CN102125594A - 一种中药冻干注射剂中活性化合物含量的测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种中药组合物冻干注射剂中多种组分含量的测定方法，本发明中药冻干注射剂原料包括人参和淫羊藿，临床用于运动神经元疾病(肌萎缩侧索硬化症、进行性脊肌萎缩症、进行性延髓麻痹、原发性侧索硬化症)、进行性肌营养不良症、先天性肌病等疾病所致的肌肉萎缩及重症肌无力的治疗，本发明方法采用高效液相色谱串联质谱法同时定性和定量分析该中药冻干注射剂中15个活性化合物，可以用于该产品的质量控制。
Description
技术领域
本发明涉及一种中药冻干注射剂中活性化合物含量的测定方法，属于药物制剂分析技术领域。
背景技术
中药冻干注射剂在质量标准上，要求控制的项目比较多，其中，有效化合物的含量控制对中药冻干注射剂的质量控制至关重要。
CN1785223A公开了一种治疗肌肉萎缩及重症肌无力的药物及其制备方法，该专利公开了该药物的组方、制剂以及胶囊、片剂等制备方法；该专利还公开了该药物的药效学实验，证实该药物具有增强正常运动神经元活力，促进神经突起生长，又能保护兴奋性氨基酸毒性损伤运动神经元，减少细胞凋亡，在维持中枢神经系统功能，延缓病情发展，提高患者生存质量方面具有重要的临床应用价值；该专利还公开了其中人参提取物的制备方法，“取人参药材，用60-90％乙醇提取1-3次，第1次加药材8-12倍量溶剂提取1-2小时，第2次加6-10倍量溶剂提取1-2小时，第3次加6-10倍量溶剂提取0.5-1小时；合并上述提取液，趁热滤过，减压回收乙醇，并浓缩，放入不锈钢桶内，加纯水搅拌均匀，冷藏24-36h；将冷藏液取出，放至常温，板框过滤器过滤，用少量水洗涤板框，滤液加纯水稀释，备用；取人参浓缩药液通过处理好的AB-8型大孔吸附树脂柱，并分别用pH值8-9的氨水、20％乙醇、80％乙醇洗脱，收集80％乙醇洗脱液。将80％洗脱液加入纯水，配成50％醇溶液，通过中性氧化铝柱，收集洗脱液，再用少量50％乙醇洗涤柱子，合并洗脱液备用；取药液加入活性炭，回流加热，煮沸20min，趁热板框抽滤，收集滤液，浓缩，冷藏过夜；澄清板过滤，减压干燥，即得人参提取物。”该人参提取物即为人参总皂苷提取物；该专利还公开了淫羊藿提取物的提取方法，“取淫羊藿药材，加水煎煮提取2-5次，加水量为10-30倍，第一次提 取时间定为0.5-2h，以后3次为0.5-1h；合并上述提取液，趁热滤过，减压浓缩，放入不锈钢桶内，加乙醇至药液含醇浓度为70％，冷藏；过滤，滤液回收乙醇并浓缩，加水搅拌均匀，冷藏，过滤，备用；取淫羊藿药液通过处理好的AB-8型大孔吸附树脂柱，并分别用纯水、20％乙醇、50％乙醇洗脱，收集50％乙醇洗脱液；洗脱液拌入适量硅藻土混匀，用无水乙醇提取2-5次，提取液合并，回收乙醇并浓缩，浓缩液加入丙酮，并搅拌均匀，冷藏，过滤，沉淀加丙酮再同前处理2次，合并3次滤液，回收溶剂，并浓缩，减压干燥，即得淫羊藿提取物。”该淫羊藿提取物即为淫羊藿总黄酮提取物。该专利未公开冻干注射剂制备及其含量测定方法。
由CN1785223A公开的技术内容，可以看出，该中药组合物包括黄酮类和皂苷类成分。黄酮类化合物具有强的紫外吸收，而皂甙具有弱紫外吸收。由于皂苷类成分的极性较大，含量较低，采用传统的紫外或蒸发光检测器来分离和鉴定其活性成分即繁琐又耗时，因此建立一个灵敏的、选择性强的方法来同时分析皂苷和黄酮类化合物，非常必要。
本专利申请即是在CN1785223A的基础上做了进一步的研发，在研制该中药组合物的冻干注射剂的基础上，制定了活性化合物含量的测定方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种中药冻干注射剂活性化合物含量的测定方法。
本发明所述中药冻干注射剂是由如下重量份比例的原料制成：
人参总皂苷提取物30-70 淫羊藿总黄酮提取物20-60。
具有高灵敏度的液质联用，在进行中药成分分析时，可以提供化合物的多组分的同时检测有用的信息，尤其对于那些难以用传统的分析检测方法测定的微量成分，本发明采用高效液相色谱串联质谱(HPLC-MS/MS)法，通过MS1，MS2和保留规律，定性表征和定量分析了本发明所述中药冻干注射剂化合物含量的测定方法。本发明测定方法可以有效的、可靠的对本发明所述中药冻干注射剂进行质量控制，以确保其安全有效。
本发明测定方法中，液相色谱条件和质谱条件优选如下：
液相色谱条件：柱温为25℃；流动相：A为0.1％甲酸，B为乙腈；流 速为0.7mL/min；梯度：0-6分钟，16-38％B、6-15分钟，38-50％B、15-18分钟，50-95％B、18-20分钟，95-16％B；
质谱条件：负离子方式检测；源喷射电压为-4500V；雾化温度为650℃；雾化气压力为60psi；辅助气压力为65psi；气帘气压力为25psi；扫描方式为多反应监测；驻留时间均为40ms，碰撞室出口电压：-5.0V，进口电压：-10.0V。
其中液相色谱柱优选为C18反相柱，质谱条件中的雾化气、辅助气和气帘气优选为氮气。
本发明测定方法中，所述中药冻干注射剂活性化合物优选为15种，分别为：人参皂苷Rb1、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rc、人参皂苷Rd、人参皂苷Re、人参皂苷Rf、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rg2、20-(S)人参皂苷Rg3、20(R)-人参皂苷Rg3、淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和金丝桃苷。结构式如下：
人参皂苷Rb1： 人参皂苷Rb2：
人参皂苷Rc： 人参皂苷Rd：
人参皂苷Re： 人参皂苷Rf
人参皂苷Rg1： 人参皂苷Rg2：
20-(S)人参皂苷Rg3： 20(R)-人参皂苷Rg3：
淫羊藿苷： 朝藿定A：
朝藿定B： 朝藿定C：
金丝桃苷：
本发明测定方法所述中药冻干注射剂的原料重量比例优选为：
人参总皂苷提取物35 淫羊藿总黄酮提取物55。
还优选为：
人参总皂苷提取物65 淫羊藿总黄酮提取物25。
或者：
人参总皂苷提取物50 淫羊藿总黄酮提取物40。
为证实本发明方法可行性，发明人进行了如下的验证试验：
1、样品制备：
人参总皂苷提取物50克淫羊藿总黄酮提取物40克
制备方法：
a、将800克羟丙基-β-环糊精加水4000ml溶解制成20％的溶液，将淫羊藿总黄酮提取物加水750ml(5.33％)加热溶解，分次缓慢加入羟丙基-β-环糊精溶液中，保温80℃±1℃，动态搅拌包合，包合时间3小时，将人参总皂苷提取物加水100ml(50％)加热溶解，加入包合液中，继续包合1小时；
b、加水调节溶液总量至6000ml，用10％的氢氧化钠溶液调节PH到7.5，加入活性炭24克(即含活性炭0.4％)，煮沸10分钟，趁热用澄清板框过滤，滤除活性炭，再用0.22μm微孔滤膜过滤，用水定容至6000ml；
c、105℃热压灭菌30分钟，取出，放至常温，用0.22μm微孔滤膜过滤，分装至15ml西林瓶，每支6ml，半压塞，置冻干机中，-40℃预冻3小时；
d、按照预冻条件，在真空度为0.05Pa状态下，从-40℃至0℃升温升华28小时，再从0℃至30℃升温干燥4.5小时；
e、在升华和干燥的真空状态下压塞，出箱，压铝盖，灯检，包装。
2、方法学验证
2.1试剂和材料
2.2对照品溶液的制备
精密称取对照品适量，用甲醇溶解作为储备液，用50％甲醇稀释至如下浓度：人参皂苷Rb1：61.7μg/ml、人参皂苷Rb2：53.4μg/ml、人参皂苷Rc：59.7μg/ml、人参皂苷Rd：53.4μg/ml、人参皂苷Re：56.4μg/ml、人参皂苷Rf：53.3μg/ml、人参皂苷Rg1：56.6μg/ml、人参皂苷Rg2：50.1μg/ml、20-(S) 人参皂苷Rg3：35.2μg/ml、20(R)-人参皂苷Rg3：25.0μg/ml、淫羊藿苷：56.8μg/ml、朝藿定A：53.9μg/ml、朝藿定B：50.5μg/ml、朝藿定C：50.7μg/ml、金丝桃苷：25.0μg/ml。所有的对照品溶液都储存在4℃冰箱内。
2.3样品溶液的制备
精密称取10mg，置25ml量瓶中，用25％的乙腈溶解并定容至刻度，摇匀，即得。
2.4液质条件
液相条件：分析柱：Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18HPLCcolumn(Analytical 4.6*150mm 5-Micron)，柱温箱温度：25℃，流动相：0.1％甲酸(A)和乙腈(B)，流速：0.7mL/min。梯度：0-6分钟，16-38％B；6-15分钟，38-50％B，15-18分钟，50-95％B，18-20分，95-16％B；平衡6分钟，每个分析运行26分钟。
质谱条件：3200QTRAP型三重四极杆线性离子阱质谱仪与Agilent1200HPLC系统串联，离子源为电喷雾离子化源(ESI)；负离子方式检测；源喷射电压(IS)为-4500V；雾化温度为650℃；雾化气(GS1，N2)压力为60psi；辅助气(GS2，N2)压力为65psi；气帘气(CUR，N2)压力为25psi；扫描方式为多反应监测(MRM)；驻留时间均为40ms，碰撞室出口电压：-5.0V，进口电压：-10.0V，。数据系统：Analyst1.4.2(美国AB公司)。见表1。
表115种化合物的质谱参数
2.5专属性
采用按照本发明所述冻干注射剂制备过程制备的只含有辅料的的空白冻干制剂配制供试液注入液质系统，分析有无干扰峰。
2.6标准曲线，最低检测限和最低定量限
标准曲线的线性了由五个不同浓度的标准品。每个浓度重复分析三次。标准溶液注入到高效液相色谱-质谱系统的体积为20μL。最低检测限(LOD)以及定量限(最低检测限)含量信噪比分别为3和10。
2.7精密度和准确度
方法的精密度用日内和日间的变异测定。日内日间精密度以本发明所述中药冻干注射剂1天内重复分析6次的变异进行了评价。日间精密度以本发明所述中药冻干注射剂连续三天分析的变异进行了评价。
准确性用回收率试验来评价。取一定量(0.05克)已知浓度的肌萎灵样品，加入三种不同浓度(约等于0.8，1.0和1.2倍)的对照品溶液，按照样品的提取和分析方法，每个水平重复实验三次。回收率的计算公式：回收率(％)＝100％×(检测到的量-样品中的含量)/添加对照品的量。
3结果
3.115个化合物的鉴定
本发明采用LC-MS-MS方法确认的本发明所述中药冻干注射剂中活性化合物的色谱峰。可以得到化合物的准确分子质量。离子可以提供化合物本身的结构信息，其结构特点使它们通过质谱成功地鉴定出来。为了鉴定这些化合物，采用了信息相关扫描方式(IDA)的方法来同时获取MRM的信号和增强子离子扫描(EPI)扫描。目标化合物的峰，通过与对照品的质谱图和保留时间进行比较，准确无误的鉴定出来。结构和质谱碎片离子分析见表2。
表215个化合物的保留时间，分子量，质谱碎片解析
3.2专属性
空白样品的色谱中，在与对照品和本发明所述中药冻干注射剂活性化合物相应的保留时间处无干扰峰。
3.3标准曲线，最低检测限和最低定量限、精密度
被分析物的标准曲线采用最小二乘法，用峰面积与浓度的绘制，标准曲线的范围为2.50-1234ng/mL相关系数r2＞0.999。
15种化合物的最低检测限为0.25-1.23ng/mL，最低定量限为2.50-6.17ng/mL。
所有分析物的日内和日间的RSD值均小于4.52％。这些结果表明方法 具有良好精确度。
实验所得的数据如表3。
表3化合物标准曲线、检测限和定量限、精密度试验结果
3.4准确度
15个化合物的回收率范围为96.11-101.24％，RSD为1.20-4.10％。这些试验表明，建立的方法是对于本发明所述中药冻干注射剂的质量控制的可靠有效。数据见表4。
表415个化合物回收率统计结果
3.5样品分析
人参皂甙具有相同的母核，在二级质谱中会产生同样的离子碎片，如果仅根据离子对来进行测定，可能会在测定过程中互相干扰，造成测定不准确。在这个实验中，四对人参皂苷同分异构体(人参皂甙Rb2和人参皂甙Rc，人参皂苷Rd和人参皂甙Re，人参皂甙Rf和人参皂甙Rg1，人参皂苷Rg2和人参皂甙Rg3)通过调整流动相的比例使化合物完全分离并准确定量。子离子的选择考虑了离子的丰度，稳定性和各成分在肌萎灵冻干分中的含量。方法验证表明，所选择离子足够以定量分析以的要求。
采用这种分析方法分析和定量12批本发明所述中药冻干注射剂中15化 合物。每个样本进行了3次分析，平均含量总结在表5中。所有被分析的样本15个化合物的含量非常接近，RSD＜10％。所有数据表明本发明所述中药冻干注射剂的预处理工艺和制造过程是稳定和可行的。
表512批样品中15个化合物的含量测定结果
4结论
本发明建立了一种新的快速的全面分析本发明所述中药冻干注射剂的HPLC-MS/MS方法。与传统的高效液相色谱法紫外或蒸发光散射检测器相比，这种方法可以在较短的时间分离复杂的化合物。
具体实施方式
下述实施例用于举例说明本发明中药冻干注射液的制备，但其不能对本发明的范围构成任何限制。
实施例1
原料重量比例：
人参总皂苷提取物50克 淫羊藿总黄酮提取物40克
制备方法：
a、将800克羟丙基-β-环糊精加水4000ml溶解制成20％的溶液，将淫羊藿总黄酮提取物加水750ml(5.33％)加热溶解，分次缓慢加入羟丙基-β-环糊精800溶液中，保温80℃±1℃，动态搅拌包合，包合时间3小时，将人参总皂苷提取物加水100ml(50％)加热溶解，加入包合液中，继续包合1小时；
b、加水调节溶液总量至6000ml，用10％的氢氧化钠溶液调节PH到7.5，加入活性炭24克(即含活性炭0.4％)，煮沸10分钟，趁热用澄清板框过滤，滤除活性炭，再用0.22μm微孔滤膜过滤，用水定容至6000ml；
c、105℃热压灭菌30分钟，取出，放至常温，用0.22μm微孔滤膜过滤，分装至15ml西林瓶，每支6ml，半压塞，置冻干机中，-40℃预冻3小时；
d、按照预冻条件，在真空度为0.05Pa状态下，从-40℃至0℃升温升华28小时，再从0℃至30℃升温干燥4.5小时；
e、在升华和干燥的真空状态下压塞，出箱，压铝盖，灯检，包装。
检测方法：
对照品溶液的制备
精密称取对照品适量，用甲醇溶解作为储备液，用50％甲醇稀释至如下浓度：人参皂苷Rb1：61.7μg/ml、人参皂苷Rb2：53.4μg/ml、人参皂苷Rc：59.7μg/ml、人参皂苷Rd：53.4μg/ml、人参皂苷Re：56.4μg/ml、人参皂苷Rf：53.3μg/ml、人参皂苷Rg1：56.6μg/ml、人参皂苷Rg2：50.1μg/ml、20-(S)人参皂苷Rg3：35.2μg/ml、20(R)-人参皂苷Rg3：25.0μg/ml、淫羊藿苷：56.8μg/ml、朝藿定A：53.9μg/ml、朝藿定B：50.5μg/ml、朝藿定C：50.7μg/ml、金丝桃苷：25.0μg/ml。所有的对照品溶液都储存在4℃冰箱内。
样品溶液的制备
精密称取0.1g，置25ml量瓶中，用25％的乙腈溶解并定容至刻度，摇匀。精密吸取1ml，用25％的乙腈稀释50倍，即得。
液质条件
液相条件：分析柱：Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18HPLCcolumn(Analytical 4.6*150mm 5-Micron)，柱温箱温度：25℃，流动相：0.1％甲酸(A)和乙腈(B)，流速：0.7mL/min。梯度：0-6分钟，16-38％B；6-15分钟，38-50％B，15-18分钟，50-95％B，18-20分，95-16％B；平衡6分钟，每个分析运行26分钟。
质谱条件：3200QTRAP型三重四极杆线性离子阱质谱仪与Agilent1200HPLC系统串联，离子源为电喷雾离子化源(ESI)；负离子方式检测；源喷射电压(IS)为-4500V；雾化温度为650℃；雾化气(GS1，N2)压力为60psi；辅助气(GS2，N2)压力为65psi；气帘气(CUR，N2)压力为25psi；扫描方式为多反应监测(MRM)；驻留时间均为40ms，碰撞室出口电压：-5.0V，进口电压：-10.0V，。
检测结果：
人参皂苷Rb1：8.7183mg/g、人参皂苷Rb2：5.1294mg/g、人参皂苷Rc
6.2045mg/g、人参皂苷Rd：1.9944mg/g、人参皂苷Re：3.1395mg/g、人参皂苷Rf：1.5830mg/g、人参皂苷Rg1：5.0362mg/g、人参皂苷Rg2：0.8494mg/g、20(S)-人参皂苷Rg31.0039、20(R)-人参皂苷Rg3：0.5632mg/g、淫羊藿苷：11.0345、朝藿定A：1.2940mg/g、朝藿定B：1.2126mg/g、 朝藿定C：4.5862mg/g、金丝桃甘0.0862mg/g。
实施例2
原料重量比例：
人参总皂苷提取物35克 淫羊藿总黄酮提取物55克
制备方法：
a、将900克羟丙基-β-环糊精加水3000ml溶解制成30％的溶液，将淫羊藿总黄酮提取物加水1800ml(3.11％)溶解，分次缓慢加入羟丙基-β-环糊精溶液中，保温50±1℃，动态搅拌包合，包合时间8小时，将人参总皂苷提取物加水105ml(33.3％)加热溶解，加入包合液中，继续包合2小时；
b、加水调节溶液总量至6000ml，用20％的氢氧化钠溶液调节PH到6.2，加入活性炭6克(含活性炭0.1％)，煮沸10分钟，趁热用砂滤棒过滤，滤除活性炭，再用0.22μm微孔滤膜过滤，用水定容至6000ml；
c、105℃热压灭菌15分钟，取出，放至常温，用0.22μm微孔滤膜过滤，分装至10ml西林瓶，每支6ml，半压塞，置冻干机中，-20℃预冻5小时；
d、按照预冻条件，在真空度为0.5Pa状态下，从预冻温度至0℃升温升华35小时，再从0℃至30℃升温干燥8小时；
e、在升华和干燥的真空状态下压塞，出箱，压铝盖，灯检，包装。
检测方法：
对照品溶液的制备
精密称取对照品适量，用甲醇溶解作为储备液，用50％甲醇稀释至如下浓度：人参皂苷Rb1：60.8μg/ml、人参皂苷Rb2：52.9μg/ml、人参皂苷Rc：58.9μg/ml、人参皂苷Rd：54.7μg/ml、人参皂苷Re：55.5μg/ml、人参皂苷Rf：54.2μg/ml、人参皂苷Rg1：58.1μg/ml、人参皂苷Rg2：51.31μg/ml、20-(S)人参皂苷Rg3：34.8μg/ml、20(R)-人参皂苷Rg3：28.9μg/ml、淫羊藿苷：57.1μg/ml、朝藿定A：54.4μg/ml、朝藿定B：51.7μg/ml、朝藿定C：51.2μg/ml、金丝桃苷：23.9μg/ml。所有的对照品溶液都储存在4℃冰箱内。
样品溶液的制备
精密称取0.1g，置25ml量瓶中，用25％的乙腈溶解并定容至刻度，摇匀。精密吸取1ml，用25％的乙腈稀释50倍，即得。
液质条件
液相条件：分析柱：Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C 18HPLCcolumn(Analytical 4.6*150mm 5-Micron)，柱温箱温度：25℃，流动相：0.1％甲酸(A)和乙腈(B)，流速：0.7mL/min。梯度：0-6分钟，16-38％B；6-15分钟，38-50％B，15-18分钟，50-95％B，18-20分，95-16％B；平衡6分钟，每个分析运行26分钟。
质谱条件：3200QTRAP型三重四极杆线性离子阱质谱仪与Agilent1200HPLC系统串联，离子源为电喷雾离子化源(ESI)；负离子方式检测；源喷射电压(IS)为-4500V；雾化温度为650℃；雾化气(GS1，N2)压力为60psi；辅助气(GS2，N2)压力为65psi；气帘气(CUR，N2)压力为25psi；扫描方式为多反应监测(MRM)；驻留时间均为40ms，碰撞室出口电压：-5.0V，进口电压：-10.0V，。
检测结果：
人参皂苷Rb1：7.6384mg/g、人参皂苷Rb2：4.9921mg/g、人参皂苷Rc
5.1238mg/g、人参皂苷Rd：1.7364mg/g、人参皂苷Re：3.0512mg/g、人参皂苷Rf：1.3117mg/g、人参皂苷Rg1：4.8128mg/g、人参皂苷Rg2：0.72.3mg/g、20(S)-人参皂苷Rg30.9511、20(R)-人参皂苷Rg3：0.4927mg/g、淫羊藿苷：11.2915、朝藿定A：1.3185mg/g、朝藿定B：1.3961mg/g、朝藿定C：4.9925mg/g、金丝桃甘0.0987mg/g。
实施例3
原料重量比例：
人参总皂苷提取物65克 淫羊藿总黄酮提取物25克
制备方法：
a、将650克羟丙基-β-环糊精加水4000溶解制成16.3％的溶液，将淫羊藿总黄酮提取物加水250ml(10％)加热溶解，分次缓慢加入羟丙基-β-环糊精溶液中，保温90℃±1℃，动态搅拌包合，包合时间3小时，将人参总皂苷提取物加水130ml(50％)加热溶解，加入包合液中，继续包合1小时；
b、加水调节溶液总量至6000ml，用5％的氢氧化钠溶液调节PH到8.5， 加入活性炭30克(含活性炭0.5％)，煮沸6分钟，趁热抽滤，滤除活性炭，再用0.22μm微孔滤膜过滤，用水定容至6000ml；
c、105℃热压灭菌10分钟，取出，放至常温，用0.22μm微孔滤膜过滤，分装至西林瓶，每支6ml，半压塞，置冻干机中，-30℃预冻4.5小时；
d、按照预冻条件，在真空度为0.1Pa状态下，从预冻温度至0℃升温升华25小时，再从0℃至30℃升温干燥6小时；
e、在升华和干燥的真空状态下压塞，出箱，压铝盖，灯检，包装。
检测方法：
对照品溶液的制备
精密称取对照品适量，用甲醇溶解作为储备液，用50％甲醇稀释至如下浓度：人参皂苷Rb1：62.3μg/ml、人参皂苷Rb2：54.7μμg/ml、人参皂苷Rc：61.3μg/ml、人参皂苷Rd：54.1μg/ml、人参皂苷Re：57.5μg/ml、人参皂苷Rf：54.6μg/ml、人参皂苷Rg1：57.9μμg/ml、人参皂苷Rg2：51.3μg/ml、20-(S)人参皂苷Rg3：36.9μg/ml、20(R)-人参皂苷Rg3：26.1μg/ml、淫羊藿苷：55.1μg/ml、朝藿定A：52.1μg/ml、朝藿定B：49.4μg/ml、朝藿定C：49.1μg/ml、金丝桃苷：23.7μg/ml。所有的对照品溶液都储存在4℃冰箱内。
样品溶液的制备
精密称取0.1g，置25ml量瓶中，用25％的乙腈溶解并定容至刻度，摇匀。精密吸取1ml，用25％的乙腈稀释50倍，即得。
液质条件
液相条件：分析柱：Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18HPLCcolumn(Analytical 4.6*150mm 5-Micron)，柱温箱温度：25℃，流动相：0.1％甲酸(A)和乙腈(B)，流速：0.7mL/min。梯度：0-6分钟，16-38％B；6-15分钟，38-50％B，15-18分钟，50-95％B，18-20分，95-16％B；平衡6分钟，每个分析运行26分钟。
质谱条件：3200QTRAP型三重四极杆线性离子阱质谱仪与Agilent1200HPLC系统串联，离子源为电喷雾离子化源(ESI)；负离子方式检测；源喷射电压(IS)为-4500V；雾化温度为650℃；雾化气(GS1，N2)压力为60psi；辅助气(GS2，N2)压力为65psi；气帘气(CUR，N2)压力为 25psi；扫描方式为多反应监测(MRM)；驻留时间均为40ms，碰撞室出口电压：-5.0V，进口电压：-10.0V，。
检测结果：
人参皂苷Rb1：9.1387mg/g、人参皂苷Rb2：7.3877mg/g、人参皂苷Rc
8.1237mg/g、人参皂苷Rd：2.1038mg/g、人参皂苷Re：3.7399mg/g、人参皂苷Rf：1.6151mg/g、人参皂苷Rg1：5.9322mg/g、人参皂苷Rg2：0.9527mg/g、20(S)-人参皂苷Rg31.1587、20(R)-人参皂苷Rg3：0.6037mg/g、淫羊藿苷：10.0874、朝藿定A：1.0347mg/g、朝藿定B：1.0018mg/g、朝藿定C：4.0128mg/g、金丝桃甘0.07122mg/g。
实施例4
原料重量比例：
人参总皂苷提取物45克 淫羊藿总黄酮提取物35克
制备方法：
a、将700克羟丙基-β-环糊精加水2800ml溶解制成25％的溶液，将淫羊藿总黄酮提取物加水1000ml(3.5％)溶解，分次缓慢加入羟丙基-β-环糊精溶液中，保温60℃±1℃，动态搅拌包合，包合时间4小时，将人参总皂苷提取物加水150ml(30％)加热溶解，加入包合液中，继续包合1.5小时；
b、加水调节溶液总量至6000ml，用15％的氢氧化钠溶液调节PH到6，加入活性炭18克(含活性炭0.3％)，煮沸25分钟，趁热滤除活性炭，再用0.22μm微孔滤膜过滤，用水定容至6000ml；
c、105℃热压灭菌20分钟，取出，放至常温，用0.22μm微孔滤膜过滤，分装至西林瓶，每支6ml，半压塞，置冻干机中，-25℃预冻4小时；
d、按照预冻条件，在真空度为0.45Pa状态下，从预冻温度至0℃升温升华30小时，再从0℃至30℃升温干燥6.5小时；
e、在升华和干燥的真空状态下压塞，出箱，压铝盖，灯检，包装。
检测方法：
对照品溶液的制备
精密称取对照品适量，用甲醇溶解作为储备液，用50％甲醇稀释至如下 浓度：人参皂苷Rb1：62.8μg/ml、人参皂苷Rb2：50.5μg/ml、人参皂苷Rc：63.27μg/ml、人参皂苷Rd：51.7μg/ml、人参皂苷Re：59.7μg/ml、人参皂苷Rf：52.3μg/ml、人参皂苷Rg1：58.6μg/ml、人参皂苷Rg2：48.2μg/ml、20-(S)人参皂苷Rg3：37.3μg/ml、20(R)-人参皂苷Rg3：23.8μg/ml、淫羊藿苷：58.9μg/ml、朝藿定A：51.8μg/ml、朝藿定B：57.8μg/ml、朝藿定C：47.5μg/ml、金丝桃苷：23.6μg/ml。所有的对照品溶液都储存在4℃冰箱内。
样品溶液的制备
精密称取0.1g，置25ml量瓶中，用25％的乙腈溶解并定容至刻度，摇匀。精密吸取1ml，用25％的乙腈稀释50倍，即得。
液质条件
液相条件：分析柱：Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18HPLCcolumn(Analytical 4.6*150mm 5-Micron)，柱温箱温度：25℃，流动相：0.1％甲酸(A)和乙腈(B)，流速：0.7mL/min。梯度：0-6分钟，16-38％B；6-15分钟，38-50％B，15-18分钟，50-95％B，18-20分，95-16％B；平衡6分钟，每个分析运行26分钟。
质谱条件：3200QTRAP型三重四极杆线性离子阱质谱仪与Agilent1200HPLC系统串联，离子源为电喷雾离子化源(ESI)；负离子方式检测；源喷射电压(IS)为-4500V；雾化温度为650℃；雾化气(GS1，N2)压力为60psi；辅助气(GS2，N2)压力为65psi；气帘气(CUR，N2)压力为25psi；扫描方式为多反应监测(MRM)；驻留时间均为40ms，碰撞室出口电压：-5.0V，进口电压：-10.0V，。
检测结果：
人参皂苷Rb 1：8.1635mg/g、人参皂苷Rb2：4.8325mg/g、人参皂苷Rc
6.1569mg/g、人参皂苷Rd：1.7243mg/g、人参皂苷Re：2.9438mg/g、人参皂苷Rf：1.4876mg/g、人参皂苷Rg1：4.8257mg/g、人参皂苷Rg2：0.7451mg/g、20(S)-人参皂苷Rg30.9453、20(R)-人参皂苷Rg3：0.5521mg/g、淫羊藿苷：10.8564、朝藿定A：1.1528mg/g、朝藿定B：1.1832mg/g、朝藿定C：4.3726mg/g、金丝桃甘0.0725mg/g。
实施例5
原料重量比例：
人参总皂苷提取物60 淫羊藿总黄酮提取物50 羟丙基-β-环糊精700
制备方法：
a、将羟丙基-β-环糊精加水4000ml溶解制成17.5％的溶液，将淫羊藿总黄酮提取物加水1500(3.33％)溶解，分次缓慢加入羟丙基-β-环糊精溶液中，保温85℃，动态搅拌包合，包合时间8小时，将人参总皂苷提取物加水150ml(40％)溶解，加入包合液中，继续包合1小时；
b、加水调节溶液总量至6000ml，用8％的氢氧化钠溶液调节PH到7.5，加入活性炭24克(含活性炭0.4％)，煮沸10分钟，趁热滤除活性炭，再用0.22μm微孔滤膜过滤，用水定容至6000ml；
c、105℃热压灭菌30分钟，取出，放至常温，用0.22μm微孔滤膜过滤，分装至西林瓶，每支6ml，半压塞，置冻干机中，-35℃预冻3.5小时；
d、按照预冻条件，在真空度为0.05Pa状态下，从预冻温度至0℃升温升华35小时，再从0℃至30℃升温干燥8小时；
e、在升华和干燥的真空状态下压塞，出箱，压铝盖，灯检，包装。
检测方法：
对照品溶液的制备
精密称取对照品适量，用甲醇溶解作为储备液，用50％甲醇稀释至如下浓度：人参皂苷Rb1：63.2μg/ml、人参皂苷Rb2：58.6μg/ml、人参皂苷Rc：58.7μg/ml、人参皂苷Rd：52.1μg/ml、人参皂苷Re：54.3μg/ml、人参皂苷Rf：52.7μg/ml、人参皂苷Rg1：58.2μg/ml、人参皂苷Rg2：48.5μg/ml、20-(S)人参皂苷Rg3：37.3μg/ml、20(R)-人参皂苷Rg3：23.6μg/ml、淫羊藿苷：57.5μg/ml、朝藿定A：55.2μg/ml、朝藿定B：52.7μg/ml、朝藿定C：48.6μg/ml、金丝桃苷：26.3μg/ml。所有的对照品溶液都储存在4℃冰箱内。
样品溶液的制备
精密称取0.1g，置25ml量瓶中，用25％的乙腈溶解并定容至刻度，摇匀。精密吸取1ml，用25％的乙腈稀释50倍，即得。
液质条件
液相条件：分析柱：Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18HPLCcolumn(Analytical 4.6*150mm 5-Micron)，柱温箱温度：25℃，流动相：0.1％甲酸(A)和乙腈(B)，流速：0.7mL/min。梯度：0-6分钟，16-38％B；6-15分钟，38-50％B，15-18分钟，50-95％B，18-20分，95-16％B；平衡6分钟，每个分析运行26分钟。
质谱条件：3200QTRAP型三重四极杆线性离子阱质谱仪与Agilent1200HPLC系统串联，离子源为电喷雾离子化源(ESI)；负离子方式检测；源喷射电压(IS)为-4500V；雾化温度为650℃；雾化气(GS1，N2)压力为60psi；辅助气(GS2，N2)压力为65psi；气帘气(CUR，N2)压力为25psi；扫描方式为多反应监测(MRM)；驻留时间均为40ms，碰撞室出口电压：-5.0V，进口电压：-10.0V，。
检测结果：
人参皂苷Rb1：9.0352mg/g、人参皂苷Rb2：5.9651mg/g、人参皂苷Rc
7.3265mg/g、人参皂苷Rd：2.5316mg/g、人参皂苷Re：4.0268mg/g、人参皂苷Rf：2.5406mg/g、人参皂苷Rg1：6.1234mg/g、人参皂苷Rg2：1.5367mg/g、20(S)-人参皂苷Rg31.8816、20(R)-人参皂苷Rg3：0.9634mg/g、淫羊藿苷：10.1253、朝藿定A：1.0168mg/g、朝藿定B：1.059mg/g、朝藿定C：3.9684mg/g、金丝桃甘0.0529mg/g。
Claims (8)
1.一种中药冻干注射剂中活性化合物含量的测定方法，该中药冻干注射剂是由30-70重量份的人参总皂苷提取物和20-60重量份的淫羊藿总黄酮提取物制成，其特征在于该方法采用高效液相色谱串联质谱法。
2.根据权利要求1所述测定方法，其特征在于所述高效液相色谱串联质谱法的色谱条件为：
液相色谱条件：柱温为25℃；流动相：A为0.1％甲酸，B为乙腈；流速为0.7mL/min；梯度：0-6分钟，16-38％B、6-15分钟，38-50％B、15-18分钟，50-95％B、18-20分钟，95-16％B；
质谱条件：负离子方式检测；源喷射电压为-4500V；雾化温度为650℃；雾化气压力为60psi；辅助气压力为65psi；气帘气压力为25psi；扫描方式为多反应监测；驻留时间均为40ms，碰撞室出口电压-5.0V：进口电压-10.0V。
3.根据权利要求2所述的测定方法，其特征在于所述液相条件中色谱柱采用C18反相柱。
4.根据权利要求2所述的测定方法，其特征在于所述质谱条件中雾化气、辅助气和气帘气均为氮气。
5.根据权利要求1-4任一项所述的测定方法，其特征在于所述活性化合物为15种，分别为人参皂苷Rb1、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rc、人参皂苷Rd、人参皂苷Re、人参皂苷Rf、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rg2、20-(S)人参皂苷Rg3、20(R)-人参皂苷Rg3、淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和金丝桃苷。
6.根据权利要求1-4任一项所述的测定方法，其特征在于所述中药冻干注射剂原料的重量比例如下：
人参总皂苷提取物35 淫羊藿总黄酮提取物55。
7.根据权利要求1-4任一项所述的测定方法，其特征在于所述中药冻干注射剂原料的重量比例如下：
人参总皂苷提取物65 淫羊藿总黄酮提取物25。
8.根据权利要求1-4任一项所述的测定方法，其特征在于所述中药冻干注射剂原料的重量比例如下：
人参总皂苷提取物50 淫羊藿总黄酮提取物40。
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