CN112501064B - 一株嗜热链球菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株嗜热链球菌及其应用，本申请从农家自制酸奶筛选出一株嗜热链球菌，该菌具有极强减轻炎症反应的能力，无质粒和转移元件等风险基因；对于LPS引起的巨噬细胞炎症反应具有较强的抑制能力；对于CLP和LPS构建的脓毒症模型引起的脏器损伤具有较强的保护能力，可以减轻脓毒症患者炎症反应，有助于开发减轻脓毒症相关症状的药物。

Description

一株嗜热链球菌及其应用

技术领域

本发明涉及一株嗜热链球菌及其应用，属于细菌及其培育领域。

背景技术

脓毒症及其相关疾病是造成人类死亡的主要原因之一，是一种由宿主对感染的反应失调引起的，常伴有急性器官功能障碍和高死亡风险，炎症反应爆发是其发病机制之一，而多项研究表明炎症反应和肠道菌群密切相关，同时多项研究证明益生菌可以通过影响肠道菌群组成进而改善炎症反应，达到治疗炎性疾病的目的。同时脓毒症患者常常由于进食困难而导致营养不良从而造成其他系统性疾病。

目前针对脓毒症患者的治疗主要集中在服用多种抗生素等药物治疗上。抗生素药物治疗存在很多问题：第一，抗生素在杀死病原菌，消除炎症的同时也抑制了益生菌的生长，降低了益生菌的丰度，非常不利于脓毒症患者肠道菌群维持稳态，大大增加了重复感染和复发的风险；第二，服用药物不能达到精准治疗的目的，只能广谱性的全身范围内作用，尤其容易损伤肝肾功能，这对于脓毒症患者本身已损害的肝肾功能无疑更是一种负担；第三，经常使用抗生素容易导致病原菌产生耐药性，这也是造成二次感染的重要原因，同时由于耐药性造成大量脓毒症患者没有合适的抗生素使用，进而导致炎症反应加剧，进而引起全身性的炎症反应。

发明内容

本发明克服了上述现有技术的不足，提供一株嗜热链球菌及其应用，本申请从农家自制酸奶筛选出一株嗜热链球菌，该菌具有极强减轻炎症反应的能力，可以减轻脓毒症患者炎症反应。

一种嗜热链球菌，所述嗜热链球菌命名为嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)19 菌株，保藏单位为广东省微生物菌种保藏中心，保藏时间为2020年11月26日，保藏号为GDMCC No:61312，地址为中国广州市先烈中路100号省微生物所实验楼五楼。

进一步的，上述的嗜热链球菌在抑制炎性因子表达方面的应用。

进一步的，上述应用中所述嗜热链球菌的浓度为10⁷cfu/mL。

进一步的，上述的嗜热链球菌在减轻炎症反应方面的应用。

进一步的，上述的嗜热链球菌在制备治疗脓毒症和/或缓解脓毒症症状的药物方面的应用。

有益效果：

本发明选用的嗜热链球菌Streptococcus thermophilus 19，经研究发现其有极强的减轻炎症反应的能力；无质粒和转移元件等风险基因；对于LPS引起的巨噬细胞炎症反应具有较强的抑制能力；对于CLP和LPS构建的脓毒症模型引起的脏器损伤具有较强的保护能力，可用于减轻脓毒症等急重症患者的炎症反应，开发减轻脓毒症的药物。

附图说明

图1嗜热链球菌19对LPS诱导的RAW264.7炎性反应的影响。

图2嗜热链球菌19对RAW264.7细胞活力的影响。

图3嗜热链球菌19对LPS诱导的脓毒症小鼠小肠和肺保护的影响。

图4嗜热链球菌19对LPS诱导的脓毒症小鼠肝和肾保护的影响。

图5嗜热链球菌19对LPS诱导的脓毒症小鼠脏器保护的影响。

图6嗜热链球菌19对LPS诱导的脓毒症小鼠生存率的影响。

图7嗜热链球菌19对LPS诱导的脓毒症小鼠血清炎症因子的影响。

图8嗜热链球菌19对LPS诱导的脓毒症小鼠体重的影响。

具体实施方式

为了使本技术领域人员更好地理解本申请中的技术方案，下面结合实施例对本发明作进一步说明，所描述的实施例仅是本申请一部分实施例，而不是全部，本发明不受下述实施例的限制。

实施例1

样品采集

分离样品来自于农家自制酸奶，将酸奶采集至无菌的样品管中，于放有冰袋的隔热箱中保藏，2h内带回实验室进行分选。

2、分离纯化

取0.2g收集的新鲜样品于1ml无菌的PBS(磷酸缓冲液)中，充分震荡混匀，然后进行梯度稀释涂布，培养基采用MRS和M17培养基(购自索莱宝生物科技公司)。涂布的平板置于37℃培养箱中培养。培养3天后，挑取单菌落进行划线分纯，获得每株的单菌，然后进行纯培养。

3、菌种保藏

对获得的纯培养菌株进行培养，至浓度约为10⁹cfu/ml，取400ul菌液添加40％甘油400ul，使其甘油浓度达到20％，然后进行-80℃超低温保藏。

按照如下操作步骤制作菌株真空冻干粉，并保藏至广东省微生物菌种保藏中心GDMCC No:61312。

将安瓿管和保护剂经高压灭菌待用，对过夜培养的菌液进行划线，37℃培养24h，观察未发现杂菌污染后进行冻干。菌液经离心收集并用灭菌生理盐水洗涤，加入2～3ml脱脂牛奶保护剂，悬浮制成菌数为10⁸～10¹⁰个/ml菌悬液，并分装在无菌安瓿管中，置于-80℃冰箱中预冻1～2小时。按照《冷冻干燥机标准操作规程》，在冷冻干燥机中进行冷冻干燥8-20h，直至冻干为止。冻干后取出样品安瓿管，按照《真空安瓿熔封机标准操作规程》，将安瓿管颈部棉塞以下处用强火焰拉细进行熔封。

4、菌种的菌学特征

该菌在MRS固体培养基平板中培养48小时，菌落呈圆形，边缘光滑整齐，米白色，菌落直径约0.5-1.5mm。在1000倍的显微镜下观察，菌体呈现卵圆形，并以2球-6球不等连接，革兰氏染色为阳性，没有芽孢和鞭毛产生。

5、16S rDNA鉴定

将获得的分离菌株在液体MRS培养基中培养24h，取1ml菌液进行10000r/min离心5ml，收集菌体，提取基因组DNA。以基因组DNA作为模板，使用16S rDNA通用引物进行PCR扩增， 16s序列如SEQ ID NO.1所示，扩增体系为：10×PCR buffer，3uL；dNTP，2.5uL；27F，0.5uL； 1492R，0.5uL；Taq酶，0.3uL；模板，1uL；ddH2O，18.2uL。PCR扩增条件为：95℃预变性4min，然后95℃变性30s，57℃退火40s，72℃延伸1min30s，30个循环。将获得的16S rDNA扩增产物进行电泳检测、纯化、3730测序，获得长度为1400bp的16S rDNA序列。将这段序列在genebank中进行blast比对分析，获得19的鉴定结果为嗜热链球菌。

6、嗜热链球菌Streptococcus thermophilus 19的抗炎能力

嗜热链球菌Streptococcus thermophilus 19的抗炎能力主要考察其在体内和体外实验中的抗炎能力。

1)嗜热链球菌Streptococcus thermophilus 19体外抗炎能力测定

细菌培养及处理

将菌株Streptococcus thermophilus 19接种至MRS培养基中，于37℃培养24小时，取5ml 菌液进行1000r/min离心5min,弃上清，无菌PBS重悬，再进行离心，重复三次，最后拿无菌 PBS重悬菌液，并使用无菌PBS调整其OD值为0.3左右。

RAW264.7巨噬细胞系培养及处理

将RAW264.7细胞系接种到DMEM低糖培养基中，培养24小时后，拿细胞刮轻轻刮下细胞，1000r/min，离心5min，弃上清，用不含血清和双抗的DMEM低糖培养基重悬细胞并计数。然后分配到12孔板中。

嗜热链球菌Streptococcus thermophilus 19处理RAW264.7细胞

向上述12孔板中分别加入LPS和30微升嗜热链球菌19菌液，使细菌和细胞的MOI为100：1；分别设置对照组(二者都不加)，LPS刺激对照组(单独加入LPS)，Streptococcusthermophilus 19刺激组(单独加入Streptococcus thermophilus 19组)，Streptococcusthermophilus 19+LPS共刺激组(Streptococcus thermophilus 19和LPS组)，轻轻晃动12孔板，使其充分混匀。放置于5％CO₂细胞培养箱中培养6小时。培养6小时后，弃上清，PBS清洗3次，然后加入1ml Trziol裂解液，按照常规RNA提取方法提取细胞总RNA并反转录成cDNA。应用定量PCR的方法检测炎症因子的表达情况。结果如图1所示，嗜热链球菌19和LPS组相比于仅进行LPS刺激的实验组其TNF-α、IL-1β、IL-6均显著降低，可以有效抑制炎性因子表达，缓解炎性反应。

嗜热链球菌19对细胞活力的测定

RAW264.7细胞接种到96孔板中，分别加入不同浓度的嗜热链球菌19刺激6小时，CCK8 测定细胞活力。结果见图2，在使用浓度为10⁷cfu/mL的嗜热链球菌19的实验组的细胞活力最佳，最佳使用浓度为10⁷cfu/mL。

2)嗜热链球菌Streptococcus thermophilus19体内抗炎能力测定

脓毒症小鼠模型构建

采取体重为21g左右的小鼠，采用LPS诱导脓毒症模型的方法构建脓毒症小鼠模型，模型构建成功后通过灌胃的方式给予小鼠嗜热链球菌19处理。本部分主要测定小鼠生存率，小鼠体重变化，各脏器炎性因子的表达情况，血清中IL-β和TNF-α。

实验结果见图3-8。图3-5中嗜热链球菌19和LPS组对脓毒症小鼠的小肠、肝脏、肺、肾脏的炎症反应有明显的减缓效果。图6中使用LPS的实验组和使用嗜热链球菌19和LPS 组虽然小鼠生存率均有下降，但是使用嗜热链球菌19和LPS组的脓毒症小鼠生存率要高于LPS实验组，使用嗜热链球菌19可以减缓脓毒症小鼠死亡情况。图7中嗜热链球菌19和LPS组相比使用LPS的实验组血清炎症因子IL-1β和TNF-α明显下降。图8中使用LPS的实验组和单独使用嗜热链球菌19的实验组体重均有所下降，使用嗜热链球菌19和LPS的实验组体重基本下降趋势不明显，没有体重下降情况。

SEQUENCE LISTING

<110> 张笑薇

<120> 一株嗜热链球菌及其应用

<130> 2020

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1403

<212> DNA

<213> 序列

<400> 1

atacgcttgc cagcgtgcat atactgacag tagaacgctg aagagaggag cttgctcttc 60

ttggatgagt tgcgaacggg tgagtaacgc gtaggtaacc tgccttgtag cgggggataa 120

ctattggaaa cgatagctaa taccgcataa caatggatga cacatgtcat ttatttgaaa 180

ggggcaattg ctccactaca agatggacct gcgttgtatt agctagtagg tgaggtaatg 240

gctcacctag gcgacgatac atagccgacc tgagagggtg atcggccaca ctgggactga 300

gacacggccc agactcctac gggaggcagc agtagggaat cttcggcaat gggggcaacc 360

ctgaccgagc aacgccgcgt gagtgaagaa ggttttcgga tcgtaaagct ctgttgtaag 420

tcaagaacgg gtgtgagagt ggaaagttca cactgtgacg gtagcttacc agaaagggac 480

ggctaactac gtgccagcag ccgcggtaat acgtaggtcc cgagcgttgt ccggatttat 540

tgggcgtaaa gcgagcgcag gcggtttgat aagtctgaag ttaaaggctg tggctcaacc 600

atagttcgct ttggaaactg tcaaacttga gtgcagaagg ggagagtgga attccatgtg 660

tagcggtgaa atgcgtagat atatggagga acaccggtgg cgaaagcggc tctctggtct 720

gtaactgacg ctgaggctcg aaagcgtggg gagcgaacag gattagatac cctggtagtc 780

cacgccgtaa acgatgagtg ctaggtgttg gatcctttcc gggattcagt gccgcagcta 840

acgcattaag cactccgcct ggggagtacg accgcaaggt tgaaactcaa aggaattgac 900

gggggcccgc acaagcggtg gagcatgtgg tttaattcga agcaacgcga agaaccttac 960

caggtcttga catcccgatg ctatttctag agatagaaag ttacttcggt acatcggtga 1020

caggtggtgc atggttgtcg tcagctcgtg tcgtgagatg ttgggttaag tcccgcaacg 1080

agcgcaaccc ctattgttag ttgccatcat tcagttgggc actctagcga gactgccggt 1140

aataaaccgg aggaaggtgg ggatgacgtc aaatcatcat gccccttatg acctgggcta 1200

cacacgtgct acaatggttg gtacaacgag ttgcgagtcg gtgacggcga gctaatctct 1260

taaagccaat ctcagttcgg attgtaggct gcaactcgcc tacatgaagt cggaatcgct 1320

agtaatcgcg gatcagcacg ccgcggtgaa tacgttcccg ggccttgtac acaccgcccg 1380

tcacaccacg agagtttgta aca 1403

Claims (4)

1.一种嗜热链球菌，其特征在于，所述嗜热链球菌命名为嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）19菌株，保藏号为GDMCC No: 61312。

2.如权利要求1所述的嗜热链球菌在制备抑制炎性因子表达的药物方面的应用，所述炎性因子为：TNF-α、IL-1β和IL-6。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述嗜热链球菌的浓度为10⁷cfu/mL。

4.如权利要求1所述的嗜热链球菌在制备治疗脓毒症的药物方面的应用。