CN113336810B - 一种高生物利用度的续断皂苷vi的提取纯化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种高生物利用度的续断皂苷VI的提取纯化方法，取续断药材通过乙醇提取，提取液减压回收溶剂，加入NaCl溶液溶解，加入乳化剂并保持温度搅拌析出沉淀，沉淀过滤，得到的沉淀用乙醇溶解，回收溶剂，再用NaCl溶液溶解，加入乳化剂，保持温度搅拌析出沉淀，沉淀过滤，得到的沉淀用NaCl溶液溶解，加入乳化剂，保持温度搅拌析出沉淀，过滤沉淀，干燥即得高纯度续断皂苷VI。本发明的原料来源丰富、价廉，整个制备过程中避免了有毒试剂的使用，安全低毒，制备工艺简单，分离纯化效率高，大大提高了产物的纯度和产率，且得到续断皂苷VI生物利用度高，成药性好，适于工业化生产，容易推广应用。

Description

一种高生物利用度的续断皂苷VI的提取纯化方法
技术领域
本发明属中医药领域，具体涉及一种高生物利用度的续断皂苷VI的提 取纯化方法。
背景技术
续断为川续断科植物川续断Dipsacus asperoides.Y.Cheng et T.M.Ai 的干燥根。始载于《神农本草经》，列为上品，记载其“味苦，微温，主 伤寒，补不足，金疮，痈疡，折跌，续筋骨，妇人乳难。久服，益气力。 一名龙豆，一名属折。”李时珍谓“续断、属折、接骨，皆以功命名也。” 从其命名可见续断自古就为骨伤科要药。今药典记载：“味苦、辛，微温。 归肝、肾经。补肝肾，强筋骨，续折伤，止崩漏。用于腰膝酸软，风湿痹 痛，崩漏，胎漏，跌扑损伤。酒续断多用于风湿痹痛，跌扑损伤”。足见 续断自古为骨科疾病的有效治疗药物。
近代研究表明续断中主要化学成分有：皂苷类、环烯醚萜类、生物碱、 挥发油等成分。本发明人对湖北或四川产的多批续断进量总皂苷的测定含 量可达10.0％～16.0％，其中以川续断皂苷VI含量为主，2005年版中国药典 规定川续断药材中川续断皂苷VI含量不少于2.0％。川续断皂苷VI又称木 通皂苷D，不仅存在于续断药材中，木通、预知子、山银花中也存在，其中 木通中含量也较高。至今虽从续断药材中分得20多种皂苷成分，但未见适用于工业化生产的高纯度川续断皂苷VI的制备方法报道，也未有人对高纯 度川续断皂苷VI在骨科疾病应用方面报道。续断药材在传统医学中常用于 腰膝酸痛、风湿痹痛、跌打损伤及安胎，现代药理学研究表明续断有促进 骨损伤愈合、抗骨质疏松、抗衰老、抗菌、抗炎镇痛、免疫调节等作用。 川续断皂苷VI作为续断药才中有效成分的代表成分之一，通过适宜的工艺 制备高纯度的川续断皂苷VI，达至国际一类新药的要求，将有望成为一个 国内外创新药物。
与本发明最接近的专利为：一种续断皂苷VI的提取纯化工艺，重庆市 中药研究院，200910104726.9，公开了一种续断皂苷VI的提取纯化工艺, 技术方案是:将川续断药材粗粉通过粗提取工艺(4-16倍5％-95％乙醇提取， 合并滤液，回收乙醇至无醇味)提取得到续断总皂苷；将续断总皂苷加水溶 解,(加水至每毫升含0.5-5g续断药材)，用0.5％-5％碱液(氢氧化钠、氢 氧化钾、碳酸氢钠、碳酸钠)调节pH为8-13，用水饱和正丁醇萃取，正丁 醇层用正丁醇饱和过的水层反萃取1次，合并正丁醇层回收至干，得到续 断总皂苷。续断总皂苷加水溶解，通过降温或降低溶剂极性(四氯甲烷、 三氯甲烷、二氯甲烷、乙酸乙酯)至续断皂苷VI充分沉淀,过滤或离心得 到沉淀,重复上述操作1～3次得到续断皂苷VI单体。
以上提取纯化工艺相对复杂，实用的试剂包括强腐蚀性试剂，生产步 骤较多，在工业生产中成本较大，中药提取的过程中，步骤越多，需要控 制的技术点就多越多，提取率相对就越低。且经对比，我们的生物利用度 更高，成药性更好。
发明内容
本发明提供一种高生物利用度的续断皂苷VI的提取纯化方法，包括如 下步骤：
步骤一、药材提取：称取续断药材，加入提取溶剂，加入量为药材重 量的3倍至5倍；30℃-82℃条件下，搅拌提取两次，过滤，滤液合并，浓 缩至无醇味，得提取物；
步骤二、提取液粗分：提取物用5％-25％浓度的NaCl溶液溶解，在低于 80℃条件下完全溶解，冷却至常温，药液过滤，药液中加入药液量1％-20％ 体积量的乳化剂，维持药液温度5℃-45℃，搅拌生成沉淀，过滤，滤渣用 乙醇溶解，过滤，滤液浓缩至干膏；
步骤三、第一次精制：干膏用5％-25％浓度的NaCl溶液溶解，NaCl溶 液的量为干膏重量的6-30倍，在低于80℃条件下完全溶解，冷却至常温， 药液过滤，药液中加入药液体积的1％-50％量的乳化剂，维持药液温度5℃ -45℃搅拌生产沉淀，过滤，得到第一次精制品；
步骤四、第二次精制：第一次精制品用5％-25％浓度的NaCl溶液溶解， NaCl溶液的量为第一次精制品量的8-30倍，在低于80℃条件下完全溶解， 冷却至常温，药液过滤，药液中加入药液体积的1％-50％的乙酸乙酯，维持 药液温度5℃-45℃搅拌生产沉淀，过滤，在70℃温度以下干燥即得高纯度 续断皂苷VI。
优选地，步骤一中，所述的加入的提取溶剂为95％乙醇-乙酸乙酯混溶 剂，其混合比例为95％乙醇：乙酸乙酯＝1:9-9:1，加入的溶剂量为药材的 3-5倍量，提取温度为30℃-82℃包括回流提取。
优选地，步骤二中，所述的NaCl溶液浓度为5％-25％，样品溶解温度低 于80℃，药液过滤可以使用离心过滤或滤纸过滤或抽滤，实用的乳化剂包 括石油醚，正己烷，乙酸乙酯，乙醚，析出沉淀温度范围5℃-45℃，析出 沉淀过滤可以使用离心机过滤或低压滤纸抽滤，滤渣用乙醇溶解时乙醇浓 度范围是10％-99％。
优选地，步骤三中，所述的溶解样品NaCl溶液浓度为5％-25％，NaCl 溶液体积为干膏重量的6-30倍，样品溶解温度低于80℃，药液过滤时可使 用离心分离或滤纸过滤，加入的乳化剂包括乙酸乙酯，正己烷，石油醚， 乙醚，析沉温度范围是5℃-45℃，沉淀过滤时可使用离心分离或滤纸过滤。
优选地，步骤四中，所述的溶解样品NaCl溶液浓度为5％-25％，NaCl 溶液体积为干第一次精制品量的8-30倍，样品溶解温度低于80℃，药液过 滤时可使用离心分离或滤纸过滤，加入的乳化剂包括乙酸乙酯，正己烷， 石油醚，乙醚，析沉温度范围是5℃-45℃，沉淀过滤时可使用离心分离或 滤纸过滤。
本方法得到的续断皂苷VI含量大于98％。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
1、本发明不需要使用氢氧化钠等强碱试剂来调PH，可以避免使用强腐 蚀性的强碱试剂，不需要使用正丁醇来反复提取与浓缩；
2、本发明是使用提取液直接析出沉淀，避免了调PH，浓缩等复杂操作 过程，而且避免了使用强碱试剂以及味道不好的正丁醇；
3、本发明析出沉淀时是盐析作用和降低极性作用共同起作用产生沉淀 和单一的降低极性产生沉淀作用机理不一样，析沉温度也和单一降低极性 析沉温度有很大差异，本发明在析沉温度范围内温度越高析沉效果越好， 和单一降低极性方法中析沉温度越低效果越好的作用机理比较本发明的析 沉作用机理是不一样的。
4、本发明工艺总收率高可达50％以上，本发明避免使用强碱试剂大幅 降低了续断皂苷VI在碱性溶液中的破坏，提高了工艺总收率，降低了工艺 成本；
附图说明
图1：空白犬血浆图谱
图2：定量下限对照样品图谱
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施 例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例 仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1：
称取药材0.5kg加入95％EtOH 2L，在50℃下搅拌提取2h，提取液抽滤， 药液备用，药渣用95％EtOH，2L，搅拌提取2h，提取液抽滤，药渣去掉， 两次提取液混合，在70℃下浓缩，得到样品干膏0.133kg，此干膏用纯化 水2L，在70℃搅拌溶解，用自来水冷却至室温，药液离心分离 4000rpm,10min，加入NaCl 100g，石油醚300ml，在35℃下用磁力搅拌器 搅拌生成沉淀24h，沉淀抽滤，用5％NaCl溶液400ml，纯化水400ml依次 洗涤，样品真空干燥(70℃，-0.1MPa)得到26.4g，样品中加入60ml 95％ 乙醇在70℃水浴中搅拌溶解，溶解完后在70℃水浴中浓干，加入260ml纯 化水在70℃水浴中搅拌溶解，用自来水冷却至室温，离心分离4000rpm， 10min，上清液加入40ml乙酸乙酯，在35℃水浴中用磁力搅拌器搅拌生成 沉淀24h，药液抽滤，沉淀分别用130ml纯化水，50ml乙酸乙酯洗涤，沉 淀中加入130ml乙酸乙酯，用磁力搅拌器搅拌15分钟，抽滤，沉淀真空干 燥(70℃，-0.1MPa)得到19.9g，样品中加入200ml纯化水在70℃水浴中 搅拌溶解，用自来水冷却至室温，离心分离4000rpm，10min样品溶液，药 液中加入27ml乙酸乙酯在35℃水浴中用磁力搅拌器搅拌生成沉淀24h，药 液抽滤，沉淀用90ml纯化水，50ml乙酸乙酯洗涤，沉淀中加入100ml乙酸 乙酯，用磁力搅拌器搅拌15分钟，抽滤，沉淀真空干燥(70℃，-0.1MPa) 得到14.9g续断皂苷VI。
5、本发明得到的续断皂苷VI溶解性好，生物利用度高，因此成药性 更好。
实施例2
称取药材0.5kg加入95％EtOH 2L，在50℃下搅拌提取2h，提取液抽滤， 药液备用，药渣用95％EtOH，2L，搅拌提取2h，提取液抽滤，药渣去掉， 两次提取液混合，在70℃下浓缩，得到样品干膏0.136kg，此干膏用纯化 水2L，在70℃搅拌溶解，用自来水冷却至室温，药液离心分离 4000rpm,10min，加入NaCl 100g，正己烷300ml，在35℃下用磁力搅拌器 搅拌生成沉淀24h，沉淀抽滤，用5％NaCl溶液400ml，纯化水400ml依次 洗涤，样品真空干燥(70℃，-0.1MPa)得到25.9g，样品中加入60ml 95％ 乙醇在70℃水浴中搅拌溶解，溶解完后在70℃水浴中浓干，加入260ml纯 化水在70℃水浴中搅拌溶解，用自来水冷却至室温，离心分离4000rpm， 10min，上清液加入40ml乙酸乙酯，在35℃水浴中用磁力搅拌器搅拌生成 沉淀24h，药液抽滤，沉淀分别用130ml纯化水，50ml乙酸乙酯洗涤，沉 淀中加入130ml乙酸乙酯，用磁力搅拌器搅拌15分钟，抽滤，沉淀真空干 燥(70℃，-0.1MPa)得到20.8g，样品中加入200ml纯化水在70℃水浴中 搅拌溶解，用自来水冷却至室温，离心分离4000rpm，10min样品溶液，药 液中加入27ml乙酸乙酯在35℃水浴中用磁力搅拌器搅拌生成沉淀24h，药 液抽滤，沉淀用90ml纯化水，50ml乙酸乙酯洗涤，沉淀中加入100ml乙酸 乙酯，用磁力搅拌器搅拌15分钟，抽滤，沉淀真空干燥(70℃，-0.1MPa) 得到15.1g续断皂苷VI。
实施例3
称取药材0.5kg加入95％EtOH：乙酸乙酯＝8:2 2L，在50℃下搅拌提取 2h，提取液抽滤，药液备用，药渣用95％EtOH：乙酸乙酯＝8:2，2L，搅拌提 取2h，提取液抽滤，药渣去掉，两次提取液混合，在70℃下浓缩，得到样 品干膏0.137kg，此干膏用纯化水2L，在70℃搅拌溶解，用自来水冷却至 室温，药液离心分离4000rpm,10min，加入NaCl 100g，石油醚300ml，在 35℃下用磁力搅拌器搅拌生成沉淀24h，沉淀抽滤，用5％NaCl溶液400ml， 纯化水400ml依次洗涤，样品真空干燥(70℃，-0.1MPa)得到28.0g，样 品中加入60ml 95％乙醇在70℃水浴中搅拌溶解，溶解完后在70℃水浴中浓 干，加入280ml纯化水在70℃水浴中搅拌溶解，用自来水冷却至室温，离 心分离4000rpm，10min，上清液加入40ml乙酸乙酯，在35℃水浴中用磁 力搅拌器搅拌生成沉淀24h，药液抽滤，沉淀分别用130ml纯化水，50ml 乙酸乙酯洗涤，沉淀中加入130ml乙酸乙酯，用磁力搅拌器搅拌15分钟， 抽滤，沉淀真空干燥(70℃，-0.1MPa)得到20.5g，样品中加入200ml纯 化水在70℃水浴中搅拌溶解，用自来水冷却至室温，离心分离4000rpm，10min样品溶液，药液中加入27ml乙酸乙酯在35℃水浴中用磁力搅拌器搅 拌生成沉淀24h，药液抽滤，沉淀用90ml纯化水，50ml乙酸乙酯洗涤，沉 淀中加入100ml乙酸乙酯，用磁力搅拌器搅拌15分钟，抽滤，沉淀真空干 燥(70℃，-0.1MPa)得到15.1g续断皂苷VI
实施例4
称取药材0.5kg加入95％EtOH 2L，在50℃下搅拌提取2h，提取液抽滤， 药液备用，药渣用95％EtOH，2L，搅拌提取2h，提取液抽滤，药渣去掉， 两次提取液混合，在70℃下浓缩，得到样品干膏0.138kg，此干膏用纯化 水2L，在70℃搅拌溶解，用自来水冷却至室温，药液离心分离 4000rpm,10min，加入NaCl 100g，正己烷300ml，在35℃下用磁力搅拌器 搅拌生成沉淀24h，沉淀抽滤，用5％NaCl溶液400ml，纯化水400ml依次 洗涤，样品真空干燥(70℃，-0.1MPa)得到27.1g，样品中加入60ml 95％ 乙醇在70℃水浴中搅拌溶解，溶解完后在70℃水浴中浓干，加入270ml纯 化水在70℃水浴中搅拌溶解，用自来水冷却至室温，离心分离4000rpm， 10min，上清液加入40ml乙酸乙酯，在35℃水浴中用磁力搅拌器搅拌生成 沉淀24h，药液抽滤，沉淀分别用130ml纯化水，50ml乙酸乙酯洗涤，沉 淀中加入130ml乙酸乙酯，用磁力搅拌器搅拌15分钟，抽滤，沉淀真空干 燥(70℃，-0.1MPa)得到21.4g，样品中加入200ml纯化水在70℃水浴中 搅拌溶解，用自来水冷却至室温，离心分离4000rpm，10min样品溶液，药 液中加入27ml乙酸乙酯在35℃水浴中用磁力搅拌器搅拌生成沉淀24h，药 液抽滤，沉淀用90ml纯化水，50ml乙酸乙酯洗涤，沉淀中加入100ml乙酸 乙酯，用磁力搅拌器搅拌15分钟，抽滤，沉淀真空干燥(70℃，-0.1MPa) 得到15.3g续断皂苷VI。
实施例5
代号ASP2(按照一种续断皂苷VI的提取纯化工艺，重庆市中药研究院，200910104726.9中工艺进行)。称取川续断药材粗粉2kg，用60％乙醇 6000ml，在50℃条件下温浸3次，每次1小时，过滤上述浸出液，合 并滤液，回收滤液减压回收至无醇味，加水调整漉液体积为每毫升含0.5g 续断药材提取物的溶液，高速离心或过滤除去不溶于水的杂质，得到清液； 用水饱和的正丁醇萃取3次，正丁醇层用正丁醇饱和过的水反萃取1 次，合并正丁醇层回收至干，得到续断总皂苷提取物。将续断总皂苷提取 物用常温下用适量三氯甲烷饱和过的水溶解，将溶液装入分液漏斗中，向 溶液中加入适量的三氯甲烷并充分震摇，放出下层三氯甲烷，转移出上层 絮状沉淀，装入离心筒中，并向离心管中加入适量的三氯甲烷，10000rp.min 离心10分钟。取出上层的灰白色块状物。将上述的块状物用水溶解后重 复上述操作，得到白色块状物，将白色块状物真空干燥后得到续断皂苷VI。
实施例6
采用实施例4及实施例5得到的样品进行犬药代动力学研究。
1材料
Thermo Scientific TSQ Endura液相色谱-串联质谱仪，液相为Thermo U3000超高效液相色谱仪，包括二元输液泵、自动进样器、柱温箱，质谱主 机为TSQ Endura，配有电喷雾离子源(ESI)以及TraceFinder 4.0数据采 集处理软件；Sigma 3k15型离心机；德国赛多利斯BP211D型电子天平； Eppendorf可调式移液器。
实施例4样品，(代号ASP1，广州博济医药生物技术股份有限公司)， 实施例5样品，(代号ASP2，广州博济医药生物技术股份有限公司)，布 洛芬(Ibuprofen，IBRF，内标，中国药品生物制品检定所)，甲醇、乙腈、 甲酸均为色谱纯，水为屈臣氏蒸馏水。
Beagle犬12只，体重14～20kg，雌雄各半，南京柴门生物科技有限公 司，质量合格证号：No.32003000000027。
2方法
2.1色谱条件
色谱柱为Waters ACQUITY
Figure BDA0002900150530000101
BEH C18(2.1mm×100mm，1.7μm)； 流动相A为0.01％甲酸水，流动相B为0.01％甲酸乙腈，梯度洗脱(0～0.3min， 35％B；0.3～0.5min，35～65％B；0.5～2.5min，65％B；2.5～2.6min，65～90％B； 2.6～3.5min，90％B；3.5～3.6min，90～35％B)；柱温为55℃，流速为0.4mL/min， 分析时间4min。
2.2质谱条件
离子源：电喷雾离子源(ESI)；扫描方式：多重反应监测(MRM)； 监测模式：负离子；喷雾电压：3500V；汽化温度：250℃；鞘气：35Arb； 辅气：5Arb；离子传输管温度：220℃。ASP监测离子对为973.4→ 603.3/927.3，碰撞能为46/19V，锥孔电压为298V；IBRF监测离子对为205.0 →161.0，碰撞能为10V，锥孔电压为100V。
2.3血浆样品处理方法
吸取血浆样品100μL，加入含200μL 14μg/mL的内标液沉淀剂，涡 旋混合2min，13000rpm离心10min，吸取上清100μL，进样1μL测定。
2.4动物给药及样品采集
普通级动物房饲养，每天定量给予动物体重3％～4％左右的饲料，分上、 下午两次喂饲，自由饮水。试验前进行检疫观察至少7天，经检疫合格后 进行试验。12只Beagle犬按性别体重随机分为2组，每组6只，雌雄各3 只，分别作ASP1、ASP2给药组，试验前禁食12小时，自由饮水。将含药 胶囊置于犬舌根处，在试验动物吞咽后随即用20mL纯化水送服，给药剂量 均为30mg/kg。各动物于给药前(0h)和给药后15min、30min、45min、1h、 1.5h、2h、3h、4h、6h、8h、12h于犬前肢隐静脉采血约2mL至肝素化管中。 血样随后以4500rpm离心10min，吸取血浆待测。
3结果
3.1方法学评价
3.1.1专属性
通过考察空白生物样品色谱图、空白生物样品外加一定浓度对照品的 色谱图来反映方法的特异性。
在本分析条件下，Beagle犬空白血浆样本所含内源性物质对ASP及内 标的分离测定均没有影响，ASP与内标IBRF的检测均互不干扰，方法的专 属性较高。生物样品中ASP与内标IBRF峰形良好，代表性空白犬血浆，空 白犬血浆加对照品色谱图见图1和图2。ASP、IBRF保留时间分别为2.69min、 1.38min、2.17min。
3.1.2标准曲线
取ASP约1.00mg/mL储备液，用50％甲醇水稀释配制成含ASP浓度为40 μg/mL的混合溶液，用50％甲醇水将40μg/mL混合工作液逐级稀释成20、 10、4、2、1、0.4、0.2μg/ml，既得混合标准曲线样品工作液。分别精密 吸取空白大鼠血浆95μL，分别加入不同浓度的ASP工作液5μL，混匀得不同 浓度的标准曲线样品，按“血浆样品处理方法”操作后，进行分析，以已 知浓度为横坐标，所得不同浓度ASP的峰面积与内标峰面积之比为纵坐标， 用加权最小二乘法(权重系数为1/x2)进行回归运算，求得直线回归方程。 Beagle犬血浆中ASP浓度在10/5/50ng/mL范围线性良好(r2均大于0.99)， 化合物标准曲线为Y＝3.145e-3X+7.128e-3。
3.1.3提取回收率与基质效应
制备含ASP浓度为25/12.5/125ng/ml的质控样品，平行样品6份，按 “血浆样品处理方法”处理后，进样分析，得峰面积A；取6个不同来源空 白血浆，按“血浆样品处理方法”处理后，加入工作液制备与质控样品理 论浓度相同的样品，进样分析，得峰面积为B；用水代替血浆配制与质控样 品浓度相同的样品，进样分析，得峰面积为C。
依“(A/B)×100％”计算提取回收率。ASP提取回收率为99.45％～101.73％ (RSD≤9.14％)。
依“(B/C)×100％”分别计算各分析物和内标的基质因子。进一步 计算经内标归一化的基质因子的变异系数。ASP低、高浓度下经内标归一化 基质因子变异系数分别为5.94％、3.27％。
3.1.4精密度和准确度
制备含ASP浓度为10/5/50ng/mL的定量下限及低、中、高质控样品， 平行样品6份，按“血浆样品处理方法”处理后，进行分析，考察分析方 法的批内精密度与准确度，通过分析不同天制备的3个合格的分析批考察 批间精密度与准确度。
ASP在各浓度下批内、批间准确度分别为96.04％～100.46％(RSD≤ 8.41％)、96.52％～102.96％(RSD≤6.52％)。
3.1.5稳定性考察
制备含ASP浓度为25/12.5/125ng/ml的质控样品，在室温放置一定时 间后，平行样品3份，按“血浆样品处理方法”处理后，进行分析。测得 ASP放置6h故再在室温下ASP放置6h保持稳定。
同时还考察了ASP低、高质控样品处理后提取液在4℃进样室放置24h 稳定性。测得ASP的准确度分别为101.70％～108.14％(RSD≤8.19％)。故 ASP提取液在室温下放置24h保持稳定。
3.2药代动力学研究结果
表1 ASP1药代动力学参数结果
Figure BDA0002900150530000131
Figure BDA0002900150530000141
表2 ASP2血药浓度数据
Figure BDA0002900150530000142
表3药动参数结果
Figure BDA0002900150530000143
4结果分析
本研究建立了检测Beagle犬血浆样品中ASP特异、可靠、快速的UPLC MS MS分析方法，并对该方法进行了验证，血浆中内源性物质不干扰各分析 物和内标的测定，各分析物和内标的测定互不干扰，ASP在10～2000ng/mL 浓度范围内线性关系良好。经过对方法的残留、线性、精密度与准确度、 提取回收率、基质效应、稳定性(室温放置、提取液放置)等进行考察验 证，各项验证内容均合格，表明本研究方法能符合生物样品分析要求。
通过公式F＝AUCASP1/AUCASP2*100％计算ASP1相对于ASP2的口服生 物利用度为154％，表明ASP1口服生物利用度要显著优于ASP2。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在 本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含 在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种高生物利用度的续断皂苷VI的提取纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：
称取药材0.5kg加入95％EtOH，2L，在50℃下搅拌提取2h，提取液抽滤，药液备用，药渣用95％EtOH，2L，搅拌提取2h，提取液抽滤，药渣去掉，两次提取液混合，在70℃下浓缩，得到样品干膏0.133kg；此干膏用纯化水2L，在70℃搅拌溶解，用自来水冷却至室温，药液离心分离4000rpm,10min，加入NaCl 100g，石油醚300ml，在35℃下用磁力搅拌器搅拌生成沉淀24h，沉淀抽滤，用5％NaCl溶液400ml，纯化水400ml依次洗涤，样品真空干燥，干燥温度70℃，气压-0.1MPa，得到26.4g；
样品中加入60ml 95％乙醇在70℃水浴中搅拌溶解，溶解完后在70℃水浴中浓干，加入260ml纯化水在70℃水浴中搅拌溶解，用自来水冷却至室温，离心分离4000rpm，10min，上清液加入40ml乙酸乙酯，在35℃水浴中用磁力搅拌器搅拌生成沉淀24h，药液抽滤，沉淀分别用130ml纯化水，50ml乙酸乙酯洗涤，沉淀中加入130ml乙酸乙酯，用磁力搅拌器搅拌15分钟，抽滤，沉淀真空干燥，干燥温度70℃，气压-0.1MPa，得到19.9g；
样品中加入200ml纯化水在70℃水浴中搅拌溶解，用自来水冷却至室温，离心分离4000rpm，10min样品溶液，药液中加入27ml乙酸乙酯在35℃水浴中用磁力搅拌器搅拌生成沉淀24h，药液抽滤，沉淀用90ml纯化水，50ml乙酸乙酯洗涤，沉淀中加入100ml乙酸乙酯，用磁力搅拌器搅拌15分钟，抽滤，沉淀真空干燥，干燥温度70℃，气压-0.1MPa，得到14.9g续断皂苷VI。
2.一种高生物利用度的续断皂苷VI的提取纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：
称取药材0.5kg加入95％EtOH，2L，在50℃下搅拌提取2h，提取液抽滤，药液备用，药渣用95％EtOH，2L，搅拌提取2h，提取液抽滤，药渣去掉，两次提取液混合，在70℃下浓缩，得到样品干膏0.136kg；此干膏用纯化水2L，在70℃搅拌溶解，用自来水冷却至室温，药液离心分离4000rpm,10min，加入NaCl100g，正己烷300ml，在35℃下用磁力搅拌器搅拌生成沉淀24h，沉淀抽滤，用5％NaCl溶液400ml，纯化水400ml依次洗涤，样品真空干燥，干燥温度70℃，气压-0.1MPa，得到25.9g；
样品中加入60ml 95％乙醇在70℃水浴中搅拌溶解，溶解完后在70℃水浴中浓干，加入260ml纯化水在70℃水浴中搅拌溶解，用自来水冷却至室温，离心分离4000rpm，10min，上清液加入40ml乙酸乙酯，在35℃水浴中用磁力搅拌器搅拌生成沉淀24h，药液抽滤，沉淀分别用130ml纯化水，50ml乙酸乙酯洗涤，沉淀中加入130ml乙酸乙酯，用磁力搅拌器搅拌15分钟，抽滤，沉淀真空干燥，干燥温度70℃，气压-0.1MPa，得到20.8g；
样品中加入200ml纯化水在70℃水浴中搅拌溶解，用自来水冷却至室温，离心分离4000rpm，10min样品溶液，药液中加入27ml乙酸乙酯在35℃水浴中用磁力搅拌器搅拌生成沉淀24h，药液抽滤，沉淀用90ml纯化水，50ml乙酸乙酯洗涤，沉淀中加入100ml乙酸乙酯，用磁力搅拌器搅拌15分钟，抽滤，沉淀真空干燥，干燥温度70℃，气压-0.1MPa，得到15.1g续断皂苷VI。
3.一种高生物利用度的续断皂苷VI的提取纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：
称取药材0.5kg加入95％EtOH：乙酸乙酯＝8:2，2L，在50℃下搅拌提取2h，提取液抽滤，药液备用，药渣用95％EtOH：乙酸乙酯＝8:2，2L，搅拌提取2h，提取液抽滤，药渣去掉，两次提取液混合，在70℃下浓缩，得到样品干膏0.137kg；
此干膏用纯化水2L，在70℃搅拌溶解，用自来水冷却至室温，药液离心分离4000rpm,10min，加入NaCl 100g，石油醚300ml，在35℃下用磁力搅拌器搅拌生成沉淀24h，沉淀抽滤，用5％NaCl溶液400ml，纯化水400ml依次洗涤，样品真空干燥，干燥温度70℃，气压-0.1MPa，得到28.0g，
样品中加入60ml 95％乙醇在70℃水浴中搅拌溶解，溶解完后在70℃水浴中浓干，加入280ml纯化水在70℃水浴中搅拌溶解，用自来水冷却至室温，离心分离4000rpm，10min，上清液加入40ml乙酸乙酯，在35℃水浴中用磁力搅拌器搅拌生成沉淀24h，药液抽滤，沉淀分别用130ml纯化水，50ml乙酸乙酯洗涤，沉淀中加入130ml乙酸乙酯，用磁力搅拌器搅拌15分钟，抽滤，沉淀真空干燥，干燥温度70℃，气压-0.1MPa，得到20.5g，
样品中加入200ml纯化水在70℃水浴中搅拌溶解，用自来水冷却至室温，离心分离4000rpm，10min样品溶液，药液中加入27ml乙酸乙酯在35℃水浴中用磁力搅拌器搅拌生成沉淀24h，药液抽滤，沉淀用90ml纯化水，50ml乙酸乙酯洗涤，沉淀中加入100ml乙酸乙酯，用磁力搅拌器搅拌15分钟，抽滤，沉淀真空干燥，干燥温度70℃，气压-0.1MPa，得到15.1g续断皂苷VI。
4.一种高生物利用度的续断皂苷VI的提取纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：
称取药材0.5kg加入95％EtOH，2L，在50℃下搅拌提取2h，提取液抽滤，药液备用，药渣用95％EtOH，2L，搅拌提取2h，提取液抽滤，药渣去掉，两次提取液混合，在70℃下浓缩，得到样品干膏0.138kg；
此干膏用纯化水2L，在70℃搅拌溶解，用自来水冷却至室温，药液离心分离4000rpm,10min，加入NaCl 100g，正己烷300ml，在35℃下用磁力搅拌器搅拌生成沉淀24h，沉淀抽滤，用5％NaCl溶液400ml，纯化水400ml依次洗涤，样品真空干燥，干燥温度70℃，气压-0.1MPa，得到27.1g；
样品中加入60ml 95％乙醇在70℃水浴中搅拌溶解，溶解完后在70℃水浴中浓干，加入270ml纯化水在70℃水浴中搅拌溶解，用自来水冷却至室温，离心分离4000rpm，10min，上清液加入40ml乙酸乙酯，在35℃水浴中用磁力搅拌器搅拌生成沉淀24h，药液抽滤，沉淀分别用130ml纯化水，50ml乙酸乙酯洗涤，沉淀中加入130ml乙酸乙酯，用磁力搅拌器搅拌15分钟，抽滤，沉淀真空干燥，干燥温度70℃，气压-0.1MPa，得到21.4g，样品中加入200ml纯化水在70℃水浴中搅拌溶解，用自来水冷却至室温，离心分离4000rpm，10min样品溶液，药液中加入27ml乙酸乙酯在35℃水浴中用磁力搅拌器搅拌生成沉淀24h，药液抽滤，沉淀用90ml纯化水，50ml乙酸乙酯洗涤，沉淀中加入100ml乙酸乙酯，用磁力搅拌器搅拌15分钟，抽滤，沉淀真空干燥，干燥温度70℃，气压-0.1MPa，得到15.3g续断皂苷VI。
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