CN114924006B - 一种铁丝威灵仙药材、饮片及制剂中掺伪威灵仙的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于药物掺伪检测技术领域，具体涉及一种铁丝威灵仙药材、饮片及制剂中掺伪威灵仙的检测方法。本发明的检测方法，基于伪品威灵仙的专属化学成分‑齐墩果酸，是一种准确、快速的铁丝威灵仙掺伪威灵仙鉴别方法。在本发明中，供试品溶液的制备采用先水提再酸水解方法，铁丝威灵仙药材、饮片及制剂，在与对照品齐墩果酸色谱峰保留时间一致的位置上均不存在干扰峰，专属性强，精密度、重复性、稳定性良好，检出限低，且具有良好的耐用性，有效填补了基于化学成分检测铁丝威灵仙掺伪威灵仙领域的技术空白，可以为药品质量监管提供有力的技术保障。
Description
技术领域
本发明属于药物掺伪检测技术领域，具体涉及一种铁丝威灵仙药材、饮片及制剂中掺伪威灵仙的检测方法。
背景技术
中药材、中药饮片、中成药是中医药传承发展的重要物质基础，保障其质量事关国民健康。中药质量研究，特别是掺伪检测研究一直是行业关切的重要问题。近年来，已报道了诸多中药品种的掺伪分析方法，为中药质量监管提供了强有力的技术支撑。但是，随着中药野生资源不断减少，在利益驱动下，部分中药材、中药饮片出现人为掺伪等问题。若使用有问题的中药材、饮片作为原材料投料，必将影响中成药的质量安全。因此，中药掺伪检测研究，特别是野生资源短缺的中药品种的掺伪检测研究工作依然备受关注。
《中国药典》2020年版四部“成方制剂中本版药典未收载的药材和饮片”中规定铁丝威灵仙为百合科植物短梗菝葜Smilaxscobinicaulis C.H.Wright、鞘柄菝葜Smilaxstans Maxim.或华东菝葜Smilax sioboldMiq.的干燥根及根茎，其具有祛风、除湿、散瘀、解毒等功效，主要用于治疗风湿腰腿痛、疮疖等症。部分地方标准中收载铁丝威灵仙的基原不尽相同，主要包括短梗菝葜和鞘柄菝葜。一直以来，铁丝威灵仙药材主要为野生品，存在采挖不易、产量较少等情况，因此，可能存在以性状相似、产量更高、价格更低的威灵仙进行掺伪使用的问题。而铁丝威灵仙与威灵仙分属百合科和毛茛科植物，化学成分存在差异，掺伪使用将导致铁丝威灵仙药材、饮片及相关中成药质量不稳定，影响用药的安全性和有效性。已报道的鉴别铁丝威灵仙和威灵仙的现有技术为性状鉴别和显微鉴别，应用于检查时工作量大、耗时长。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种铁丝威灵仙药材、饮片及制剂中掺伪威灵仙的检测方法。本发明的检测方法基于伪品威灵仙的专属化学成分-齐墩果酸，是一种准确、快速的铁丝威灵仙掺伪威灵仙鉴别方法。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种铁丝威灵仙药材、饮片及制剂中掺伪威灵仙的检测方法，包括以下步骤：
提供齐墩果酸对照品溶液；
将待测样品依次进行水提和酸水解，得到供试品溶液；所述待测样品为铁丝威灵仙药材、饮片或制剂中任一种；
将所述齐墩果酸对照品溶液和供试品溶液分别进行高效液相色谱分析，得到对照品溶液色谱图和供试品溶液色谱图；
所述高效液相色谱分析的色谱条件包括：
色谱柱：填料为十八烷基硅烷键合硅胶；
流动相：A为乙腈，B为水；
梯度洗脱程序为：0～8min：A的体积比由50％上升到70％；8～23min：A的体积比由70％上升到95％；23～25min：A的体积比保持95％；
当所述供试品溶液色谱图中在与对照品溶液色谱图中齐墩果酸色谱峰保留时间一致的位置上出现色谱峰时，所述待测样品掺伪威灵仙；当所述供试品溶液色谱图中在与对照品溶液色谱图中齐墩果酸色谱峰保留时间一致的位置上不出现色谱峰时，所述待测样品不掺伪威灵仙。
优选的，所述水提包括以下步骤：将所述待测样品与水混合后依次进行第一回流、冷却、固液分离和干燥，得到水提物；
所述酸水解包括以下步骤：将所述水提物与盐酸溶液混合后，依次进行第二回流和冷却，得到提取液，将所述提取液进行萃取，得到萃取液，将所述萃取液进行浓缩和复溶，得到所述供试品溶液。
优选的，所述齐墩果酸对照品溶液的溶剂为甲醇，所述齐墩果酸对照品溶液的浓度为0.1～0.3mg/mL。
优选的，所述待测样品为铁丝威灵仙药材或饮片时，所述第一回流时，所述水与待测样品的用量比为10～100mL:1～3g；所述待测样品为以铁丝威灵仙原粉入药的制剂时，所述第一回流时，所述水与制剂中铁丝威灵仙的用量比为10～100mL:1～3g。
优选的，所述盐酸溶液的质量浓度为5～30％，所述盐酸溶液与待测样品的用量比为5～40mL:1～3g。
优选的，所述萃取的萃取剂包括乙酸乙酯，所述萃取剂的体积为提取液体积的1～5倍，所述萃取的次数为1～5次。
优选的，所述复溶的溶剂包括甲醇、乙腈和水中的一种或多种，所述复溶的溶剂与待测样品的用量比为5～50mL:1～3g。
优选的，所述高效液相色谱分析的检测波长为205±2nm，柱温为20～40℃，流速为0.5～1.0mL/min，进样量为2～50μL。
优选的，当所述供试品溶液色谱图中在与对照品溶液色谱图中齐墩果酸色谱峰保留时间一致的位置上出现色谱峰时，还包括比较所述色谱峰的紫外-可见吸收光谱。
本发明还提供了上述的高效液相色谱分析的替换方法：液相色谱-质谱分析，得到供试品溶液的液相色谱图、对照品溶液的液相色谱图、供试品溶液的一、二级质谱图和对照品溶液的一、二级质谱图；
所述液相色谱-质谱分析的液相色谱条件包括：
色谱柱：填料为十八烷基硅烷键合硅胶；
流动相：A为体积分数0.1％的甲酸水溶液，B为乙腈；
梯度洗脱程序为：0～2min：A的体积比由50％下降到30％；2～8min：A的体积比由30％下降到5％；8～10min：A的体积比保持5％；
所述液相色谱-质谱分析的质谱条件包括：
三重四级杆质谱，离子源为ESI，负离子扫描；全扫描扫描范围m/z：350～550；子离子扫描范围m/z：50～480；CE：58V；
当所述供试品溶液的液相色谱图中在与对照品溶液的液相色谱图中齐墩果酸色谱峰保留时间一致的位置上出现色谱峰时，比较供试品溶液和对照品溶液的一、二级质谱图，若一、二级质谱图一致，则所述待测样品掺伪威灵仙；
当所述供试品溶液的液相色谱图中在与对照品溶液的液相色谱图中齐墩果酸色谱峰保留时间一致的位置上不出现色谱峰时，则所述待测样品不掺伪威灵仙。
本发明与现有技术相比，具有如下有益效果：
本发明的检测方法，同时适用于铁丝威灵仙药材、饮片及制剂中掺伪威灵仙检测，有效填补了基于化学成分检测铁丝威灵仙掺伪威灵仙领域的技术空白，可以为药品质量监管提供有力的技术保障。
本发明的检测方法，铁丝威灵仙药材、饮片及制剂中，在与齐墩果酸色谱峰保留时间一致的位置上均不存在干扰峰，精密度、重复性、稳定性好，检出限低，且具有良好的耐用性，可准确、快速地发现铁丝威灵仙药材、饮片及制剂是否存在掺伪威灵仙问题。
进一步地，在本发明中，供试品溶液的制备采用先水提再酸水解方法，本发明选择水作为提取溶剂，不仅环保，而且得到的供试品溶液，在进行液相色谱分析时干扰少，利于检测。本发明的酸水解采用稀盐酸溶液，安全性高、成本低。
进一步地，本发明的液相色谱-质谱分析可替换高效液相色谱分析，也可进一步排除待测样品溶液中的干扰，检测结果准确、可靠。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为经乙醇(A)、水(B)提取制备的供试品溶液的高效液相色谱图；
图2为7批铁丝威灵仙饮片样品的高效液相色谱图，从下到上依次为T-YP-1～T-YP-7、齐墩果酸对照品；
图3为铁丝威灵仙饮片样品(T-YP-7)与齐墩果酸对照品色谱峰的紫外吸收光谱图，其中1为样品中与齐墩果酸保留时间一致的色谱峰的紫外吸收光谱图，2为齐墩果酸对照品的紫外吸收光谱图；
图4为齐墩果酸对照品与铁丝威灵仙饮片样品(T-YP-7)和威灵仙药材样品(WY-2)的一、二级质谱图，其中1为齐墩果酸对照品一级质谱图，2为铁丝威灵仙饮片样品(T-YP-7)一级质谱图，3为威灵仙药材样品(WY-2)一级质谱图，4为齐墩果酸对照品二级质谱图，5为铁丝威灵仙饮片样品(T-YP-7)二级质谱图，6为威灵仙药材样品(WY-2)二级质谱图；
图5为14批心脑静片样品和齐墩果酸对照品的高效液相色谱图，从下到上依次为XNJ-1～XNJ-14、齐墩果酸对照品；
图6为6批铁丝威灵仙药材和齐墩果酸对照品的高效液相色谱图，从下到上依次为T-1～T-6、齐墩果酸对照品；
图7为8批威灵仙药材和齐墩果酸对照品的高效液相色谱图，从下到上依次为WY-1～WY-8、齐墩果酸对照品；
图8为采用AgilentEclipse XDB-C18色谱柱测定的高效液相色谱图，其中A为齐墩果酸对照品，B为供试品溶液(T-YP-7)；
图9为采用AgilentZORBAX SB-C18色谱柱测定的高效液相色谱图，其中A为齐墩果酸对照品；B为供试品溶液(T-YP-7)；
图10为威灵仙药材(WY-1)、铁丝威灵仙药材(T-1)、常春藤皂苷元对照品、齐墩果酸对照品的高效液相色谱图，从下到上依次为铁丝威灵仙、威灵仙、常春藤皂苷元对照品、齐墩果酸对照品。
具体实施方式
本发明提供了一种铁丝威灵仙药材、饮片及制剂中掺伪威灵仙的检测方法，包括以下步骤：
提供齐墩果酸对照品溶液；
将待测样品依次进行水提和酸水解，得到供试品溶液；所述待测样品为铁丝威灵仙药材、饮片或制剂中任一种；
将所述齐墩果酸对照品溶液和供试品溶液分别进行高效液相色谱分析，得到对照品溶液色谱图和供试品溶液色谱图；
所述高效液相色谱分析的色谱条件包括：
色谱柱：填料为十八烷基硅烷键合硅胶；
流动相：A为乙腈，B为水；
梯度洗脱程序为：0～8min：A的体积比由50％上升到70％；8～23min：A的体积比由70％上升到95％；23～25min：A的体积比保持95％；
当所述供试品溶液色谱图中在与对照品溶液色谱图中齐墩果酸色谱峰保留时间一致的位置上出现色谱峰时，所述待测样品掺伪威灵仙；当所述供试品溶液色谱图中在与对照品溶液色谱图中齐墩果酸色谱峰保留时间一致的位置上不出现色谱峰时，所述待测样品不掺伪威灵仙。
在本发明中，若无特殊说明，使用的试剂、仪器均为本领域市售商品。
本发明提供齐墩果酸对照品溶液。
本发明优选称取齐墩果酸对照品后溶解，得到所述齐墩果酸对照品溶液。
在本发明中，所述齐墩果酸对照品溶液的溶剂优选为甲醇，所述齐墩果酸对照品溶液的浓度优选为0.1～0.3mg/mL，更优选为0.2mg/mL。
本发明将待测样品依次进行水提和酸水解，得到供试品溶液；所述待测样品为铁丝威灵仙药材、饮片或制剂中任一种。
在本发明中，所述水提优选包括以下步骤：将所述待测样品与水混合后依次进行第一回流、冷却、固液分离和干燥，得到水提物。
所述酸水解优选包括以下步骤：将所述水提物与盐酸溶液混合后，依次进行第二回流和冷却，得到提取液，将所述提取液进行萃取，得到萃取液，将所述萃取液进行浓缩和复溶，得到所述供试品溶液。
在本发明中，所述第一回流和第二回流的时间独立地优选为0.5～3h。
在本发明中，所述待测样品为铁丝威灵仙药材或饮片时，所述第一回流时，所述水与待测样品的用量比优选为10～100mL:1～3g，更优选为10～100mL:2g；所述待测样品为以铁丝威灵仙原粉入药的制剂时，所述第一回流时，所述水与制剂中铁丝威灵仙的用量比优选为10～100mL:1～3g，更优选为10～100mL:2g。
在本发明中，所述待测样品优选为以铁丝威灵仙经水煎煮入药的制剂时，所述待测样品优选直接进行酸水解，具体包括以下步骤：将所述待测样品与盐酸溶液混合后，依次进行第二回流和冷却，得到提取液，将所述提取液进行萃取，得到萃取液，将所述萃取液进行浓缩和复溶，得到所述供试品溶液。
在本发明中，所述盐酸溶液的质量浓度优选为5～30％，更优选为6～20％，所述盐酸溶液与待测样品的用量比优选为5～40mL:1～3g，更优选为30mL:2g。
在本发明中，所述萃取的萃取剂优选包括乙酸乙酯，所述萃取剂的体积优选为提取液体积的1～5倍，更优选为3倍，所述萃取的次数优选为1～5次，更优选为3次。
在本发明中，所述浓缩优选在水浴中进行，所述水浴的温度优选为60～80℃，更优选为70℃。
在本发明中，所述复溶的溶剂优选包括甲醇、乙腈和水中的一种或多种，所述复溶的溶剂与待测样品的用量比优选为5～50mL:1～3g，更优选为25mL:2g。
本发明将铁丝威灵仙药材、饮片或制剂样品，采用水提-酸水解的方法制备供试品溶液，解决了供试品溶液色谱图中在与对照品溶液色谱图中齐墩果酸色谱峰保留时间一致的位置上出现干扰峰，而影响实验结果判断的问题。本发明对所述保留时间一致的位置没有特殊的要求，采用本领域技术人员常用的时间范围即可。
在本发明中，所述供试品溶液的制备采用水提-酸水解法，分为水提取皂苷和盐酸水解两个主要步骤，有四方面优势：1)水提取制备的样品色谱图几乎无干扰；2)大部分铁丝威灵仙制剂为水煎煮铁丝威灵仙后入药，因此，与醇提取相比，采用水作为提取溶剂建立的分析方法更适用于铁丝威灵仙制剂的掺伪鉴别研究；3)与乙醇相比，水提取更为环保；4)稀盐酸水解可以提高方法的安全性，降低成本。
本发明以齐墩果酸为鉴别铁丝威灵仙掺伪威灵仙的专属鉴别指标。威灵仙中主要水解成分为常春藤皂苷元、齐墩果酸，本发明收集了正品铁丝威灵仙药材样品和伪品威灵仙药材样品，发现常春藤皂苷元在部分威灵仙药材样品中含量低或未检出，齐墩果酸在所有威灵仙药材样品中含量均较高，且收集到的全部铁丝威灵仙药材样品均未检出齐墩果酸，因此选择齐墩果酸作为掺伪分析方法的检测指标。
得到齐墩果酸对照品溶液和供试品溶液后，本发明将所述齐墩果酸对照品溶液和供试品溶液分别进行高效液相色谱分析，得到对照品溶液色谱图和供试品溶液色谱图；
所述高效液相色谱分析的色谱条件包括：
色谱柱：填料为十八烷基硅烷键合硅胶；
流动相：A为乙腈，B为水；
梯度洗脱程序为：0～8min：A的体积比由50％上升到70％；8～23min：A的体积比由70％上升到95％；23～25min：A的体积比保持95％；
当所述供试品溶液色谱图中在与对照品溶液色谱图中齐墩果酸色谱峰保留时间一致的位置上出现色谱峰时，所述待测样品掺伪威灵仙；当所述供试品溶液色谱图中在与对照品溶液色谱图中齐墩果酸色谱峰保留时间一致的位置上不出现色谱峰时，所述待测样品不掺伪威灵仙。
在本发明中，所述高效液相色谱分析的检测波长优选为205±2nm，更优选为205nm；柱温优选为20～40℃，更优选为30℃；流速优选为0.5～1.0mL/min，更优选为1.0mL/min；进样量优选为2～50μL，更优选为为10μL。
在本发明中，当所述供试品溶液色谱图中在与对照品溶液色谱图中齐墩果酸色谱峰保留时间一致的位置上出现色谱峰时，优选的还包括比较所述色谱峰的紫外-可见吸收光谱。
在本发明中，得到所述供试品溶液色谱图与对照品溶液色谱图的同时，优选还得到供试品溶液的紫外-可见吸收光谱和对照品溶液的紫外-可见吸收光谱。
在本发明中，对比所述供试品溶液的紫外-可见吸收光谱和对照品溶液的紫外-可见吸收光谱，可进一步验证供试品溶液色谱图中在与对照品溶液色谱图中齐墩果酸色谱峰保留时间一致的位置上出现的色谱峰是否为干扰峰，即进一步确认铁丝威灵仙药材、饮片或制剂中是否掺伪威灵仙，提高检测结果的准确性。
在本发明中，所述高效液相色谱分析优选替换为液相色谱-质谱分析，得到供试品溶液的液相色谱图、对照品溶液的液相色谱图、供试品溶液的一、二级质谱图和对照品溶液的一、二级质谱图；
所述液相色谱-质谱分析的液相色谱条件包括：
色谱柱：填料为十八烷基硅烷键合硅胶；
流动相：A为体积分数0.1％的甲酸水溶液，B为乙腈；
梯度洗脱程序为：0～2min：A的体积比由50％下降到30％；2～8min：A的体积比由30％下降到5％；8～10min：A的体积比保持5％；
所述液相色谱-质谱分析的质谱条件包括：
三重四级杆质谱，离子源为ESI，负离子扫描；全扫描扫描范围m/z：350～550；子离子扫描范围m/z：50～480；CE：58V；
当所述供试品溶液的液相色谱图中在与对照品溶液的液相色谱图中齐墩果酸色谱峰保留时间一致的位置上出现色谱峰时，比较供试品溶液和对照品溶液的一、二级质谱图，若一、二级质谱图一致，则所述待测样品掺伪威灵仙；
当所述供试品溶液的液相色谱图中在与对照品溶液的液相色谱图中齐墩果酸色谱峰保留时间一致的位置上不出现色谱峰时，则所述待测样品不掺伪威灵仙。
在本发明中，所述液相色谱-质谱分析也优选作为高效液相色谱分析的补充验证，进一步排除干扰。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的检测方法进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
在本发明的具体实施例中，威灵仙药材和铁丝威灵仙药材样品均为自采，铁丝威灵仙饮片样品和心脑静片样品均为市售商品。
本发明共收集8批威灵仙药材样品(编号WY-1～WY-8)、6批铁丝威灵仙药材样品(编号T-1～T-6)、7批铁丝威灵仙饮片样品(编号T-YP-1～T-YP-7)、14批心脑静片样品(编号XNJ-1～XNJ-14)。
实施例1
对照品溶液的制备：取齐墩果酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含0.2mg的溶液，即为对照品溶液。
供试品溶液的制备：将威灵仙药材、铁丝威灵仙药材、铁丝威灵仙饮片、心脑静片样品粉碎，分别称取2.0g，加水100mL进行第一回流2小时，放冷、过滤，滤液置水浴上蒸干。残渣加2mol/L盐酸溶液30mL使溶解，加热第二回流2小时，立即冷却，移入分液漏斗中，用水10mL分次洗涤容器，洗液并入分液漏斗中，加乙酸乙酯振摇提取3次，每次20mL，合并乙酸乙酯液，70℃以下浓缩至近干，加甲醇溶解，转移至25mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，得到供试品溶液。
测定：分别精密吸取供试品溶液、对照品溶液各10μL，进行高效液相色谱分析，记录色谱图。
将供试品溶液和对照品溶液稀释至浓度约为1μg/mL，分别进行液相色谱-质谱分析，记录质谱图。
高效液相色谱条件：采用Waters XbridgeTM C18(250mm×4.6mm，5μm)色谱柱；流速为1mL/min；以乙腈(A)-水(B)为流动相，梯度洗脱程序为：0～8min：A的体积比由50％上升到70％；8～23min：A的体积比由70％上升到95％；23～25min：A的体积比保持95％；检测波长为205nm；柱温为30℃；理论板数按齐墩果酸峰计算应不低于3000。
液相色谱-质谱条件：采用ACQUITYUPLC HSS T3(2.1×100mm，1.8μm)色谱柱；柱温30℃；流动相：0.1％甲酸溶液(A)-乙腈(B)，梯度洗脱程序为：0～2min：A的体积比由50％下降到30％；2～8min：A的体积比由30％下降到5％；8～10min：A的体积比保持5％；采用三重四级杆质谱检测器，电喷雾离子化(ESI)负离子模式下进行检测；全扫描扫描范围m/z：350～550；子离子扫描范围m/z：50～480；CE：58V。
采用上述方法对8批威灵仙药材样品(编号WY-1～WY-8)、6批铁丝威灵仙药材样品(编号T-1～T-6)、7批铁丝威灵仙饮片样品(编号T-YP-1～T-YP-7)、14批心脑静片样品(编号XNJ-1～XNJ-14)进行检测。
7批铁丝威灵仙饮片样品测试结果如图2所示，显示1批饮片样品(T-YP-7)检出齐墩果酸，提示掺伪威灵仙，存在一定的质量风险；其它批次均未检出与齐墩果酸保留时间一致的色谱峰。饮片样品(T-YP-7)在与齐墩果酸对照品溶液色谱峰保留时间一致的位置上检出色谱峰，其紫外-可见吸收光谱与齐墩果酸对照品一致，如图3所示。进一步采用质谱验证，如图4所示，结果表明饮片样品(T-YP-7)、威灵仙药材样品(WY-2)在与齐墩果酸对照品溶液色谱峰保留时间一致的位置上的色谱峰，其一级、二级质谱均与齐墩果酸对照品一致。因此，铁丝威灵仙饮片样品(T-YP-7)掺伪威灵仙。
14批铁丝威灵仙制剂心脑静片测试结果如图5所示，均未检出齐墩果酸。
6批铁丝威灵仙药材样品测试结果如图6所示，均未检出齐墩果酸。
8批威灵仙药材样品测试结果如图7所示，均检出齐墩果酸。
实施例2专属性
采用铁丝威灵仙药材和威灵仙药材样品，考察铁丝威灵仙样品溶液色谱图中在齐墩果酸色谱峰保留时间处是否存在干扰峰。
测定结果如图6、7所示，经过与齐墩果酸对照品比对，并结合DAD光谱，可知威灵仙样品溶液检出齐墩果酸色谱峰，齐墩果酸为威灵仙的专属水解成分，铁丝威灵仙样品中未检出，同时，在齐墩果酸色谱峰保留时间处不存在干扰峰。因此，本发明的检测方法专属性良好。
实施例3精密度
取齐墩果酸对照品溶液(0.2mg/mL)，按照实施例1中的高效液相色谱条件进样5次，计算得到RSD(％)＝0.2％，表明本发明的检测方法精密度良好。
实施例4重复性
取同一供试品(T-YP-7)6份，按供试品溶液的制备方法处理，进行高效液相色谱分析，测试结果见表1，本发明的检测方法重复性良好。
表1重复性测试结果
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | RSD(％) | |
| 峰面积 | 1103503 | 1134136 | 1129004 | 1136448 | 1133765 | 1158807 | 1.58 |
实施例5检出限
根据信噪比大于3∶1，确定本发明高效液相色谱检测方法的检出限，本发明高效液相色谱检测方法齐墩果酸的检出限为20ng。
实施例6稳定性
取同一供试品溶液(T-YP-7)，分别在0、4、8、12、16、24小时进行高效液相色谱分析，计算得到齐墩果酸峰面积的RSD为1.5％，结果表明供试品溶液在24小时内稳定。
实施例7耐用性
取同一供试品溶液(T-YP-7)及齐墩果酸对照品溶液，分别采用Agilent EclipseXDB-C18(250mm×4.6mm，5μm)、AgilentZORBAX SB-C18(250mm×4.6mm，5μm)色谱柱进行测定，测定结果如图8、图9所示，结果表明本发明的检测方法耐用性良好。
对比例1
本对比例与上述实施例1的区别仅在于供试品溶液的制备中进行第一回流时的溶剂不同，本对比例分别使用溶剂乙醇(A)、水(B)进行提取，本对比例选择(T-YP-7)样品进行处理和高效液相色谱测试。
测试结果如图1所示，从图中可以看出，乙醇提取制备的样品色谱图存在干扰峰，而水提取制备的样品色谱图几乎无干扰；且大部分铁丝威灵仙制剂为水煎煮铁丝威灵仙后入药，因此，与醇提取相比，采用水作为提取溶剂建立的分析方法更适用于铁丝威灵仙制剂的掺伪鉴别研究；与乙醇相比，水提取更为环保。
对比例2
本对比例分别选择威灵仙药材(WY-1)、铁丝威灵仙药材(T-1)、常春藤皂苷元和齐墩果酸对照品，按实施例1的方法进行处理和高效液相色谱测试。
测试结果如图10所示，发现常春藤皂苷元在威灵仙药材样品中含量低或未检出，而齐墩果酸含量较高，而铁丝威灵仙样品未检出齐墩果酸。同时本发明比对了其他铁丝威灵仙药材(T-2～T-6)和威灵仙药材样品(WY-2～WY-8)，通过检测分析，发现常春藤皂苷元在部分威灵仙药材样品中含量低或未检出，而齐墩果酸在所有威灵仙药材样品中含量均较高，同时，本发明收集到的全部铁丝威灵仙药材样品均未检出齐墩果酸，因此本发明选择齐墩果酸作为掺伪分析方法的检测指标。
本发明建立的检测方法，同时适用于铁丝威灵仙药材、饮片及制剂，在与齐墩果酸色谱峰保留时间一致的位置上均不存在干扰峰，专属性强，精密度、重复性、稳定性良好，检出限低，且具有良好的耐用性，可准确、快速地发现铁丝威灵仙药材、饮片及制剂中是否掺伪威灵仙。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
Claims (10)
1.一种铁丝威灵仙药材、饮片及制剂中掺伪威灵仙的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
提供齐墩果酸对照品溶液；
将待测样品依次进行水提和酸水解，得到供试品溶液；所述待测样品为铁丝威灵仙药材、饮片或制剂中任一种；
将所述齐墩果酸对照品溶液和供试品溶液分别进行高效液相色谱分析，得到对照品溶液色谱图和供试品溶液色谱图；
所述高效液相色谱分析的色谱条件包括：
色谱柱：填料为十八烷基硅烷键合硅胶；
流动相：A为乙腈，B为水；
梯度洗脱程序为：0～8min：A的体积比由50％上升到70％；8～23min：A的体积比由70％上升到95％；23～25min：A的体积比保持95％；
当所述供试品溶液色谱图中在与对照品溶液色谱图中齐墩果酸色谱峰保留时间一致的位置上出现色谱峰时，所述待测样品掺伪威灵仙；当所述供试品溶液色谱图中在与对照品溶液色谱图中齐墩果酸色谱峰保留时间一致的位置上不出现色谱峰时，所述待测样品不掺伪威灵仙。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述水提包括以下步骤：将所述待测样品与水混合后依次进行第一回流、冷却、固液分离和干燥，得到水提物；
所述酸水解包括以下步骤：将所述水提物与盐酸溶液混合后，依次进行第二回流和冷却，得到提取液，将所述提取液进行萃取，得到萃取液，将所述萃取液进行浓缩和复溶，得到所述供试品溶液。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述齐墩果酸对照品溶液的溶剂为甲醇，所述齐墩果酸对照品溶液的浓度为0.1～0.3mg/mL。
4.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述待测样品为铁丝威灵仙药材或饮片时，所述第一回流时，所述水与待测样品的用量比为10～100mL:1～3g；所述待测样品为以铁丝威灵仙原粉入药的制剂时，所述第一回流时，所述水与制剂中铁丝威灵仙的用量比为10～100mL:1～3g。
5.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述盐酸溶液的质量浓度为5～30％，所述盐酸溶液与待测样品的用量比为5～40mL:1～3g。
6.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述萃取的萃取剂包括乙酸乙酯，所述萃取剂的体积为提取液体积的1～5倍，所述萃取的次数为1～5次。
7.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述复溶的溶剂包括甲醇、乙腈和水中的一种或多种，所述复溶的溶剂与待测样品的用量比为5～50mL:1～3g。
8.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱分析的检测波长为205±2nm，柱温为20～40℃，流速为0.5～1.0mL/min，进样量为2～50μL。
9.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，当所述供试品溶液色谱图中在与对照品溶液色谱图中齐墩果酸色谱峰保留时间一致的位置上出现色谱峰时，还包括比较所述色谱峰的紫外-可见吸收光谱。
10.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱分析替换为液相色谱-质谱分析，得到供试品溶液的液相色谱图、对照品溶液的液相色谱图、供试品溶液的一、二级质谱图和对照品溶液的一、二级质谱图；
所述液相色谱-质谱分析的液相色谱条件包括：
色谱柱：填料为十八烷基硅烷键合硅胶；
流动相：A为体积分数0.1％的甲酸水溶液，B为乙腈；
梯度洗脱程序为：0～2min：A的体积比由50％下降到30％；2～8min：A的体积比由30％下降到5％；8～10min：A的体积比保持5％；
所述液相色谱-质谱分析的质谱条件包括：
三重四级杆质谱，离子源为ESI，负离子扫描；全扫描扫描范围m/z：350～550；子离子扫描范围m/z：50～480；CE：58V；
当所述供试品溶液的液相色谱图中在与对照品溶液的液相色谱图中齐墩果酸色谱峰保留时间一致的位置上出现色谱峰时，比较供试品溶液和对照品溶液的一、二级质谱图，若一、二级质谱图一致，则所述待测样品掺伪威灵仙；
当所述供试品溶液的液相色谱图中在与对照品溶液的液相色谱图中齐墩果酸色谱峰保留时间一致的位置上不出现色谱峰时，则所述待测样品不掺伪威灵仙。
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| 铁丝威灵仙药材、饮片及其制剂心脑静片掺伪威灵仙的检测方法研究;高妍;中国药事;20230110;25-30 * |
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| GR01 | Patent grant |