HeLa细胞中组蛋白H3K9的乙酰化修饰，而对组蛋白H3总量则无明显影响，提示乳酸片球菌HAO2018可以选择性抑制宫颈癌细胞中组蛋白的乙酰化修饰。
实施例6：乳酸片球菌HAO2018热灭活菌的制备
根据实验所做生长曲线，将乳酸片球菌按1％接菌量加入MRS液体培养基中于37℃厌氧培养至平台期，收集菌液至1.5mL EP管中，离心(12000rpm，2min)，吸弃上清液，保留菌体，然后用PBS清洗1-2次。根据实验结果得出：100℃，30min水浴可使菌体灭活。从而得到热灭活菌。
实施例7：乳酸片球菌HAO2018热灭活菌对宫颈癌细胞增殖的影响
(1)在超净台内收集处于对数生长期的宫颈癌细胞，用DMEM高糖培养基对细胞的密度进行调整，吸取100μL的细胞悬液至96孔板内，放入5％CO2，37℃的细胞培养箱培养24h。
(2)过夜培养至细胞完全贴壁；待完全贴壁后，除对照组外，其他各组分别加入等体积且不同浓度梯度样的乳酸片球菌HAO2018热灭活菌，设置3到6个复孔，放入培养箱内分别培养培养24、48、72h。
(3)培养至相应时间之后，吸弃培养基并用PBS清洗2到3次，每孔避光加入10μLMTT，孵育4h后，再加入100μL DMSO，摇床上摇10min,使甲瓒充分的溶解，在490nm处检测吸光度。
结果如图7所示，P.acidilactici HAO2018乳酸片球菌HAO2018热灭活菌可以抑制宫颈癌HeLa细胞的增殖。
实施例8：乳酸片球菌HAO2018热灭活菌对宫颈癌细胞凋亡的影响
接种1×105个HeLa细胞于96孔板中，培养过夜后，除对照孔之外，每孔按10mg/mL的浓度分别加入100uL乳酸片球菌HAO2018裂解液上清进行处理，48h后收获细胞，4％多聚甲醛固定30min，TritonX-100的细胞渗透剂，室温孵育15min，加入TUNEL检测液，37℃避光孵育60min，每孔加入100μL的DAPI(1:100)溶液，室温避光孵育5min，然后在共聚焦显微镜下观察、拍照。
结果如图8所示，通过TUNEL染色结果可以看出，乳酸片球菌HAO2018热灭活菌能够引起宫颈癌HeLa细胞DNA断裂，染色阳性的细胞数目明显地增加，意味着HAO2018能够引起宫颈癌HeLa细胞的凋亡。
实施例9：乳酸片球菌HAO2018热灭活菌在RNA和蛋白水平上对细胞中HPV18E6和E7基因表达的影响
将HeLa细胞接种于6孔板，待贴壁后，除对照孔之外，每孔按10mg/mL的浓度分别加入100uL乳酸片球菌HAO2018裂解液上清进行处理，收集处理好的细胞，分别提取其蛋白和mRNA。蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳，之后转移至NC膜上，封入一抗、二抗，用Ody ssey远红外成像仪进行扫膜；mRNA按照表1的反应体系进行实时定量PCR分析。
结果如图9、10所示，乳酸片球菌HAO2018热灭活菌能够明显抑制HPV18E6和E7基因的表达，上述结果提示，这株乳酸菌细胞表面存在抑制HPV18E6和E7基因表达的成分。
实施例10：乳酸片球菌HAO2018热灭活菌对组蛋白修饰的影响
将HeLa细胞接种于6孔板，待贴壁后，除对照孔之外，每孔按10mg/mL的浓度分别加入100uL乳酸片球菌HAO2018裂解液上清进行处理，收集处理好的细胞，用蛋白裂解液裂解细胞，使用刮刀收集蛋白样品。收集到的蛋白样品进行SDS-PAGE凝胶电泳，转移至NC膜上，封入一抗、二抗，用Oddysey远红外成像仪进行扫膜。
结果如图11所示，乳酸片球菌HAO2018热灭活菌显著抑制HeLa细胞中组蛋白H3K9的乙酰化修饰，而对组蛋白H3总量则无明显影响，提示乳酸片球菌HAO2018可以选择性抑制宫颈癌细胞中组蛋白的乙酰化修饰。
尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。
序列表
<110> 天津科技大学
<120> 一种具有抗宫颈癌作用的乳酸片球菌及应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> HPV18-E6-F(Unknown)
<400> 1
ccagaaaccg ttgaatccag 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> HPV18-E6-R(Unknown)
<400> 2
gttggagtcg ttcctgtcgt 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> HPV18-E7-F(Unknown)
<400> 3
tgaaattccg gttgaccttc 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> HPV18-E7-R(Unknown)
<400> 4
tcgggctggt aaatgttgat 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 18S rRNA-F(Unknown)
<400> 5
cacgggaaac ctcacccggg 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 18S rRNA-R(Unknown)
<400> 6
cgggtggctg aacgccactt 20

Claims (5)

1.一种具有抗宫颈癌作用的乳酸片球菌，其特征在于：所述乳酸片球菌的名称为HAO2018，分类名称为Pediococcus acidilactici，保藏编号为：CGMCC No.16658，保藏日期：2018年10月30日，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
2.根据权利要求1所述的具有抗宫颈癌作用的乳酸片球菌，其特征在于：所述乳酸片球菌在固体平板上菌落呈白色，圆形，表面光滑湿润，边缘整齐、凸起的菌落，在37℃恒温的条件下，在MRS培养基中培养12h达到对数末期。
3.根据权利要求1所述的具有抗宫颈癌作用的乳酸片球菌，其特征在于：所述乳酸片球菌具有胞黏附能力；能够显著抑制HeLa细胞的增殖，并且会引起HeLa细胞的凋亡；能够抑制HeLa细胞HPV18E6/E7的表达水平，且HPV18E6/E7的mRNA和蛋白水平随着处理时间的增加而下调，并且能够抑制HeLa细胞中组蛋白的乙酰化修饰。
4.根据权利要求1所述的具有抗宫颈癌作用的乳酸片球菌，其特征在于：所述乳酸片球菌能够抑制宫颈癌Hela细胞的生长并引发凋亡。
5.如权利要求1所述的具有抗宫颈癌作用的乳酸片球菌在制备具有抗宫颈癌作用的药物方面中的应用。
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