WO2022092919A1 - 신규한 비피도박테리움 롱검 z1 균주 및 이의 용도 - Google Patents

신규한 비피도박테리움 롱검 z1 균주 및 이의 용도 Download PDF

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WO2022092919A1
WO2022092919A1 PCT/KR2021/015482 KR2021015482W WO2022092919A1 WO 2022092919 A1 WO2022092919 A1 WO 2022092919A1 KR 2021015482 W KR2021015482 W KR 2021015482W WO 2022092919 A1 WO2022092919 A1 WO 2022092919A1
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strain
bifidobacterium longum
lactic acid
mgo
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PCT/KR2021/015482
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김선여
김동현
백현만
홍성민
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엠테라파마 주식회사
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    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales

Definitions

  • the present invention relates to a novel Bifidobacterium longum Z1 strain useful for the prevention or treatment of Irritable Bowel Syndrome (IBS), Inflammatory Bowel Disease (IBD), liver disease and brain disease, and uses thereof will be.
  • IBS Irritable Bowel Syndrome
  • IBD Inflammatory Bowel Disease
  • liver disease liver disease and brain disease, and uses thereof will be.
  • Brain diseases such as dementia refer to a syndrome in which the ability to remember and think gradually declines due to neurodegeneration to the extent that it affects daily life. Brain disease is emerging as one of the major causes of medical, economic, and social burden as we enter an aging society. The prevalence of dementia is estimated to be about 7% (The global prevalence of dementia: a systematic review and metaanalyisis, Alzheimers Dement, 2013, 63-75).
  • diabetes an acquired factor
  • increases the risk of these diseases Insulin metabolism and the risk of Alzheimer diseases: the Rotterdam Study, Neurology, 2010, 1982-1987.
  • type 2 diabetes mellitus patients have a 1.4 to 2.4-fold increase in the risk of cognitive decline or dementia, and the older they are, the higher the risk of dementia due to diabetes (Cognitive dysfunction and dementia) diabetes mellitus, Endocrine Reviews, 2008, 494-511; Biochemistry and molecular cell biology of diabetic complications, Nature, 2001, 235-239).
  • ROS reactive oxygen species
  • the final glycation products are reducing sugars (glucose, fructose, glyceraldehyde, etc.) and carbonyl compounds (glyoxal, methylglyoxal, acetaldehyde) )), etc.), is generated by the Maillard reaction between the ketone or aldehyde group and the amino group of proteins (albumin, fibrinogen, collagen, hemoglobin, etc.) to reduce oxidative stress.
  • Serum levels of toxic AGEs may be a promising novel biomarker in development and progression of NASH, Medical Hypotheses, 2015, 490-493).
  • glyoxal glyceraldehyde
  • GA glyceraldehyde
  • MGO methylglyoxal
  • Probiotics are living microorganisms that have a beneficial effect on the health of the host by improving the intestinal microbial environment.
  • lactic acid bacteria When ingested into the body, lactic acid bacteria are used as probiotics because they play a role in contributing to important nutrients by decomposing fiber and complex proteins while coexisting with the digestive system. It has been reported that lactic acid bacteria exhibit effects such as maintenance and improvement of intestinal flora, antidiabetic effect, colitis suppression and immune system improvement (Prophylactic and therapeutic uses of probiotics: a review. Journal of the American Dietetic Association, 2001, 101(2) ), 229-241). Research to develop lactic acid bacteria with these various physiologically active effects and use them as materials for pharmaceuticals or health functional foods is being actively conducted (Republic of Korea Patent Publication No.
  • the expression of the terminal glycation product receptor (RAGE) is increased in the blood vessels near the area where Aß is deposited, and the final glycosylation It can be found that the distribution of product receptors (RAGE) is shifted from neurons to microvasculature.
  • the final glycosylation receptor (RAGE) is a primary transporter that transports Aß in the blood to brain tissue through the blood-brain barrier, and affects Aß metabolism.
  • oxidative stress and inflammatory response which are thought to be part of the pathogenesis of insulin resistance and type 2 diabetes, are related to Aß metabolism.
  • mitochondrial dysfunction and related dysregulation of calcium homeostasis affect the processing of amyloid precursor protein or the production of Aß.
  • 10-1899234 discloses a fir extract for the treatment of diabetic complications, which is a disease related to final glycated products
  • Korean Patent Laid-Open No. 10-2018-0024825 discloses homoisos having inhibitory activity and crushing activity of final glycated products. Flavonoid compounds are disclosed.
  • the present invention has completed the present invention by isolating and identifying Bifidobacterium longum Z1, a novel strain having the effect of crushing the final glycated product, and confirming its activity.
  • Patent Document 0001 Republic of Korea Patent Registration No. 10-1476236
  • Patent Document 0002 Republic of Korea Patent Registration No. 10-1087972
  • Patent Document 0003 Republic of Korea Patent No. 10-1899234
  • Patent Document 0004 Republic of Korea Patent Publication No. 10-2018-0024825
  • Non-patent document 0001 The global prevalence of dementia: a systematic review and metaanalyisis, Alzheimers Dement, 2013, 63-75.
  • Non-Patent Document 0002 Insulin metabolism and the risk of Alzheimer diseases: the Rotterdam Study, Neurology, 2010, 1982-1987.
  • Non-Patent Document 0003 Cognitive dysfunction and diabetes mellitus, Endocrine Reviews, 2008, 494-511; Biochemistry and molecular cell biology of diabetic complications, Nature, 2001, 235-239.
  • Non-Patent Document 0004 Processing of Alzheimer's amyloid precursor protein during H2O2-induced apoptosis in human neuronal cells, 1997, Biochemical and Biophysical Research Communications, 845-848.
  • Non-Patent Document 0005 Serum levels of toxic AGEs (TAGE) may be a promising novel biomarker in development and progression of NASH, Medical Hypotheses, 2015, 490-493.
  • Non-Patent Document 0006 Gut/brain axis and the microbiota. The Journal of clinical investigation, 2015, 125(3), 926-938.
  • Non-Patent Document 0007 Oral administration of Proteus mirabilis damages dopaminergic neurons and motor functions in mice. Scientific reports, 2018, 8(1), 1275.
  • Non-Patent Document 0008 Prophylactic and therapeutic uses of probiotics: a review. Journal of the American Dietetic Association, 2001, 101(2), 229-241.
  • Another object of the present invention is Bifidobacterium longum Z1 (Accession No. KCCM12660P) strain, its live cells, its dead cells, its culture, its lysate, its extract, its natural product or irritable bowel syndrome, inflammatory To provide a pharmaceutical composition for preventing or treating intestinal disease, liver disease, or brain disease.
  • Another object of the present invention is Bifidobacterium longum Z1 (Accession No. KCCM12660P) strain, its live cell, its dead cell, its culture, its lysate, its extract, its natural product or irritable bowel syndrome comprising a compound thereof, To provide a food composition for preventing or improving inflammatory bowel disease, liver disease or brain disease.
  • Bifidobacterium longum Z1 accesion No. KCCM12660P
  • Irritable bowel syndrome Irritable bowel syndrome, inflammatory bowel disease, liver disease, or To provide an enteric composition for preventing or improving brain diseases.
  • Irritable bowel syndrome Irritable bowel syndrome, inflammatory bowel disease, liver disease, or To provide a probiotic composition for preventing or improving brain diseases.
  • Irritable bowel syndrome Irritable bowel syndrome, inflammatory bowel disease, liver disease, or To provide a composition for feed for preventing or improving brain diseases.
  • Irritable bowel syndrome Irritable bowel syndrome, inflammatory bowel disease, liver disease, or To provide a fermented product for preventing or improving brain diseases.
  • the present invention provides a Bifidobacterium longum Z1 (Accession No. KCCM12660P) strain.
  • the Bifidobacterium longum Z1 strain of the present invention is characterized as a novel lactic acid bacterium of Bifidobacterium longum isolated and identified from human feces.
  • the 16S rDNA nucleotide sequence for identification and classification of the Bifidobacterium longum Z1 strain of the present invention is the same as SEQ ID NO: 1 attached to the present specification. Accordingly, the Bifidobacterium longum Z1 strain of the present invention may include 16S rDNA of SEQ ID NO: 1.
  • Bifidobacterium longum Bifidobacterium longum , named Bifidobacterium longum Z1, and deposited at the Korea Microbial Conservation Center on January 20, 2020 (Accession No. KCCM12660P).
  • the Bifidobacterium longum Z1 strain of the present invention is a gram-positive bacterium, and the cell type is bacilli. More specific physiological properties of the Bifidobacterium longum Z1 strain can be analyzed according to a conventional method in the art. Specifically, the Bifidobacterium longum Z1 strain is L-arabinose, D-ribose, D-xylose, D-galactose, D-glucose, D-fructose, mannitol, sorbitol, ⁇ -methyl as a carbon source. -D-glucoside, esculin, salicin, maltose, lactose, melibiose, sucrose, raffinose and D-turanose can be used.
  • the present invention provides Irritable Bowel Syndrome (IBS) comprising a Bifidobacterium longum Z1 (Accession No. KCCM12660P) strain or a mixture thereof, It provides a pharmaceutical composition for preventing or treating inflammatory bowel disease (IBD), liver disease, or brain disease.
  • IBS Irritable Bowel Syndrome
  • Bifidobacterium longum Z1 Bifidobacterium longum Z1 strain
  • the Bifidobacterium longum Z1 strain included in the pharmaceutical composition of the present invention may be a live cell thereof, a dead cell thereof, a culture thereof, a lysate thereof, an extract thereof, a natural product thereof or a compound thereof, but irritable bowel syndrome, It can be used without limitation as long as it is a form that can achieve the preventive or therapeutic effect of inflammatory bowel disease, liver disease, or brain disease.
  • culture means a thing obtained by culturing lactic acid bacteria in a known liquid medium or solid medium, and in the present invention, it is a concept including novel lactic acid bacteria.
  • the liver disease may be selected from the group consisting of non-alcoholic fatty liver, non-alcoholic steatohepatitis, cirrhosis and liver cancer, but is not limited thereto.
  • brain diseases include Alzheimer's disease, Huntington's disease, vascular dementia, Parkinson's disease, Lou Gehrig's disease, Creutzfeldt-Jakob disease, dementia due to head injury, learning disability, mild cognitive impairment, Pick's disease, aphasia, forgetfulness, aphasia, apraxia and It may be selected from the group consisting of delirium, but is not limited thereto.
  • the lactic acid bacteria according to the present invention exhibit shredding efficacy against MGO-AGEs or GO-AGEs, which are final glycation products.
  • the term “efficacy of breaking down final glycated products” refers to the efficacy of directly breaking up the cross-linked final glycated products prepared by saccharifying intermediate products, methylglyoxal (MGO) or glyoxal (GO) together with albumin. means As such, it is possible to confirm the effect of concentration-dependent disruption of the Bifidobacterium longum Z1 strain on MGO-AGEs or GO-AGEs.
  • the lactic acid bacteria according to the present invention may have the activity of crushing the final saccharification product.
  • the inflammatory response was significantly inhibited when the Bifidobacterium longum Z1 strain was treated with lipopolysaccharide, which is an inflammatory response inducer, in macrophages isolated from mice.
  • the pharmaceutical composition comprising the Bifidobacterium longum Z1 strain can be usefully used for the prevention and treatment of inflammatory diseases.
  • the lactic acid bacteria according to the present invention inhibits methylglyoxal (MGO), which is an intermediate product of the final glycosylation product, in a mouse neuroblastoma cell line, thereby increasing the neuronal survival rate, and increasing lactate dehydrogenase (lactate dehydrogenase, lactate dehydrogenase, LDH) and reactive oxygen species (ROS) production amount is reduced, thereby showing a protective effect on brain neurons.
  • MGO methylglyoxal
  • lactate dehydrogenase lactate dehydrogenase, lactate dehydrogenase, LDH
  • ROS reactive oxygen species
  • apoptosis-related proteins such as AKT, Bax, Bcl-2, Cytochrome C, and Caspase-3 are involved in neuroprotection, and the degree of neuronal protection can be confirmed through the expression level of these proteins.
  • the lactic acid bacteria according to the present invention can regulate the expression of the brain protein related to neuronal protection.
  • the lactic acid bacteria according to the present invention regulates the mitogen-activated protein kinase (MAPK) signaling pathway, which plays an important role in the inflammatory response in cells, and reduces the expression level of NF- ⁇ B, a nuclear transcription factor. can do it It activates NF- ⁇ B through the intracellular signaling system and promotes the expression of inflammatory cytokines, iNOS, and COX-2.
  • MAPK mitogen-activated protein kinase
  • NF- ⁇ B is known to play an important role in regulating inflammation as it is closely related to the mitogen-activated protein kinase (MAPK) signaling system belonging to ERK1/2, p38, and JNK (Suppression of MAPK and NF- ⁇ B Pathways by limonene contributes to attenuation of lipopolysaccharide-induced inflammatory responses in acute lung injury. Inflammation, 2013, 36, 501-511).
  • MAPK mitogen-activated protein kinase
  • the lactic acid bacteria according to the present invention increase glyoxalase 1 (Glo-1) and 2 (Glo-2) activity, and protection of cells induced by oxidative damage from methylglyoxal (MGO) It can increase the expression of nuclear factor E2-related factor 2 (Nrf2) and heme oxygenase-1 (HO-1) related to the protein.
  • Glo-1 glyoxalase 1
  • Nrf2 nuclear factor E2-related factor 2
  • HO-1 heme oxygenase-1
  • the term "glyoxalase” refers to a detoxification enzyme system that converts reactive oxo-aldehydes such as methylglyoxal (MGO), a byproduct of normal metabolism, into lactic acid, glycolic acid, etc.
  • Glo-1 and Glo-2 Metalglyoxal, the foe and friend of glyoxalase and Trx/TrxR systems in HT22 nerve cells. Free Radical Biology and Medicine, 2015, 89, 8-19). Therefore, the higher the activity of Glo-1 and Glo-2, the higher the ability to detoxify glucose.
  • lactic acid bacteria were orally administered to mice for 7 weeks, plasma, small intestine, large intestine, liver and brain tissues were collected, and the concentration of methylglyoxal (MGO), an intermediate product of the final glycated product, was measured by HPLC method. As a result, it was confirmed that the group orally administered with 1 x 10 9 cfu/kg of lactic acid bacteria had the effect of reducing methylglyoxal (MGO) in plasma, liver and brain tissues compared to the control group.
  • MGO methylglyoxal
  • the lactic acid bacteria according to the present invention increase glyoxalase 1 (Glo-1) and 2 (Glo-2) activity in liver tissue compared to the normal control, and oxidative damage is induced from methylglyoxal (MGO). It can increase the expression level of nuclear factor E2-related factor 2 (Nrf2) and heme oxygenase-1 (HO-1) proteins, which are related to cell protection.
  • Glo-1 glyoxalase 1
  • MGO methylglyoxal
  • Nrf2 nuclear factor E2-related factor 2
  • HO-1 heme oxygenase-1
  • the lactic acid bacteria according to the present invention can increase the expression level of neurotrophic growth factor (NGF) and brain-derived neurotrophic factor (BDNF) compared to the control group.
  • Neurotrophic factor regulates the survival and differentiation of neurons during the development process, and affects functions such as maintenance of neural structures and release of neurotransmitters during the lifetime of an individual (Neuroprotection from diazinon-induced toxicity in differentiating murine) N2a neuroblastoma cells. Neurotoxicology, 2009, 30(6), 958-964).
  • Examples of such neurotrophic factors include neurotrophic growth factor (NGF), brain-derived neurotrophic factor (BDNF), and the like.
  • Neurotrophic growth factor (NGF) is an important protein for the survival, maintenance, and growth of a specific neuron.
  • Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) is known to exist in various forms in the nervous system, and it also affects the expression of brain proteins such as cAMP-responsive element binding (CREB), a nerve regeneration factor.
  • BDNF Brain-derived neurotrophic factor
  • CREB cAMP-responsive element binding
  • the lactic acid bacteria according to the present invention can increase the expression of neurotrophic factors and the brain proteins related to nerve regeneration.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further include an appropriate carrier, excipient or diluent commonly used in the preparation of the pharmaceutical composition.
  • the present invention also provides a food composition for preventing or improving irritable bowel syndrome, inflammatory bowel disease, liver disease, and brain disease comprising lactic acid bacteria as an active ingredient.
  • the food composition may also be used to improve memory and learning ability.
  • the food composition of the present invention can be ingested on a daily basis, it is very useful because it can be expected to prevent or improve cognitive dysfunction and neuroinflammation.
  • the food composition of the present invention includes the form of pills, powder, granules, needles, tablets, capsules or liquids, and the food to which the composition of the present invention can be added, for example, various foods, for example, There are beverages, gum, tea, vitamin complexes, and health supplements.
  • the food composition of the present invention includes health functional food and health food.
  • the functional food is the same term as food for special health use (FoSHU), and in addition to supplying nutrients, it is processed to efficiently exhibit bioregulatory functions and has high medical effects.
  • function (sex) means to obtain a useful effect for health purposes such as regulating nutrients or physiological action with respect to the structure and function of the human body.
  • the food of the present invention can be prepared by a method commonly used in the art, and can be prepared by adding raw materials and components commonly added in the art during the preparation.
  • the formulation of the food may be prepared without limitation as long as it is a formulation recognized as a food.
  • the food composition of the present invention can be prepared in various forms, and unlike general drugs, it has the advantage of not having side effects that may occur during long-term administration of the drug using food as a raw material, and has excellent portability, Food can be ingested as an adjuvant for enhancing the effect of preventing or improving cognitive dysfunction or neuroinflammation.
  • novel lactic acid bacteria according to the present invention can be used as a composition for preventing or treating irritable bowel syndrome, inflammatory bowel disease, liver disease or brain disease.
  • Figures 1a and 1b show the crushing efficacy of the Vitobacterium longum Z1 strain, the lactic acid bacterium of the present invention, for the final glycosylated product MGO-AGEs or GO-AGEs, respectively ( ### P ⁇ 0.001: Control group VS. MGO - or GO-AGEs group, $ P ⁇ 0.05 or $$$ P ⁇ 0.001 : MGO- or GO-AGEs group VS. Treated sample groups).
  • MGO methylglyoxal
  • ROS reactive oxygen species
  • Figure 3 is a mouse neuroblastoma (mouse neuroblastoma cell) cell line treated with lactic acid bacteria by concentration, the amount of reactive oxygen species (ROS) produced through a fluorescence microscope (JuLI live-cell imaging system, NanoEnTek, Seoul, Korea) results of observation it will be shown
  • ROS reactive oxygen species
  • 4A, 4B, 4C, and 4D show that in a mouse neuroblastoma cell line, methylglyoxal (MGO), which is an intermediate product of the final glycosylation product, was induced, and then lactic acid bacteria were treated by concentration to kill apoptosis. Shows the results of confirming the protein expression related to ( # P ⁇ 0.05 or ## P ⁇ 0.01 : Control group VS. MGO group, * P ⁇ 0.05 or ** P ⁇ 0.01 : MGO group VS. Treated sample groups).
  • MGO methylglyoxal
  • MGO methylglyoxal
  • 6a, 6b, 6c, 6d, 6e, and 6f show the concentration of lactic acid bacteria after induction with methylglyoxal (MGO), which is an intermediate product of the final glycosylation product in a mouse neuroblastoma cell line. It shows the results of confirming the expression of proteins related to the protection of cells induced by Glo-1, Glo-2 and oxidative damage by treatment with stars ( # P ⁇ 0.05 or ### P ⁇ 0.001: Control group VS. MGO group , * P ⁇ 0.05, ** P ⁇ 0.01 or *** P ⁇ 0.001 : MGO group VS. Treated sample groups).
  • MGO methylglyoxal
  • 8a, 8b, 8c, 8d and 8e are lactic acid bacteria 1x10 9 cfu/kg (weight ratio about 100 mg/kg) administered to mice for 7 days, and final results in plasma, small intestine, large intestine, liver and brain tissue
  • MGO methylglyoxal
  • HPLC method The results of measuring the concentration of methylglyoxal (MGO), an intermediate product of glycation products, by HPLC method are shown ( * P ⁇ 0.05 or ** P ⁇ 0.01 vs. control).
  • 9a, 9b, 9c, 9d, 9e and 9f are lactic acid bacteria 1x10 9 cfu/kg (weight ratio about 100 mg/kg) administered to mice for 7 days, Glo-1, Glo- 2 and shows the results of confirming the expression of proteins related to oxidative damage-induced cytoprotection ( * P ⁇ 0.05 or ** P ⁇ 0.01 vs. control).
  • 11a and 11b are lactobacilli 1x10 9 cfu/kg (weight ratio of about 100 mg/kg) administered to mice for 7 days, and H&E (hematoxylin & eosin) staining of liver and brain tissue shows the results observed through a microscope. did it
  • MGO methylglyoxal
  • HepG2 liver cell line
  • 13a and 13b are lactic acid bacteria 2.5x10 7 cfu / kg (weight ratio about 5 mg / kg, naive.) and 1x10 8 cfu / kg (weight ratio about 20 mg / kg, naive.) to mice administered for 7 days, It shows the results of the spontaneous change behavior ratio of mice in the Y-shaped maze experiment ( FIG. 13a ) and the cognitive index ( FIG. 13b ) in the new substance search experiment ( * P ⁇ 0.05 or ** P ⁇ 0.001 vs. control).
  • 14A, 14B, and 15C show the results of the secretion of cytokines (IL-1 ⁇ and IL-6) produced after the Z1 strain was treated with a TNF- ⁇ (10 ng/ml)-induced intestinal epithelial cell line.
  • cytokines IL-1 ⁇ and IL-6
  • TNF- ⁇ 10 ng/ml
  • 15a, 15b, 15c and 15d are Escherichia coli induced colitis in mice, and the Z1 strain was administered thereto to show the results of colitis indicators (long-term, myeloperoxidase activity, TNF- ⁇ expression, IL-1 ⁇ expression results) ( #### P ⁇ 0.0001, ### P ⁇ 0.001, ## P ⁇ 0.01, or # P ⁇ 0.05 vs. Control group, * P ⁇ 0.05, ** P ⁇ 0.01, *** P ⁇ 0.001 , or *** P ⁇ 0.0001 vs. Escherichia coli group).
  • Figure 17 shows the result of measuring the amount of free amine, which is a decomposition product of the final glycosylation product according to strain treatment (***P ⁇ 0.001 vs. Control group, #P ⁇ 0.5, ##P ⁇ 0.01, ###P ⁇ 0.001 vs. MGO-AGEs group).
  • the physiological characteristics and 16S rDNA sequence of the strains isolated from human feces were analyzed to determine the strain species, and the strain names were given.
  • the strain names of the given lactic acid bacteria are shown in Table 1 below.
  • Bifidobacterium longum Z1 (Accession No. KCCM12660P) strain is a Gram-positive bacillus, and it was confirmed that it has a 16S rDNA base sequence represented by SEQ ID NO: 1 as shown in Table 2 below.
  • SEQ ID NO: 1 As a result of comparing the 16S rDNA sequence of the Bifidobacterium longum Z1 strain by BLAST search, the Bifidobacterium longum strain having the same 16S rDNA sequence was not searched, so the Bifidobacterium longum Z1 strain was It was confirmed that it was a novel strain.
  • Carbon source availability among physiological properties of Bifidobacterium longum Z1 strain was analyzed by sugar fermentation test using API 50 CHL kit. The results are shown in Table 3 below. In Table 3 below, “+” indicates a case in which carbon source availability is positive, “-” indicates a case in which carbon source availability is negative, and “ ⁇ ” indicates a case in which it is difficult to determine whether carbon source availability is positive or negative.
  • mice Male, 6 weeks of age, 20-23 g
  • mice were administered with 2 ml of sterile 4% thioglycolate into the abdominal cavity. After 96 hours, the mice were anesthetized, and 8 ml of RPMI 1640 medium was administered to the abdominal cavity of the mice. After 5 to 10 minutes, RPMI 1640 medium (macrophages) in the abdominal cavity of the mice was extracted, centrifuged at 1000 g for 10 minutes, and washed twice with RPMI 1640 medium again.
  • the expression level of was measured by immunoblotting (immunoblotting) method.
  • the expression levels of the inflammatory markers for each lactic acid bacteria are shown in Table 4 below.
  • SH-SY5Y cells distributed from the Korean cell line bank were cultured in DMEM medium supplemented with 10% FBS and 1% antibiotics, and seeded at 2 ⁇ 10 6 cells/well in a 12-well plate. After that, corticosterone (corticosterone) was added to each well at a concentration of 300 mg/ml along with lactic acid bacteria (1 ⁇ 10 4 CFU/ml) and cultured for 24 hours, then the cells were separated and brain-derived neurotrophic factor (BDNF, Brain -Derived Neurotrophic Factor) expression level was measured by immunoblotting method. The expression levels of BDNF for each lactic acid bacteria are shown in Table 5 below.
  • BDNF expression levels were increased in all groups treated with Bifidobacterium longum Z1, BA1 and K2, and in particular, the group treated with Bifidobacterium longum Z1 was Bifidobacterium longum BA1 and K2 It was confirmed that the expression level of BDNF was significantly increased compared to the group treated with .
  • Methylglyoxal (MGO) or glyoxal (GO) was mixed with bovine serum albumin (BSA) and sodium azide and stored at 37°C for 7 days to prepare final glycation products (AGEs).
  • BSA bovine serum albumin
  • AGEs final glycation products
  • MGO-AGEs or GO-AGEs of 1 mg/ml were treated with the lactic acid bacteria of the present invention at concentrations of 0.1, 0.5, and 1 mg/ml for 24 hours.
  • 1 mM aminoguanidine (AG) known as an inhibitor of AGEs, was used.
  • TNBSA 2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid
  • sodium bicarbonate reagent 10% sodium dodecyl sulfate and 1N hydrochloric acid solution were added to carry out the reaction.
  • the lactic acid bacteria of the present invention increased the amount of free amine compared to the negative control (MGO-AGEs or GO-AGEs) treated only with the final glycosylated product.
  • MGO-AGEs or GO-AGEs the negative control
  • the degradation degree of the final glycated product MGO-AGEs or GO-AGEs was higher or similar to that of the positive control (aminoguanidine 1 mM). did Therefore, it was confirmed that the lactic acid bacteria of the present invention had very good activity for breaking down the final saccharification product.
  • N2a cells distributed from the Korean cell line bank were cultured in DMEM (Dulbeco's Modified Eagle's Media) medium supplemented with 10% FBS and 1% antibiotics, and plated at 2 ⁇ 10 4 cells/well in a 96-well plate and stabilized for 24 hours. Thereafter, methylglyoxal (MGO) was treated with various concentrations (1-1000 ⁇ M) and incubated for 24 hours.
  • DMEM Dynamic fetal bovine serum
  • FBS fetal bovine serum
  • MGO methylglyoxal
  • N2a cells were aliquoted in a 96-well plate at 2 x 10 4 cell/well and stabilized for 24 hours. Thereafter, the cells were pretreated with 10 ⁇ g/ml of lactic acid bacteria or 1 mM aminoguanidine (AG) for 1 hour, followed by post-treatment with 500 ⁇ M methylglyoxal (MGO) and cultured for 24 hours.
  • AG aminoguanidine
  • the lactate dehydrogenase (LDH) content was measured with a microspectrophotometer at a wavelength of 490 nm through the Pierce LDH cytotoxicity assay kit (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA).
  • the lactate dehydrogenase (LDH) content in the case of treatment with methylglyoxal (MGO) and lactic acid bacteria was calculated with the cell viability of the normal control group untreated as 100%.
  • the lactate dehydrogenase (LDH) measurement kit is a kit that can measure the degree of cell damage by measuring lactate dehydrogenase (LDH) released from cells with high sensitivity.
  • ROS reactive oxygen species
  • Reactive oxygen species (ROS) content was measured through the following principle. Specifically, when reactive oxygen species are generated in cells, 2',7'-dichlorofluresceindiacetate (DCFDA) is deacetylated to DCFH by esterase or oxidative hydrolysis and DCFH is oxidized by active oxygen to 2', converted to 7'-dichlorofluorescein (DCF).
  • DCFDA 2',7'-dichlorofluresceindiacetate
  • DCFH 7'-dichlorofluorescein
  • ROS reactive oxygen species
  • ROS reactive oxygen species
  • ROS reactive oxygen species
  • ROS reactive oxygen species
  • N2a cells were aliquoted in a 60 mm dish at 1 x 10 6 cells/well and stabilized for 24 hours. Thereafter, cells were pretreated with 1, 5, and 10 ⁇ g/ml of lactic acid bacteria or 1 mM aminoguanidine (AG) for 1 hour, followed by post-treatment with 500 ⁇ M methylglyoxal (MGO) and cultured for 24 hours. . After incubation, cells completely filled with PBS were washed and lysed using a lysis buffer (PRO-PREP TM Protein Extraction Solution, Intron Biotechnology, Seongnam, Korea).
  • a lysis buffer PRO-PREP TM Protein Extraction Solution
  • bovine serum albumin BSA
  • BSA bovine serum albumin
  • the protein content of the lysate supernatant was measured with a Bio-Rad Protein Assay (Bio-Rad, Califonia, USA), and the total protein content of each sample was measured. was adjusted. After that, the samples were loaded into a 10-12% SDS-PAGE gel to have a protein amount of 30 ⁇ g each for electrophoresis, and transferred to a PVDF membrane. After blocking the membrane with 5% skim milk, AKT, pAKT, Bax, Bcl-2.
  • ChmiDoc XRS+ imaging system Bio-Rad, CA, USA
  • Cytochrome C Total Caspase-3
  • Cleaved Caspase-3 Cleaved Caspase-3
  • ⁇ -Tubulin Cell Signaling Technologies, Massachusetts, USA
  • AKT protein is a protein that phosphorylates serine and threonine, and plays a central role in cell signal transduction, and cell survival is maintained due to inhibition of apoptosis.
  • the lactic acid bacteria of the present invention significantly increased the AKT expression level compared to the methylglyoxal (MGO) treatment group in a concentration-dependent manner. Therefore, it was confirmed that lactic acid bacteria directly regulate proteins related to cell survival.
  • Bcl-2 a gene belonging to the Bcl-2/Bax family, is an anti-apoptotic branch that inhibits apoptosis induction, and Bax is apoptotic that promotes apoptosis induction.
  • -Pro-apoptotic branching The two genes liberate cytochrome c from the mitochondria of the cell to regulate the activity of related protein factors such as caspase-3, a tumor suppressor gene.
  • MGO methylglyoxal
  • the lactic acid bacteria of the present invention inhibit the release of cytochrome-c, and caspase-3 activated by stimulation inducing apoptosis 3) was confirmed to be directly inhibited.
  • Example 5-5 ChmiDoc XRS+ imaging system (Bio-Rad , CA, USA).
  • NF- ⁇ B and pI ⁇ B which act as an upper signaling mechanism of anti-inflammatory activity
  • cells were identified by separating cytoplasmic and nuclear proteins. Specifically, after pre-treatment with lactic acid bacteria or aminoguanine and post-treatment with MGO in the same manner as in Example 5-5, the cells were washed with PBS and then NEPER nuclear and cytoplasmic extraction reagents (Thermo scientific, Rockford, IL, USA) was used. After reacting with Cytoplasmic extraction reagent (CER) I for 10 minutes and CERII for 1 minute, the supernatant obtained by centrifugation at 15,000 rpm for 5 minutes was used as a cytoplasmic fraction.
  • CER Cytoplasmic extraction reagent
  • the remaining cell pellet was reacted with nuclear extraction reagent (NER) for 40 minutes, and the nuclear fraction protein was extracted through centrifugation for 15 minutes.
  • NER nuclear extraction reagent
  • the obtained Bradford protein quantification method was quantified, and 30 ⁇ g of protein was electrophoresed on an 8-12% SDS-PAGE gel and transferred to a PVDF membrane, followed by NF- ⁇ B, pI ⁇ B, histamine, and ⁇ -tube.
  • Protein expression levels were detected with ChmiDoc XRS+ imaging system (Bio-Rad, CA, USA) using antibodies against ⁇ -Tubulin (Cell Signaling Technologies, Massachusetts, USA), respectively, and are shown in FIGS. 5A to 5C .
  • NF- ⁇ B and I ⁇ B activity levels were analyzed to determine whether there is a correlation with NF- ⁇ B signaling, which acts as an upper signaling mechanism of inflammatory activity.
  • NF- ⁇ B is a transcription factor that regulates the expression of inflammatory proteins, and its activation is regulated through nuclear translocation and phosphorylation of I ⁇ B.
  • the neuroinflammation inhibitory action of the lactic acid bacteria of the present invention was confirmed by inhibiting the phosphorylation of I ⁇ B to inhibit the transfer of NF- ⁇ B to the nucleus, thereby regulating the activation of NF- ⁇ B. .
  • the regulation of NF- ⁇ B activity plays an important role in the progression of neuritis that causes Alzheimer's disease. Appropriate regulation of NF- ⁇ B activity by lactic acid bacteria of the present invention can be effectively applied to control neurological diseases triggered by inflammation.
  • the cells were identified by separating cytoplasmic and nuclear proteins. Specifically, after treatment in the same manner as in Examples 5-6, the cells were washed with PBS and then NEPER nuclear and cytoplasmic extraction reagents (Thermo scientific, Rockford, IL, USA) were used. After reacting with Cytoplasmic extraction reagent (CER) I for 10 minutes and CERII for 1 minute, the supernatant obtained by centrifugation at 15,000 rpm for 5 minutes was used as a cytoplasmic fraction.
  • CER Cytoplasmic extraction reagent
  • the remaining cell pellet was reacted with nuclear extraction reagent (NER) for 40 minutes, and the nuclear fraction protein was extracted through centrifugation for 15 minutes.
  • NER nuclear extraction reagent
  • the resulting Bradford protein quantification method was quantified, and 30 ⁇ g of the protein was electrophoresed on 8-12% SDS-PAGE gel and transferred to the PVDF membrane, followed by Nrf2, Keap1, HO-1, histamine and ⁇ - Protein expression levels were detected using ChmiDoc XRS+ imaging system (Bio-Rad, CA, USA) using each antibody against Tubulin (Cell Signaling Technologies, Massachusetts, USA).
  • the physiological role of the glyoxalase system is to detoxify by making methylglyoxal (MGO), one of the intermediate products of the final glycated product produced in vivo or synthesized and absorbed by intestinal bacteria, into lactic acid. .
  • MGO methylglyoxal
  • This detoxification reaction consists of a continuous reaction of two thiol-dependent enzymes, Glo-1 and Glo-2.
  • Nrf2 which contributes to the expression of antioxidant/detoxifying enzymes, exists as a complex with Keap1 in the cytoplasm, and then recognizes and dissociates the redox signaling system by sensing reactive oxygen species (ROS).
  • ROS reactive oxygen species
  • Nrf2 significantly increased compared to the normal control, and it was confirmed that Keap1 was also significantly increased. there was. Finally, the expression of HO-1, a representative target gene of Nrf2, was significantly increased. It has been confirmed that the products of these enzymes play important roles in antioxidant and cellular protective functions through the removal of reactive oxygen species (ROS).
  • ROS reactive oxygen species
  • Glo-1 is It is a cytoplasmic enzyme that detoxifies in the glyoxalase system. Specifically, Glo-1 converts ⁇ -ketoaldehydes such as methylglyoxal (MGO) to D-lactic acid through SD-lactoylglutathione, an intermediate of the glyoxalase system. (D-lactic acid) plays a role in detoxification. Whether the lactic acid bacteria of the present invention has direct Glo-1 activity was measured with a microspectrophotometer at 240 nm using a Glyoxalase 1 activity assay kit. By setting the reactive oxygen species (ROS) content of the normal control untreated to 1 to 1, Glo-1 activity was shown when treated with methylglyoxal (MGO) or lactic acid bacteria.
  • ROS reactive oxygen species
  • the lactic acid bacteria of the present invention were shown to increase glo-1 activity as much as the positive control in a concentration-dependent manner even when treated in a methylglyoxal (MGO)-induced neuronal cell line. This is because lactic acid bacteria can directly increase glo-1 activity in the glyoxalase system.
  • MGO methylglyoxal
  • C57BL/6 (Male, 6 weeks old) was purchased from Daehan Biolink (Korea), supplied with solid feed (Samyang feed) and sufficient water, room temperature 22 ⁇ 2°C humidity 50 ⁇ 70%, lighting time 12 hours (08: 00 to 20:00), the illuminance was set to 150 to 300 Lux, and after adapting to the laboratory environment for one week, it was used in the experiment.
  • C57BL/6 mice were acclimatized to the environment of the animal breeding room for 1 week, and then orally administered at 1x10 9 cfu/kg (weight ratio of about 100 mg/kg, naive.) daily for 7 days.
  • Methylglyoxal reacts with o-PD to produce a derivative of 2-quinoxaline, which is detected by HPLC.
  • o-PD o-PD
  • HPLC o-PD
  • 5-methylauinoxlaine 5-methylauinoxlaine
  • filtration through a 0.2 ⁇ m syringe filter High performance liquid chromatography was used for analysis.
  • Small intestine, large intestine, liver, and brain were homogenized by adding about twice the weight of PBS. 100 ⁇ l of the homogenate was taken and cooled perchloric acid (0.1M in PBS) was immediately added, followed by sonication for 1 min to ensure complete homogenization. After homogenization, it proceeded in the same manner as in the plasma analysis method.
  • MGO methylglyoxal
  • MGO methylglyoxal
  • MGO methylglyoxal
  • Nrf2 As can be seen from FIGS. 9c, 9d, 9e and 9f, the expression factor of Nrf2 was significantly increased in the group administered orally with the lactic acid bacteria of the present invention, and the expression of HO-1, a target gene of Nrf2 This was not significant, but increased. As shown in FIG. 8d , it was found that it was possible to increase the cell protection efficacy while decreasing the level of methylglyoxal (MGO), which is an intermediate product of the final glycation product.
  • MGO methylglyoxal
  • a lysis buffer was added for 24 hours to extract the protein. After protein extraction, samples were prepared after quantification through Bradford assay. Then, it was separated by denaturation by SDS-PAGE, and it was transferred to a PVDF membrane. ChmiDoc XRS+ was then used with antibodies to BDNF, TrkA, pTrkA, NGF, AKT, pAKT, ERK, pERK, CREB, pCREB and ( ⁇ -tubulin) ⁇ -Tubulin (Cell Signaling Technologies, Massachusetts, USA), respectively. It was detected with an imaging system (Bio-Rad, CA, USA).
  • NGF a nerve growth factor
  • PI3-K phosphatidylinositol 3-kinase
  • ERK extracellular signal-regulated kinase
  • MAPK MAPK
  • AKT protein kinase B
  • BDNF is known to play an important role in the regulation of neurotransmitters and neuroplasticity as one of the nerve growth promoters. It is involved in neuronal protection by accelerating the activation of the signaling substances CREB, ERK, and AKT through BDNF expression in the brain and stimulation of the receptor TrkB.
  • TrkA was increased as the expression of NGF was increased during oral administration of the lactic acid bacteria of the present invention.
  • AKT and ERK protein was increased, and finally it was confirmed that the expression of CREB was increased.
  • oral administration of lactic acid bacteria increased the expression of BDNF compared to the normal control group. Therefore, the Bifidobacterium longum Z1 strain not only decreased the methylglyoxal (MGO) level, as shown in FIG. 8e, but also showed a neuroprotective effect according to stimulation of the nerve growth factor.
  • MGO methylglyoxal
  • H&E Hematoxylin & Eosin
  • the liver was excised and observed through H&E staining.
  • the portal vein and parenchyma maintained normal structures in the liver tissue of the normal control group.
  • the portal vein and parenchyma maintained a normal structure than that of the normal control group.
  • no changes such as liver cell necrosis, inflammatory cell infiltration, or fatty degeneration were found.
  • Fig. 11a the histological observation of the hippocampus in the H&E-stained tissue sample of the normal control group was confirmed.
  • the nucleus and the neuron cell body are circular, the nucleolus is distinct, and the nuclear chromatin is interspersed with autochromatin. It was uniformly arranged in 4-6 floors with clear boundaries.
  • neurons in the pyramidal layer were in a cleaner form than in the normal control group.
  • the lactic acid bacteria of the present invention have the activity of crushing the final glycation product, and exhibit neuroprotective efficacy through the intestinal-liver-brain axis.
  • HepG2 cells were seeded in a 96-well plate at 2 x 10 4 cells/well and stabilized for 24 hours. Thereafter, the cells were pre-treated with 1, 5, 10 and 100 ⁇ g/ml of Z1 lactic acid bacteria for 1 hour, followed by post-treatment with 1 mM methylglyoxal (MGO) and cultured for 24 hours. After removing the medium, 0.5 mg/ml MTT solution was treated for 1 hour, reduced formazan was dissolved in 150 ⁇ l of dimethylsulfoxide (DMSO), and cell viability (microspectrophotometer) at 570 nm wavelength ( cell viability) was measured.
  • DMSO dimethylsulfoxide
  • Z1 did not show toxicity in the hepatocyte line, and as shown in FIG. 12b , it was confirmed that it had a concentration-dependent cytoprotective effect in the hepatocyte line induced with MGO.
  • C57BL/6 (Male, 6 weeks old) was purchased from Orient Bio (Korea), provided with sufficient solid feed (Samyang feed) and water, room temperature 22 ⁇ 2°C, humidity 50 ⁇ 70%, lighting time 12 hours (08:00) ⁇ 20:00), the illuminance was set to 150-300 Lux, and after adapting to the laboratory environment for one week, it was used for the experiment. After adapting C57BL/6 mice to the environment of the animal breeding room for 1 week, 2.5x10 7 cfu/kg (weight ratio about 5 mg/kg, naive.) and 1x10 8 cfu/kg (weight ratio about 20 mg/kg) daily for 7 days , naive.) was administered orally.
  • PC piracetam
  • a Y-shaped maze experiment was performed to evaluate spatial cognitive ability.
  • a Y-shaped closed maze of 60 cm in length, 4 cm in width, and 12 cm in height three paths were designated as A, B, and C, respectively, and the mouse was placed in the center, observed for 8 minutes, and the total number of entrances and exits was recorded. did If three different branches were entered one after another, the number of changes was counted as 1, and if it did not enter consecutively, it was not counted as the number of changes. The number of changes is defined as entering all three in turn, and the calculation for spatial cognitive function evaluation was calculated using the following formula.
  • the spontaneous alternation rate was 52.25% (2.5x10 7 cfu/kg Z1 oral administration group), 56.82% (1.0x10 8 cfu/kg) in the group administered with Z1, respectively.
  • Z1 oral administration group compared to the positive control group (PC), the group administered with Piracetam, showed 5.54% and 10.11% higher values, respectively, indicating a more excellent memory improvement effect.
  • HIEC-6 Human small intestinal epithelial cell line
  • Z1 strain was added to the cells at 1, 5, 10, 25, 50 and 100 ⁇ g/ml
  • TNF- ⁇ (10 ng/ml) was incubated for 24 hours.
  • the culture medium was collected and the cytokine (IL- 1 ⁇ and IL-6) secretion was quantified and measured.
  • the Z1 strain protects the cytotoxicity in a concentration-dependent manner in the intestinal epithelial cell line treated with TNF- ⁇ (10 ng/ml).
  • the Z1 strain has an excellent effect of inhibiting inflammatory factors such as TNF- ⁇ in intestinal cells.
  • mice C57BL/6 male mice (5 weeks old 19-21 g) were acclimatized to the laboratory for 1 week, with 6 mice per group.
  • One group was the normal group and the other group was the experimental group.
  • Physiological saline was administered to the normal group, and E. coli (1x10 9 CFU/mouse/day) was orally administered to the experimental group once a day for 5 days. Thereafter, from the next day, the Z1 strain was administered at a concentration of 1x10 8 CFU/mouse, 5x10 8 CFU/mouse, 1x10 9 CFU/mouse, and sulfasalazine 50 mg/kg (mouse) at a concentration of 50 mg/kg (mouse) once daily for 5 days, respectively.
  • mice were anesthetized, and the inflammatory response markers of longevity, myeloperoxidase activity (MPO), TNF- ⁇ , and IL-1 ⁇ were measured.
  • MPO myeloperoxidase activity
  • the long intestine was measured by dissecting the abdomen of the mouse to isolate the large intestine, and the results are shown in FIG. 15A .
  • the concentration of Z1 lactic acid bacteria increased, the long-term length increased, and it was confirmed that the long-term length was the same as that of the normal control group at the high concentration.
  • the activity of the myeloperoxidase was calculated as 1 unit of 1 ⁇ mol/ml of H 2 O 2 generated as a reactant.
  • the measurement results are shown in FIG. 15B .
  • FIG. 15b it was confirmed that the activity of myeloperoxidase was significantly reduced in the group administered with the Z1 strain.
  • Inflammatory response markers such as TNF- ⁇ and IL-1 ⁇ were measured. Specifically, a supernatant was obtained in the same manner as in the myeloperoxidase (MPO) activity measurement experiment, and 50 ⁇ g of the supernatant was taken and cytokines were measured using an ELISA kit (eBioscience), and the results are shown in FIGS. 15c and 15d. shown in As shown in FIGS. 15c and 15c , it was confirmed that TNF- ⁇ and IL-1 ⁇ expression decreased in the group administered with the Z1 strain.
  • MPO myeloperoxidase
  • the Escherichia coli administration group induced colitis through various indicators, and the Z1 strain showed various colitis indicators (longitudinal contraction, MPO activity, TNF- ⁇ /IL-) caused by Escherichia coli in a concentration-dependent manner. 1 ⁇ expression), it can be seen that it has the effect of remarkably improving. Therefore, it can be seen that the Z1 strain has an effect of preventing and treating colon diseases such as irritable bowel syndrome and inflammatory bowel disease, like sulfasalazine (SF) currently used as a drug.
  • colon diseases such as irritable bowel syndrome and inflammatory bowel disease, like sulfasalazine (SF) currently used as a drug.
  • HIEC-6 Human small intestinal epithelial cell line
  • BA1 Bifidobacterium longum subsp.
  • BA3 Bifidobacterium pseudocatenulatum
  • Z1 Bifidobacterium longum subsp.longum
  • PH3 Lactobacillus curvatus
  • H92 Lactobacillus plantarum
  • the Z1 strain showed the highest cell viability in the small intestinal epithelial cell line induced with TNF- ⁇ +INF ⁇ (10 ng/ml), and thus, strains other than Z1 (BA1, BA3, Z1, PH3) , H92, L1, L2, L3, Y4) was confirmed to have superior cell protection. In particular, it was confirmed that it was significantly superior to the Bifidobacterium longum strain (BA1) of the same species.
  • Methylglyoxal was mixed with bovine serum albumin (BSA) to produce a final glycation product, and then each strain (BA1: Bifidobacterium longum subsp. Longum , BA3: Bifidobacterium pseudocatenulatum , Z1: Bifidobacterium longum subsp.longum , PH3: Lactobacillus curvatus , H92: Lactobacillus plantarum , L1: Lactobacillus gasseri , L2: Pediococcus acidilactici , L3: Enterococcus faecium , Y4: Lactobacillus sakei ) at a concentration of 1 mg/ml) were treated for 24 hours.
  • BSA bovine serum albumin
  • a reagent containing TNBSA (2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid), 4% sodium bicarbonate, 10% sodium dedecylsulfate and 1N hydrochloric acid solution was added.
  • Aminoguanidine (AG) an inhibitor of final glycosylation, was used as a positive control.
  • the Z1 strain exhibited the highest amount of free amine, and thus the final glycosylated product was superior to other strains other than Z1 (BA1, BA3, Z1, PH3, H92, L1, L2, L3, Y4). Decomposition was confirmed. In particular, it was confirmed that it was significantly superior to the Bifidobacterium longum strain (BA1) of the same species.

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Abstract

본 발명은 과민성 대장 증후군 (Irritable Bowel Syndrome, IBS), 염증성 장질환 (Inflammatory Bowel Disease, IBD), 간질환 및 뇌질환의 예방 또는 치료에 유용한 신규한 비피도박테리움 롱검 Z1 균주, 및 이를 포함하는 조성물에 관한 것이다.

Description

신규한 비피도박테리움 롱검 Z1 균주 및 이의 용도
본 발명은 과민성 대장 증후군 (Irritable Bowel Syndrome, IBS), 염증성 장질환 (Inflammatory Bowel Disease, IBD), 간질환 및 뇌질환의 예방 또는 치료에 유용한 신규한 비피도박테리움 롱검 Z1 균주 및 이의 용도에 관한 것이다.
치매 등과 같은 뇌질환은 신경변성 (neurodegeneration)에 의해 기억을 하고 사고를 할 수 있는 능력이 점차 감퇴하여 일상생활에 영향을 줄 정도에 이르게 되는 증후군을 말한다. 뇌질환은 고령화 사회로 진입하면서 의학적, 경제·사회학적 부담을 유발하는 주요 원인 중 하나로 대두되고 있으며, 2015년 기준으로 전 세계적으로 약 4,700 만 명의 환자가 발생하고 있고, 60세 이상의 인구에서 이러한 질병 유병률은 약 7%로 추산되고 있다 (The global prevalence of dementia: a systematic review and metaanalyisis, Alzheimers Dement, 2013, 63-75).
이러한 뇌질환의 주된 원인으로 노화와 유전적 원인이 지목되나, 후천적인 요인인 당뇨병이 이러한 질환의 위험률을 증가시킨다는 연구결과들이 제시되어 오고 있다 (Insulin metabolism and the risk of Alzheimer diseases: the Rotterdam Study, Neurology, 2010, 1982-1987). 통계적인 수치에 따르면 제2형 당뇨병 (type 2 diabetes mellitus) 환자는 인지기능 저하나 치매 위험성이 약 1.4 내지 2.4배 증가하고, 나이가 많을수록 당뇨병에 의한 치매 위험성이 훨씬 높다고 보고되어 있다 (Cognitive dysfunction and diabetes mellitus, Endocrine Reviews, 2008, 494-511; Biochemistry and molecular cell biology of diabetic complications, Nature, 2001, 235-239).
당뇨 합병증으로 지속적인 인슐린 저항성의 발생은 혈중의 포도당을 정상적으로 이용하지 못함으로써 최종당화산물 생성 및 폴리올 경로의 활성과 같은 다양한 기작이 활성산소종 (reactive oxygen species, ROS)의 생성을 촉진시킨다. 상대적으로 불포화 지방산의 함량이 높은 뇌 조직은 산화적 스트레스에 매우 취약한 구조를 나타내는데, 이러한 구조적 특징은 뇌신경 세포의 기능장애 및 사멸을 유도함으로써 알츠하이머, 파킨슨 및 뇌졸중 등 뇌신경질환을 유발시키는 것으로 보고되어 있다 (Processing of Alzheimer's amyloid precursor protein during H2O2-induced apoptosis in human neuronal cells, 1997, Biochemical and Biophysical Research Communications, 845-848).
최종당화산물은 환원당 (글루코스 (glucose), 프럭토스 (fructose), 글리세르알데히드 (glyceraldehyde) 등) 및 카보닐 (carbonyl) 화합물 (글리옥살 (glyoxal), 메틸글리옥살 (methylglyoxal), 아세트알데히드 (acetaldehyde) 등)의 케톤 (ketone) 혹은 알데히드기 (aldehyde group)와 단백질 (albumin, fibrinogen, collagen, hemoglobin 등)의 아미노기 (amino group) 사이에서 일어나는 마이야르 반응 (Maillard reaction)에 의해 생성되어 산화적 스트레스를 일으키는 독성 물질이다 (Serum levels of toxic AGEs (TAGE) may be a promising novel biomarker in development and progression of NASH, Medical Hypotheses, 2015, 490-493). 구체적으로, 인체 내에서 고-프럭토스 (high-fructose) 또는 고-수크로스 (high-sucrose) 식단(diet)에 만성적으로 노출될 시에는 글리옥살 (glyoxal, GO), 글리세르알데히드 (glyceraldehyde, GA) 및 메틸글리옥살 (methylglyoxal, MGO) 등과 같은 다양한 종류의 최종당화산물이 생성된다. 다양한 종류의 최종당화산물은 매우 반응성이 높은 독성물질로서 알려져 있으며, 특히 이는 인지장애 등 뇌질환과 같은 당뇨병성 합병증의 주요 원인물질로 제기되고 있다.
한편, 체내에는 많은 세균들이 서식하고 있고, 정상세포에 비해 세균의 수는 약 10배 많은 100조개 정도에 달한다. 이 세균들은 우리 장의 건강에 도움을 주는 유익균과 건강에 해로운 유해균으로 나눠진다. 우리 몸은 락토바실러스 (Lactobacillus), 비피도박테리움 (Bifidobacterium) 등과 같은 유익균이 유해균보다 우세균으로 소화관에 서식하고 있을 때에 건강을 유지할 수 있다 (Gut/brain axis and the microbiota. The Journal of clinical investigation, 2015, 125(3), 926-938). 반면, 뇌질환이 발생하면 장내세균총에 대장균 (Escherichia coli), 프로튜스 미라빌리스 (Proteus mirabilis) 등과 같은 유해한 미생물이 증가하고, 이로 인하여 장관세포에서 알파시누클레인 (α-synuclein)이 과다 발현되고 NF-κB가 활성화되어 파킨슨병, 알츠하이머병의 진행속도가 빨라지는 것으로 알려져 있다 (Oral administration of Proteus mirabilis damages dopaminergic neurons and motor functions in mice. Scientific reports, 2018, 8(1), 1275).
장내 미생물 환경을 개선하여 숙주의 건강에 유익한 영향을 주는 살아있는 미생물을 통칭하여 프로바이오틱스 (probiotics)라고 한다. 유산균은 체내로 섭취시 소화계에 공생하면서 섬유질 및 복합 단백질들을 분해하여 중요한 영양성분으로 기여하는 역할을 담당하기에 프로바이오틱스로 사용된다. 유산균은 장내세균총의 유지 및 개선, 항당뇨 효과, 대장염 억제 및 면역체계 개선 등의 효과를 나타낸다고 보고되고 있다 (Prophylactic and therapeutic uses of probiotics: a review. Journal of the American Dietetic Association, 2001, 101(2), 229-241). 이러한 다양한 생리활성 효능을 가진 유산균을 개발하고 이를 활용하여 의약품 또는 건강기능식품의 소재로 적용하려는 연구가 활발하게 진행되고 있다 (대한민국 등록특허공보 제10-1476236, 대한민국 등록특허공보 제10-1087972호). 그러나, 지금까지 최종당화산물을 제어할 수 있는 유산균은 전무한 실정이며, 이를 활용한 뇌질환 예방, 개선 또는 치료에 관한 기술 개발에 대한 사례는 없다.
특히, 장내세균총 및 이들의 대사산물이 뇌에 영향을 미친다는 다양한 연구결과가 보고되었으며, 이러한 상관관계는 장-뇌 축 (gut-brain axis)으로 설명되고 있다. 최종당화산물은 당뇨병 환자의 중추신경계를 포함한 여러 신경조직에서 증가하며, 아밀로이드 베타 (amyloid beta, Aß)와 타우 (tau) 단백질의 당화 (glycation)를 유발시켜 Aß의 응집이나 신경섬유매듭 형성을 일으킨다고 보고되어 있다. 당뇨병에서는 최종당화산물 수용체 (receptor for AGEs, RAGE) 또한 상향 조절되는데, 알츠하이머병 환자의 뇌 조직에서 Aß가 침착되어 있는 부위 근처 혈관에 최종당화산물 수용체 (RAGE)의 발현이 증가되어 있고, 최종당화산물 수용체 (RAGE)의 분포가 뉴런 (neuron)에서 미세혈관구조 (microvasculature) 쪽으로 변위되어 있는 것을 발견할 수 있다. 최종당화산물 수용체 (RAGE)는 혈중에 있는 Aß를 혈액 뇌장벽을 통해 뇌 조직으로 이동시키는 일차적인 전달체 (transporter)로, Aß 대사에 영향을 준다. 그 외 인슐린 저항성과 제2형 당뇨병의 발병 기전의 일부로 생각되고 있는 산화스트레스나 염증 반응이 Aß 대사와 관련이 있음이 밝혀지고 있다. 또한 미토콘드리아 기능 이상과 이와 관련된 칼슘 항상성의 이상 조절 (dysregulation)도 아밀로이드 전구 단백질의 처리 (processing)나 Aß의 생산에 영향을 주는 것으로 알려져 있다.
현재, 체내 최종당화산물의 생성을 억제하는 화합물질들이 많은 연구자들에 의해 개발되고 있다. 대표적으로는 아미노구아니딘 (aminoguanidine), 피리독사민 (pyridoxamin), 알라게브리움 (alagebrium; ALT-711), 티아졸리디네디온 (thiazolidinedione) 등이 있다. 아미노구아니딘은 친핵성 히드라진 (hydrazine)으로 축합반응의 산물과 결합하여 최종당화산물의 생성을 억제하여 당뇨 합병증으로 진전되는 것을 방지한다. 이는 당뇨 합병증의 예방 및 치료에 가장 유망한 의약품으로 제3상 임상시험까지 진행되었으나, 장기간 투여시 독성이 유발되는 문제점이 있어 더욱 안전한 약제의 개발이 필요한 실정이다. 대한민국 등록특허 제10-1899234호에는 최종당화산물 관련 질환인 당뇨 합병증 치료용 전나무 추출물이 개시되어 있고, 대한민국 공개특허 제10-2018-0024825호에는 최종당화산물의 생성 억제 및 파쇄 활성을 갖는 호모이소플라보노이드계 화합물이 개시되어 있다.
이러한 점에서 본 발명은 최종당화산물의 파쇄 효능을 갖는 신규한 균주인 비피도박테리움 롱검 Z1을 분리 및 동정하고 이의 활성을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
[선행기술문헌]
[특허문헌]
(특허문헌 0001) 대한민국 등록특허 제10-1476236호
(특허문헌 0002) 대한민국 등록특허 제10-1087972호
(특허문헌 0003) 대한민국 등록특허 제10-1899234호
(특허문헌 0004) 대한민국 공개특허 제10-2018-0024825호
[비특허문헌]
(비특허문헌 0001) The global prevalence of dementia: a systematic review and metaanalyisis, Alzheimers Dement, 2013, 63-75.
(비특허문헌 0002) Insulin metabolism and the risk of Alzheimer diseases: the Rotterdam Study, Neurology, 2010, 1982-1987.
(비특허문헌 0003) Cognitive dysfunction and diabetes mellitus, Endocrine Reviews, 2008, 494-511; Biochemistry and molecular cell biology of diabetic complications, Nature, 2001, 235-239.
(비특허문헌 0004) Processing of Alzheimer's amyloid precursor protein during H2O2-induced apoptosis in human neuronal cells, 1997, Biochemical and Biophysical Research Communications, 845-848.
(비특허문헌 0005) Serum levels of toxic AGEs (TAGE) may be a promising novel biomarker in development and progression of NASH, Medical Hypotheses, 2015, 490-493.
(비특허문헌 0006) Gut/brain axis and the microbiota. The Journal of clinical investigation, 2015, 125(3), 926-938.
(비특허문헌 0007) Oral administration of Proteus mirabilis damages dopaminergic neurons and motor functions in mice. Scientific reports, 2018, 8(1), 1275.
(비특허문헌 0008) Prophylactic and therapeutic uses of probiotics: a review. Journal of the American Dietetic Association, 2001, 101(2), 229-241.
본 발명의 목적은 신규한 비피도박테리움 롱검 Z1 (기탁번호 KCCM12660P) 균주를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 비피도박테리움 롱검 Z1 (기탁번호 KCCM12660P) 균주, 이의 생균체, 이의 사균체, 이의 배양물, 이의 파쇄물, 이의 추출물, 이의 천연물 또는 이의 화합물을 포함하는 과민성 대장 증후군, 염증성 장질환, 간질환 또는 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 비피도박테리움 롱검 Z1 (기탁번호 KCCM12660P) 균주, 이의 생균체, 이의 사균체, 이의 배양물, 이의 파쇄물, 이의 추출물, 이의 천연물 또는 이의 화합물을 함하는 과민성 대장 증후군, 염증성 장질환, 간질환 또는 뇌질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
비피도박테리움 롱검 Z1 (기탁번호 KCCM12660P) 균주, 이의 생균체, 이의 사균체, 이의 배양물, 이의 파쇄물, 이의 추출물, 이의 천연물 또는 이의 화합물을 포함하는 과민성 대장 증후군, 염증성 장질환, 간질환 또는 뇌질환의 예방 또는 개선용 정장용 조성물을 제공하는 것이다.
비피도박테리움 롱검 Z1 (기탁번호 KCCM12660P) 균주, 이의 생균체, 이의 사균체, 이의 배양물, 이의 파쇄물, 이의 추출물, 이의 천연물 또는 이의 화합물을 포함하는 과민성 대장 증후군, 염증성 장질환, 간질환 또는 뇌질환의 예방 또는 개선용 생균제 조성물을 제공하는 것이다.
비피도박테리움 롱검 Z1 (기탁번호 KCCM12660P) 균주, 이의 생균체, 이의 사균체, 이의 배양물, 이의 파쇄물, 이의 추출물, 이의 천연물 또는 이의 화합물을 포함하는 과민성 대장 증후군, 염증성 장질환, 간질환 또는 뇌질환의 예방 또는 개선용 사료용 조성물을 제공하는 것이다.
비피도박테리움 롱검 Z1 (기탁번호 KCCM12660P) 균주, 이의 생균체, 이의 사균체, 이의 배양물, 이의 파쇄물, 이의 추출물, 이의 천연물 또는 이의 화합물을 포함하는 과민성 대장 증후군, 염증성 장질환, 간질환 또는 뇌질환의 예방 또는 개선용 발효 제품을 제공하는 것이다.
상기 목적을 수행하기 위한 하나의 태양으로서, 본 발명은 비피도박테리움 롱검 Z1 (Bifidobacterium longum Z1) (기탁번호 KCCM12660P) 균주를 제공한다.
본 발명의 비피도박테리움 롱검 Z1 균주는 인간의 분변으로부터 분리 및 동정된 비피도박테리움 롱검의 신규한 유산균인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 비피도박테리움 롱검 Z1 균주의 동정 및 분류를 위한 16S rDNA 염기서열은 본 명세서에 첨부된 서열번호 1과 같다. 따라서, 본 발명의 비피도박테리움 롱검 Z1 (Bifidobacterium longum Z1) 균주는 서열번호 1의 16S rDNA를 포함할 수 있다.
상기 서열번호 1의 16S rDNA 염기서열의 분석 결과, 공지된 비피도박테리움 롱검 균주들과 99%의 상동성을 나타내어 비피도박테리움 롱검과 가장 높은 분자계통학적 유연관계를 나타내었다. 따라서, 상기 유산균을 비피도박테리움 롱검 (Bifidobacterium longum)으로 동정하고, 비피도박테리움 롱검 Z1으로 명명하였으며, 한국미생물보존센터에 2020년 1월 20일자로 기탁하였다 (기탁번호 KCCM12660P).
본 발명의 비피도박테리움 롱검 Z1 균주는 그람양성균이고, 세포의 형태는 간균이다. 보다 구체적인 비피도박테리움 롱검 Z1 균주의 생리학적 특성은 당해 기술분야의 통상의 방법에 따라 분석할 수 있다. 구체적으로, 비피도박테리움 롱검 Z1 균주는 탄소원으로 L-아라비노오스, D-리보오스, D-자일로오스, D-갈락토오스, D-글루코오스, D-프럭토오스, 만니톨, 솔비톨, α-메틸-D-글루코사이드, 에스큘린, 살리신, 말토오스, 락토오스, 멜리비오스, 수크로오스, 라피노오스 및 D-투라노오스를 이용할 수 있다.
상기 목적을 수행하기 위한 다른 하나의 태양으로서, 본 발명은 비피도박테리움 롱검 Z1 (Bifidobacterium longum Z1) (기탁번호 KCCM12660P) 균주 또는 이들의 혼합물을 포함하는 과민성 대장 증후군 (Irritable Bowel Syndrome, IBS), 염증성 장질환 (Inflammatory Bowel Disease, IBD), 간질환 또는 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 "비피도박테리움 롱검 Z1 (Bifidobacterium longum Z1) 균주"는 상기에서 설명한 바와 동일하다.
구체적으로, 본 발명의 약학 조성물에 포함되는 비피도박테리움 롱검 Z1 균주는 이의 생균체, 이의 사균체, 이의 배양물, 이의 파쇄물, 이의 추출물, 이의 천연물 또는 이의 화합물일 수 있으나, 과민성 대장 증후군, 염증성 장질환, 간질환 또는 뇌질환의 예방 또는 치료 효과를 달성할 수 있는 형태라면 제한없이 사용될 수 있다.
본 발명에서 용어, "배양물"은 유산균을 공지의 액체 배지 또는 고체 배지에서 배양시켜 수득한 사물을 의미하며, 본 발명에서는 신규한 유산균을 포함하는 개념이다.
본 발명에서 간질환은 비알코올성 지방간, 비알코올성 지방간염, 간경화 및 간암으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 뇌질환은 알츠하이머병, 헌팅턴병, 혈관성 치매증, 파킨슨병, 루게릭병, 크로이츠펠트-야코프병, 두부 손상에 의한 치매, 학습장애, 경도 인지 장애, 픽병, 실인증, 건망증, 실어증, 실행증 및 섬망으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 실시태양에서, 본 발명에 따른 유산균은 최종당화산물인 MGO-AGEs 또는 GO-AGEs에 대한 파쇄 효능을 나타낸다. 본 발명에서 용어 "최종당화산물 파쇄 효능"은 중간산물체인 메틸글리옥살 (MGO) 또는 글리옥살 (GO)을 알부민 (albumin)과 함께 당화시켜 제조된 교차결합된 최종당화산물을 직접적으로 파쇄하는 효능을 의미한다. 이와 같이 MGO-AGEs 또는 GO-AGEs에 비피도박테리움 롱검 Z1 균주가 농도의존적으로 파쇄하는 효능을 확인할 수 있다. 본 발명에 따른 유산균은 최종당화산물을 파쇄하는 활성을 가질 수 있다.
또한, 본 발명의 일 실시태양에서 쥐로부터 분리된 대식세포에 염증 반응 유도물질인 리포폴리사카라이드와 함께 비피도박테리움 롱검 Z1 균주의 처리시 염증반응이 현저히 억제되는 것을 확인하였다. 이를 통해, 상기 비피도박테리움 롱검 Z1 균주를 포함하는 약학 조성물이 염증 질환의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있는 것을 확인하였다.
또한, 본 발명에 따른 유산균은 마우스의 신경아세포종 (mouse neuroblastoma cell) 세포주에서 최종당화산물의 중간산물체인 메틸글리옥살 (MGO)을 억제함으로써, 신경세포 생존율을 증가시키고, 젖산 탈수소효소 (lactate dehydrogenase, LDH) 및 활성산소종 (reactive oxygen species, ROS) 생성량을 감소시켜 뇌 신경세포 보호 효과를 나타낸다.
본 발명에서 신경보호에는 AKT, Bax, Bcl-2, Cytochrome C, Caspase-3 등과 같은 세포사멸 연관 단백질이 관여하며, 이들 단백질의 발현 수준을 통하여 신경세포 보호 정도를 확인할 수 있다. 본 발명에 따른 유산균은 신경세포 보호와 관련 있는 상기 뇌 단백질의 발현을 조절할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 유산균은 세포 내에 염증 반응에 중요한 역할을 하는 미토겐-활성화 단백질 키나아제 (mitogen-activated protein kinase, MAPK) 신호전달 경로를 조절하며, 핵 전사 인자인 NF-κB 발현량을 감소시킬 수 있다. 세포 내 신호전달 체계를 통해 NF-κB를 활성화시켜 염증성 사이토카인 및 iNOS, COX-2 등의 발현을 촉진시킨다. 특히, NF-κB는 ERK1/2, p38, JNK 속하는 미토겐-활성화 단백질 키나아제 (MAPK) 신호전달 체계와 밀접한 관련이 있어 염증 조절에서 중요한 역할을 수행하는 것으로 알려져 있다 (Suppression of MAPK and NF-κB pathways by limonene contributes to attenuation of lipopolysaccharide-induced inflammatory responses in acute lung injury. Inflammation, 2013, 36, 501-511).
일 실시태양에서, 본 발명에 따른 유산균은 글리옥살레이즈 (glyoxalase) 1 (Glo-1) 및 2 (Glo-2) 활성을 높이며, 메틸글리옥살 (MGO)으로부터 산화적 손상이 유도된 세포의 보호와 관련된 nuclear factor E2-related factor 2 (Nrf2) 및 헴산화효소-1 (heme oxygenase-1, HO-1) 단백질 발현을 증대시킬 수 있다. 본 발명에서 "글리옥살레이즈 (glyoxalase)" 용어는 정상적인 대사 작용의 부산물인 메틸글리옥살 (MGO)과 같은 반응성 옥소-알데히드를 젖산, 글리콜산 등으로 전환하여 해독화시키는 (detoxification) 효소계 (enzyme system)를 구성하는 일 효소를 의미한다. 이러한 해독화는 두 종류의 티올-의존성 (thio-dependent) 효소인 Glo-1과 Glo-2의 작용에 의해 이루어진다 (Methylglyoxal, the foe and friend of glyoxalase and Trx/TrxR systems in HT22 nerve cells. Free Radical Biology and Medicine, 2015, 89, 8-19). 따라서, Glo-1 및 Glo-2의 활성이 높을수록 당독성 해독 능력이 높아지는 것을 의미한다.
일 실시태양에서, 쥐에 유산균을 7주일간 경구투여하고, 플라스마, 소장, 대장, 간 및 뇌 조직을 채취한 다음, 최종당화산물의 중간 산물인 메틸글리옥살 (MGO)의 농도를 HPLC 법으로 측정한 결과, 유산균을 1 x 109 cfu/kg으로 경구 투여한 군이 대조군과 비교하여 플라스마, 간 및 뇌의 조직에서 메틸글리옥살 (MGO)을 감소시키는 효과를 갖는 것을 확인하였다.
또한, 본 발명에 따른 유산균은 간 조직에서 정상 대조군에 비하여 글리옥살레이즈 (glyoxalase) 1 (Glo-1) 및 2 (Glo-2) 활성을 높이며, 메틸글리옥살 (MGO)으로부터 산화적 손상이 유도된 세포보호와 관련된 nuclear factor E2-related factor 2 (Nrf2) 및 heme oxygenase-1 (HO-1) 단백질 발현량을 증가시킬 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 유산균은 대조군과 비교하여 신경영양성 성장 인자 (neurotrophic growth factor, NGF), 뇌유래 신경영양인자 (brain-derived neurotrophic factor, BDNF)의 발현량을 증가시킬 수 있다. 신경영양인자 (neurotrophic factor)는 발생 과정 동안 신경세포의 생존과 분화를 조절하며, 개체의 일생 동안 신경 구조의 유지 및 신경전달 물질 방출 등의 기능에 영향을 끼친다 (Neuroprotection from diazinon-induced toxicity in differentiating murine N2a neuroblastoma cells. Neurotoxicology, 2009, 30(6), 958-964). 이러한 신경영양 인자의 예로 신경영양성 성장 인자 (NGF), 뇌유래 신경영양인자 (BDNF) 등이 존재한다. 신경영양성 성장 인자 (NGF)는 특정 뉴론의 생존, 유지, 성장에 중요한 단백질로 신경성장인자가 없는 경우 신경세포는 자멸하게 된다. 뇌유래 신경영양인자 (BDNF)는 신경계에서 여러 형태로 존재하는 것으로 알려져 있으며, 신경재생인자인 cAMP-responsive element binding (CREB)과 같은 뇌 단백질 발현에도 영향을 미친다. 본 발명에 따른 유산균은 신경영양인자 및 신경재생과 관련 있는 상기 뇌 단백질의 발현을 증가시킬 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은, 약학 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 유산균을 유효성분으로 포함하는 과민성 대장 증후군, 염증성 장질환, 간질환 및 뇌질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다. 일 실시태양에서, 상기 식품 조성물은 기억력 및 학습 능력 증진을 위해서도 사용될 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 일상적으로 섭취하는 것이 가능하기 때문에 인지 기능 장애, 신경 염증의 예방 또는 개선 효과를 기대할 수 있어 매우 유용하다.
본 발명의 식품 조성물은 환제, 분말, 과립, 침제, 정제, 캡슐 또는 액제 등의 형태를 포함하며, 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 예를 들어, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있다.
본 발명의 식품 조성물은 건강기능식품 및 건강식품 등을 포함한다.
상기 건강기능(성)식품 (functional food)이란, 특정보건용 식품(food for special health use, FoSHU)과 동일한 용어로, 영양 공급 외에도 생체조절기능이 효율적으로 나타나도록 가공된 의학, 의료효과가 높은 식품을 의미한다. 여기서 "기능(성)"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다. 본 발명의 식품은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조 가능하며, 상기 제조 시 당업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한 상기 식품의 제형 또한 식품으로 인정되는 제형이면 제한없이 제조될 수 있다. 본 발명의 식품 조성물은 다양한 형태의 제형으로 제조될 수 있으며, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어나, 본 발명의 식품은 인지 기능 장애 또는 신경 염증의 예방 또는 개선의 효과를 증진시키기 위한 보조제로 섭취가 가능하다.
본 발명에 따른 신규한 유산균인 비피도박테리움 롱검 Z1 (기탁번호 KCCM12660P) 균주 및 이의 용도에 관한 것으로, 당뇨합병증의 주요 원인인 최종당화산물을 파쇄하는 효능이 있다. 따라서, 본 발명에 따른 신규한 유산균은 과민성 대장 증후군, 염증성 장질환, 간질환 또는 뇌질환의 예방 또는 치료용 조성물로 이용될 수 있다.
도 1a 와 도 1b는 각각 최종당화산물 MGO-AGEs 또는 GO-AGEs에 대한 본 발명의 유산균인 비토박테리움 롱검 Z1 균주의 파쇄 효능을 도시한 것이다 (###P < 0.001 : Control group VS. MGO- or GO-AGEs group, $P < 0.05 or $$$P < 0.001 : MGO- or GO-AGEs group VS. Treated sample groups).
도 2a, 도 2b, 도 2c 및 도 2d는 마우스의 신경아세포종 (mouse neuroblastoma cell) 세포주에서 최종당화산물의 중간산물체인 메틸글리옥살 (MGO)으로 유도한 후, 유산균을 농도별로 처리하여 세포사멸율, 젖산 탈수소효소 (LDH) 및 활성산소종 (ROS) 생성량을 도시한 것이다 (#P < 0.05, ##P < 0.01 or ###P < 0.001 : Control group VS. MGO group, $$P < 0.01 or $$$P < 0.001 : MGO group VS. Treated sample groups).
도 3은 마우스의 신경아세포종 (mouse neuroblastoma cell) 세포주에서 유산균을 농도별로 처리하여 활성산소종 (ROS) 생성량을 현광 현미경(JuLI live-cell imaging system, NanoEnTek, Seoul, Korea)을 통하여 관찰한 결과를 도시한 것이다.
도 4a, 도 4b, 도 4c 및 도 4d는 마우스의 신경아세포종 (mouse neuroblastoma cell) 세포주에서 최종당화산물의 중간산물체인 메틸글리옥살 (MGO)으로 유도한 후, 유산균을 농도별로 처리하여 세포사멸사에 관련된 단백질 발현을 확인한 결과를 도시한 것이다 (#P < 0.05 or ##P < 0.01 : Control group VS. MGO group, *P < 0.05 or **P < 0.01 : MGO group VS. Treated sample groups).
도 5a, 도 5b, 도 5c, 도 5d 및 도 5e는 마우스의 신경아세포종 (mouse neuroblastoma cell) 세포주에서 최종당화산물의 중간산물체인 메틸글리옥살 (MGO)으로 유도한 후, 유산균을 농도별로 처리하여 염증 조절 인자와 관련된 단백질 발현을 확인한 결과를 도시한 것이다 (#P < 0.05, ##P < 0.01 or ###P < 0.001 : Control group VS. MGO group, *P < 0.05, **P < 0.01 or ***P < 0.001 : MGO group VS. Treated sample groups).
도 6a, 도 6b, 도 6c, 도 6d, 도 6e 및 도 6f는 마우스의 신경아세포종 (mouse neuroblastoma cell) 세포주에서 최종당화산물의 중간산물체인 메틸글리옥살 (MGO)으로 유도한 후, 유산균을 농도별로 처리하여 Glo-1, Glo-2 및 산화적 손상이 유도된 세포의 보호와 관련된 단백질 발현을 확인한 결과를 도시한 것이다 (#P < 0.05 or ###P < 0.001 : Control group VS. MGO group, *P < 0.05, **P < 0.01 or ***P < 0.001 : MGO group VS. Treated sample groups).
도 7a와 도 7b는 유산균의 Glo-1 활성을 효소면역측정법을 통해 확인한 결과를 도시한 것이다 (###P < 0.001 : VS. Control group, ***P < 0.001 : MGO group VS. Treated sample groups).
도 8a, 도 8b, 도 8c, 도 8d 및 도 8e 는 생쥐에 유산균을 1x109 cfu/kg (중량비 약 100 mg/kg)을 7일간 투여하고, 플라스마, 소장, 대장, 간 및 뇌 조직에서 최종당화산물의 중간산물체인 메틸글리옥살 (MGO)의 농도를 HPLC법으로 측정한 결과를 도시한 것이다 (*P < 0.05 or **P <0.01 vs. control)
도 9a, 도 9b, 도 9c, 도 9d, 도 9e 및 도 9f는 생쥐에 유산균을 1x109 cfu/kg (중량비 약 100 mg/kg)을 7일간 투여하고, 간 조직에서 Glo-1, Glo-2 및 산화적 손상이 유도된 세포보호와 관련된 단백질 발현을 확인한 결과를 도시한 것이다 (*P < 0.05 or **P < 0.01 vs. control).
도 10은 생쥐에 유산균을 1x109 cfu/kg (중량비 약 100 mg/kg)을 7일간 투여하고, 뇌 조직에서 신경영양인자 및 신경재생과 관련 있는 단백질의 발현을 확인한 결과를 도시한 것이다 (*P < 0.05 or **P < 0.01 vs. control).
도 11a 와 도 11b는 생쥐에 유산균을 1x109 cfu/kg (중량비 약 100 mg/kg)을 7일간 투여하고, 간과 뇌 조직에 H&E (hematoxylin & eosin) 염색을 통하여 현미경을 통하여 관찰한 결과를 도시한 것이다.
도 12a와 도 12b는 간 세포주 (HepG2)에서 최종당화산물의 중간산물체인 메틸글리옥살 (MGO)으로 유도한 후, 유산균을 농도별로 처리하여 세포사멸율을 도시한 것이다.
도 13a와 도 13b는 생쥐에 유산균을 2.5x107 cfu/kg (중량비 약 5 mg/kg, naive.) 및 1x108 cfu/kg (중량비 약 20 mg/kg, naive.)로 7일간 투여하고, Y자형 미로 실험에서 마우스의 자발적 변경 행동 비율 (도 13a) 및 신물질 탐색 실험에서의 인지지표 (도 13b)의 결과를 도시한 것이다 (*P < 0.05 or **P < 0.001 vs. control).
도 14a, 도14b 및 15c는 Z1 균주를 TNF-α (10 ng/ml)로 유도된 소장상피 세포주에 처리한 후 생성된 사이토카인 (IL-1β와 IL-6) 분비량의 결과를 도시한 것이다 (###P < 0.001 vs. Control group, *P < 0.05, **P < 0.01 or ***P < 0.001 vs. TNF-α group).
도 15a, 도 15b, 도 15c 및 도 15d는 생쥐에 Escherichia coli로 대장염을 유도하고, 이에 Z1 균주를 투여하여 대장염지표 (장길기, myeloperoxidase activity, TNF-α발현, IL-1β발현 결과를 도시한 것이다 (####P < 0.0001, ###P < 0.001, ##P < 0.01, or #P < 0.05 vs. Control group, *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, or ***P < 0.0001 vs. Escherichia coli group).
도 16은 TNF-α+INFγ (10 ng/ml)로 유도된 소장상피 세포주에서 균주 처리에 따른 세포 생존율 측정한 결과를 도시한 것이다 (###P < 0.001 vs. Control group, **P < 0.01, ***P < 0.001 vs. TNF-α+INFγ group).
도 17은 균주 처리에 따른 최종당화산물의 분해물인 유리 아민 (free amine)의 양을 측정한 결과를 도시한 것이다 (***P < 0.001 vs. Control group, #P < 0.5, ##P < 0.01, ###P < 0.001 vs. MGO-AGEs group).
이하, 첨부한 도면을 참조하여 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본원의 실시태양 및 실시예를 상세히 설명한다. 그러나 본원은 여러 가지 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시태양 및 실시예에 한정되지 않는다.
본원 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 “포함” 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
[실시예 1]
유산균의 분리 및 동정
1-1. 사람의 분변으로부터 유산균의 분리
사람의 분변을 GAM 액체 배지 (GAM broth; Nissui Pharmaceutical, Japan)에 넣고 현탁하였다. 그 후, 상등액을 취해 BL 한천 배지 (BL agar medium; Nissui Pharmaceutical, Japan)에 이식하고 37℃에서 약 48시간 동안 혐기적으로 배양한 후, 콜로니 (colony)를 형성한 균주들을 분리하였다.
1-2. 분리된 유산균의 동정
사람의 분변으로부터 분리된 균주들의 생리학적 특성 및 16S rDNA 서열을 분석하여 균주의 종을 확정하고, 균주명을 부여하였다. 부여된 유산균의 균주명은 하기 표 1과 같다.
균주명
1 Lactobacillus curvatus PH3
2 Lactobacillus plantarum H92
3 Lactobacillus gasseri L1
4 Lactobacillus gasseri Y5
5 Pediococcus acidilactici L2
6 Enterococcus faecium L3
7 Lactobacillus sakei Y4
8 Bifidobacterium longum Z1
9 Bifidobacterium longum BA1
10 Bifidobacterium pseudocatenulatium NA3
1-3. 신규한 비피도박테리움 롱검 Z1 균주의 생리학적 특성
상기 표 1에 기재된 균주들 중 비피도박테리움 롱검 Z1 (기탁번호 KCCM12660P) 균주는 그람양성 간균으로, 하기 표 2에 나타낸 바와 같이 서열번호 1로 표시되는 16S rDNA 염기서열을 갖는 것을 확인하였다. 상기 비피도박테리움 롱검 Z1 균주의 16S rDNA 염기서열을 BLAST 검색으로 비교한 결과, 동일한 16S rDNA 염기서열을 갖는 비피도박테리움 롱검 (Bifidobacterium longum) 균주는 검색되지 않아 비피도박테리움 롱검 Z1 균주는 신규한 균주인 것을 확인하였다.
sequence
TCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCGCCCCGTGTTGCCAGCGGATTATGCCGGGAACTCACGGGGGACCGCCGGGGTTAACTCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAGATCATCATGCCCCTTACGTCCAGGGCTTCACGCATGCTACAATGGCCGGTACAACGGGATGCGACGCGGCGACGCGGAGCGGATCCCTGAAAACCGGTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGGCGGAGTCGCTAGTAATCGCGAATCAGCAACGTCGCGGTGAATGCGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCAAGTCATGAAAGTGGGCAGCACCCGAAGCCGGTGGCCTAACCCCTTGTGGGATGGAGCCGTCTAAGGTGAGGCTCGTGATTGGGACTAATCGTA
비피도박테리움 롱검 Z1 균주의 생리학적 특성 중 탄소원 이용성을 API 50 CHL 키트를 사용하여 당 발효 시험으로 분석하였다. 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다. 하기 표 3에서 "+"는 탄소원 이용성이 양성인 경우를 나타내고, "-"는 탄소원 이용성이 음성인 경우를 나타내고, "±"는 탄소원이용성이 양성인지 음성인지 판단이 어려운 경우를 나타낸다.
탄소원 Z1 탄소원 Z1
대조군 (control) - 에스큘린 +
글리세롤 - 살리신 +
에리쓰리톨 - 셀로비오스 -
D-아라비노오스 - 말토오스 +
L-아라비노오스 + 락토오스 +
D-리보오스 + 멜리비오스 +
D-자일로오스 ± 수크로오스 +
L-자일로오스 - 트레할로오스 -
D-아도니톨 - 이뉼린 -
메틸-BD-자일로피라노사이드(Methyl-BD-Xylopyranoside) - 멜리지토오스 -
D-갈락토오스 + 라피노오스 +
D-글루코오스 + 전분 -
D-프럭토오스 + 글리코겐 -
D-만노오스 - 자일리톨 -
L-소르보오스 - 겐티오비오스 -
람노서스 - D-투라노오스 ±
둘시톨 - D-릭소오스 -
이노시톨 - D-타가토오스 -
만니톨 + D-푸코오스 -
솔비톨 + L-푸코오스 -
α-메틸-D-만노사이드 - D-아라비톨 -
α-메틸-D-글루코사이드 ± L-아라비톨 -
N-아세틸-글루코사민 - 글루코네이트 -
아미그달린 - 2-케토-글루코네이트 -
알부틴 - 5-케토-글루코네이트 -
[실시예 2]
분리된 유산균들의 활성 비교 - 대식세포에서의 염증 지표 측정
C57BL/6 생쥐 (male, 6주령 20-23 g)의 복강에 멸균된 4% 티오글라이콜레이트 (thioglycolate) 2 ㎖를 투여하였다. 96시간이 지난 뒤에 생쥐를 마취시키고, 생쥐의 복강에 RPMI 1640 배지 8 ㎖를 투여하였다. 5~10분 후에 생쥐의 복강 내의 RPMI 1640 배지(대식세포)를 뽑아, 1000 g에서 10분간 원심분리하고 다시 RPMI 1640 배지로 2회 세척하였다. 상기 대식세포를 0.5Х106 cell/well로 24-웰 플레이트에 깔고, 분리된 유산균 (최종 처리 농도: 1x104 cfu/ml, 이하 동일)과 염증 반응 유도 물질인 리포폴리사카라이드 (lipopolysaccharide, LPS)를 2시간 또는 24시간 동안 처리한 후 상등액 및 세포를 수득하였다. 수득한 세포를 RIPA 버퍼 (Gibco사)에 넣고 균질화하였다. LPS를 24시간 처리한 배양 상등액에서 TNF-α의 사이토카인 발현량 및 LPS를 2시간 동안 처리하여 수득한 세포에서 p65(NF-kB), p-p65(phosphor-NF-kB) 및 β-actin의 발현량을 면역블롯팅 (immunoblotting) 방법으로 측정하였다. 각 유산균 별 염증 지표의 발현 수준을 하기 표 4에 나타내었다.
관리번호 균주명 분류번호 TNF-α 발현억제능 NF-kB 발현억제능
1 Lactobacillus curvatus PH3 + +
2 Lactobacillus plantarum H92 + +
3 Lactobacillus gasseri L1 ++ ++
4 Lactobacillus gasseri Y5 + +
5 Pediococcus acidilactici L2 ++ +
6 Enterococcus faecium L3 ++ +
7 Lactobacillus sakei Y4 ++ +
8 Bifidobacterium longum Z1 +++ ++
9 Bifidobacterium longum BA1 ++ +
10 Bifidobacterium pseudocatenulatium NA3 + +
(표 4의 활성 측정시 기준: +++, >90%, 매우 강함; ++, >60-90%, 강함; +, >20-60%, 약함; -, <20%, 효과 미비)
상기 표 4에 나타낸 바와 같이, 비피도박테리움 롱검 Z1 균주를 처리한 모든 군에서 NF-kB의 활성이 억제되고, TNF-α의 발현량이 억제됨을 확인하였다.
[실시예 3]
분리된 유산균들의 활성 비교 - SH-SY5Y 신경세포의 뇌유래 신경영양인자 (BDNF) 발현량 측정
한국 세포주 은행에서 분양받은 SH-SY5Y 세포를 10%의 FBS 및 1%의 항생제가 첨가된 DMEM 배지에서 배양하고, 12-웰 플레이트에 2Х106 cell/well로 분주하였다. 그 후, 각 웰에 유산균 (1Υ104 CFU/㎖)과 함께 코티코스테론 (corticosterone)을 300 ㎎/㎖의 농도로 첨가하고 24시간 배양한 후, 세포를 분리하여 뇌유래신경영양인자 (BDNF, Brain-Derived Neurotrophic Factor)의 발현량을 면역블롯팅 (immunoblotting) 방법으로 측정하였다. 각 유산균 별 BDNF의 발현량을 하기 표 5에 나타내었다.
관리번호 균주명 분류번호 단백질발현양
(BDNF/β-actin)
Vehicle (생리식염수) - - (1.0)
1 Lactobacillus curvatus PH3 + (1.2)
2 Lactobacillus plantarum H92 + (1.1)
3 Lactobacillus gasseri L1 + (1.2)
4 Lactobacillus gasseri Y5 ++ (1.6)
5 Pediococcus acidilactici L2 + (1.2)
6 Enterococcus faecium L3 + (1.1)
7 Lactobacillus sakei Y4 - (1.0)
8 Bifidobacterium longum Z1 +++ (1.8)
9 Bifidobacterium longum BA1 ++ (1.4)
10 Bifidobacterium pseudocatenulatium NA3 ++ (1.5)
11 Lactobacillus johnsonii LJ - (1.0)
12 Lactobacillus reuteri L32 + (1.2)
13 Bifidobacterium longum K2 + (1.2)
14 Bifidobacterium bifidum K32 + (1.1)
15 Bifidobacterium adolescentis H5 ++ (1.5)
(표 5의 측정시 기준: +++, >70%; ++, 30~70%; +, 10~30%; -, <10%;)
상기 표 5에 나타낸 바와 같이, 비피도박테리움 롱검 Z1, BA1 및 K2를 처리한 모든 군에서 BDNF 발현량이 증가하였으며, 특히 비피도박테리움 롱검 Z1을 처리한 군이 비피도박테리움 롱검 BA1 및 K2를 처리한 군보다 BDNF 발현량이 현저히 증가한 것을 확인하였다.
[실시예 4]
최종당화산물 MGO-AGEs 또는 GO-AGEs에 대한 파쇄 효능 평가
메틸글리옥살 (MGO) 또는 글리옥살(GO)을 소 혈청 알부민(BSA) 및 아지드화 나트륨 (sodium azide)과 혼합한 후 7일 동안 37 ℃에 보관하여 최종당화산물 (AGEs)을 제조하였다. 메틸글리옥살 (MGO)로부터 유도된 최종당화산물을 MGO-AGEs, 글리옥살 (GO)로부터 유도된 최종당화산물을 GO-AGEs로 지칭하였다.
1 mg/ml의 MGO-AGEs 또는 GO-AGEs에 본 발명의 유산균을 0.1, 0.5, 및 1 mg/ml의 농도로 24시간 동안 처리하였다. 양성 대조군으로는 최종당화산물 (AGEs) 억제제로 알려진 1 mM 아미노구아니딘 (AG)을 사용하였다. TNBSA (2,4,6-트리니트로벤젠 설폰산), 4% 소듐바이카보네이트 (sodium bicarbonate) 시약을 넣어 반응시킨 후, 10% 소듐 도데실 설페이트 (sodium dodecyl sulfate) 및 1N 염산 용액을 첨가하여 반응을 정지시켰다. 마이크로플레이트 리더기를 이용하여 최종당화산물의 분해물인 유리 아민의 양을 335 nm에서 측정하여, 최종당화산물 (AGEs)의 파쇄 정도를 확인하였다. 본 발명의 유산균을 MGO-AGEs에 처리하였을 때의 결과를 도 1a에, GO-AGEs에 처리하였을 때의 결과를 도 1b에 나타내었다.
본 발명의 유산균은 최종당화산물만을 처리한 음성 대조군 (MGO-AGEs 또는 GO-AGEs)과 비교하여 유리 아민의 양을 증가시켰다. 특히, 1 mg/ml의 본 발명의 유산균을 처리하였을 경우 최종당화산물 MGO-AGEs 또는 GO-AGEs의 분해 정도가 양성 대조군 (아미노구아니딘 1 mM)의 최종당화산물 분해 정도보다 높거나 유사함을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 유산균은 최종당화산물 파쇄 활성이 매우 우수함을 확인하였다.
[실시예 5]
메틸글리옥살(MGO)로 유도된 N2a 신경세포에서의 세포 보호능 평가
5-1. 신경세포주에서 메틸글리옥살(MGO) 농도 설정
한국 세포주 은행에서 분양받은 N2a 세포를 10% FBS 및 1% 항생제가 첨가된 DMEM (Dulbeco's Modified Eagle's Media) 배지에서 배양하고, 96-웰 플레이트에 2Υ104 cell/well로 분주하고 24시간 동안 안정화시켰다. 그 후, 메틸글리옥살 (MGO)을 다양한 농도 (1 내지 1000 μM)로 처리하고 24시간 동안 배양하였다. 배지를 제거한 후, 0.5 mg/ml 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT) 용액을 1시간 처리하고, 환원된 포르마잔 (formazan)을 150 μl의 디메틸설폭사이드 (DMSO)에 녹여 570 nm 파장에서 미세분광광도계 (microspectrophotometer)로 세포 생존율 (cell viability)을 측정하였다. 아무것도 처리하지 않은 정상 대조군 (Control)의 세포 생존율을 100%로 하여, 메틸글리옥살 (MGO)을 처리한 경우의 세포 생존율을 평가하여 그 결과를 도 2a에 나타내었다.
도 2a로부터 알 수 있는 바와 같이, 메틸글리옥살 (MGO)의 다양한 농도로 처리한 결과 세포 생존율은 정상 대조군에 비하여 농도의존적으로 세포 생존율이 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 특히, 500 μM 농도로 처리한 경우에는 세포 생존율이 약 40% 감소하여, 이를 기준으로 유산균의 세포보호능을 확인하였다.
5-2. 500 μM의 메틸글리옥살 (MGO)로 유도된 신경세포주에서의 세포 생존율 및 젖산 탈수소효소(LDH) 함량 측정
N2a 세포를 2 x 104 cell/well로 96-웰 플레이트에 분주하고 24시간 동안 안정화시켰다. 그 후, 세포에 10 μg/ml의 유산균 또는 1 mM의 아미노구아니딘 (AG)을 1시간 동안 전처리한 뒤에, 500 μM의 메틸글리옥살 (MGO) 후처리하여 24시간 동안 배양하였다.
처리된 배지는 Pierce LDH cytotoxicity assay kit (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)을 통하여 젖산 탈수소효소 (LDH) 함량을 490 nm 파장에서 미세분광광도계 (microspectrophotometer)로 측정하였다. 아무것도 처리하지 않은 정상 대조군 (Control)의 세포 생존율을 100%로 하여, 메틸글리옥살 (MGO) 및 유산균을 처리한 경우의 젖산 탈수소효소 (LDH) 함량을 계산하였다. 젖산 탈수소효소 (LDH) 측정 키트 (kit)는 세포에서 방출한 젖산 탈수소효소 (LDH)를 고감도로 측정함으로써 세포 손상도를 측정할 수 있는 키트이다.
상기 실시예 5-1에서 나타낸 세포사멸 실험과 동일한 방법으로 처리하여 500 μM의 MGO로 유도된 신경세포주에서 유산균 처리에 따른 세포사멸율을 확인하여 도 2b에 나타내었다.
도 2b로부터 알 수 있는 바와 같이, 메틸글리옥살 (MGO)을 처리한 군 (음성 대조군)에서는 세포 생존율이 50%로 감소하였으며, 유산균을 전처리 한 군에서는 음성 대조군에 비하여 생존율이 약 25% 더 높은 것으로 나타났다. 따라서 본 발명의 유산균은 최종당화산물의 중간 산물체인 메틸글리옥살 (MGO)에 대한 세포보호능이 우수한 것을 확인하였다.
도 2c로부터 알 수 있는 바와 같이, 메틸글리옥살 (MGO)을 처리한 군에서는 젖산 탈수소효소 (LDH) 함량이 정상 대조군에 비하여 약 1.5배 증가하는 것을 확인할 수 있었으며, 유산균을 전처리한 군에서는 유의적으로 젖산 탈수소효소 (LDH) 함량이 감소되었다. 특히, 10 μg/ml의 유산균을 처리했을 경우 양성 대조군인 1 mM의 아미노구아니딘 (AG) 처리군만큼 젖산 탈수소효소 (LDH) 함량을 유의적으로 감소시켰다. 따라서, 본 발명의 유산균은 메틸글리옥살 (MGO)을 통한 세포 손상을 현저히 감소시키는 것을 확인하였다.
5-3. 500 μM의 메틸글리옥살(MGO)로 유도된 신경세포주에서의 활성산소종 (ROS) 함량 측정
활성산소종 (ROS) 함량 측정은 다음과 같은 원리를 통하여 측정하였다. 구체적으로, 세포 내에서 활성산소가 발생되면, 2',7'-dichlorofluresceindiacetate (DCFDA)가 에스테라아제 (esterase) 또는 산화적 가수분해에 DCFH로 탈아세틸화되고 DCFH는 활성 산소에 의해 산화되어 2',7'-dichlorofluorescein (DCF)로 전환된다. 배양된 N2a 세포에 상기 실시예 5-2와 동일한 방법으로 메틸글리옥살 (MGO) 및 유산균을 처리한 후, PBS로 세척하고 10 μM의 2',7'-dichlorofluorescein diacetate (DCFDA, Sigma-Aldrich, MO, USA)을 30분 동안 암실에서 반응시켰다. 세포의 형광도 (excitation wave length 490 nm; emission wave length 525 nm)를 multilabel plate reader기를 통하여 측정하였다 (VITORTM X3, Perkin Elmer, MA, USA). 아무것도 처리하지 않은 정상 대조군 (Control)의 ROS 함량을 100%로 하여, 메틸글리옥살 (MGO) 및 유산균을 처리한 경우의 활성산소종 (ROS) 함량을 계산하여 도 2d에 나타내었다.
도 2d로부터 알 수 있는 바와 같이, 메틸글리옥살 (MGO)을 처리한 군에서 생성된 활성산소종 (ROS) 함량이 정상 대조군에 비하여 약 4배 증가하였고, 유산균을 전처리 한 군에서 활성산소종 (ROS) 함량이 유의적으로 감소하였다.
5-4. 500 μM의 메틸글리옥살 (MGO)로 유도된 신경세포주에서의 세포 내 활성산소종 (ROS) 생성량 측정
세포 내에서 활성산소종 (ROS) 생성량을 측정하기 위하여, N2a 세포를 3 x 105 cell/well로 6-웰 플레이트에 분주한 것을 제외하고는 상기 실시예 5-3과 동일한 방법으로 시험을 수행하였다. 세포 내에 존재하는 활성산소종 (ROS)을 현광현미경 (JuLI live-cell imaging system, NanoEnTek, Seoul, Korea)을 통하여 관찰하여 그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 메틸글리옥살 (MGO)을 처리한 군에서 활성산소종 (ROS) 생성량이 증가된 것을 확인할 수 있었고, 실시예 5-3과 동일한 결과를 얻었다.
5-5. 500 μM의 메틸글리옥살 (MGO)로 유도된 신경세포주에서의 세포사멸사와 관련된 단백질의 발현 확인
N2a 세포를 1 x 106 cell/well로 60 mm dish에 분주하고 24시간 동안 안정화시켰다. 그 후, 세포에 1, 5, 및 10 μg/ml의 유산균 또는 1 mM의 아미노구아니딘 (AG)을 1시간 동안 전처리한 뒤에, 500 μM 메틸글리옥살 (MGO)을 후처리하여 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 완전히 가득찬 세포를 PBS로 세척하고, 용해 버퍼 (lysis buffer) (PRO-PREPTM Protein Extraction Solution, Intron Biotechnology, Seongnam, Korea)를 사용하여 용해시켰다. 그 후, 소 혈청 알부민 (bovine serum albumin, BSA)을 표준으로 하여, Bio-Rad Protein Assay (Bio-Rad, Califonia, USA)로 상기 용해물 상측액의 단백질 함량을 측정하여 각 시료의 총 단백질 함량을 조정하였다. 그 후, 전기영동을 위해 10-12% SDS-PAGE 겔에 상기 시료들을 각각 30 μg의 단백질량이 되도록 로딩하고, PVDF 멤브레인으로 옮겼다. 상기 멤브레인을 5% 탈지유로 블록킹한 후, AKT, pAKT, Bax, Bcl-2. Cytochrome C, Total Caspase-3, Cleaved Caspase-3 및 α-튜불린 (α-Tubulin) (Cell Signaling Technologies, Massachusetts, USA)에 대한 항체를 각각 이용하여 ChmiDoc XRS+ imaging system (Bio-Rad, CA, USA)으로 검출하여, 그 결과를 도 4a 내지 4d에 나타내었다.
AKT 단백질은 세린 (serine)과 트레오닌 (threonine)을 인산화시키는 단백질로서 세포신호전달에 있어서 중심적 역학을 담당하며, 세포사멸사 (apoptosis)의 억제로 인해 세포의 생존이 유지된다. 도 4a에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 유산균은 농도의존적으로 메틸글리옥살 (MGO) 처리군에 비하여 AKT 발현량을 유의적으로 증가시켰다. 따라서, 유산균은 세포 생존과 관련된 단백질을 직접적으로 조절하는 것을 확인하였다.
Bcl-2/Bax family에 속하는 유전자인 Bcl-2는 세포사멸사 (apoptosis) 유발을 억제하는 항-세포사멸 (anti-apoptotic) 분지이며, Bax는 세포사멸사 (apoptosis) 유발을 촉진하는 세포사멸-유도 (pro-apoptotic) 분지이다. 상기 두 유전자는 세포의 미토콘드리아 (mitochondria)로부터 사이토크롬 c (cytochrome c)를 유리시켜 종양억제 유전자인 카스파제-3(caspase-3) 등과 같은 연관 단백질 인자 활성을 조절한다. 도 4b에서 알 수 있는 바와 같이, Bax/Bcl-2 비율을 조사한 결과 역시 농도의존적으로 현저하게 세포사멸사 (apoptosis) 유발단백질의 발현이 메틸글리옥살 (MGO)의 처리에 의하여 조절되고 있는 것으로 나타났다. 반면, 본 발명의 유산균을 처리한 군에서는 세포사멸사 (apoptosis) 유발을 촉진하는 Bax의 발현이 억제되고 세포사멸사 (apoptosis)를 저해시키는 Bcl-2의 발현이 억제되여, 본 발명의 유산균은 세포사멸사 (apoptosis)를 저해함으로써 세포 생존을 유지시키는 것을 확인하였다.
도 4c와 4d에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 유산균은 사이토크롬-c (cytochrome c)를 유리시키는 것을 억제하고, 세포사멸사 (apoptosis)를 유도하는 자극에 의하여 활성화되는 카스파제-3 (caspase-3)을 직접적으로 억제하는 것을 확인하였다.
5-6. 500 μM의 메틸글리옥살 (MGO)로 유도된 신경세포주에서의 염증 조절 인자와 관련된 단백질 발현 확인
염증 조절 인자와 관련된 단백질 발현을 확인하기 위하여, MAPK 기전 관련 단백질 발현 확인은 상기 실시예 5-5와 동일한 방법을 통하여 진행하였다. p38, pp38, JNK, pJNK, ERK1/2, pERK1/2, 및 α-튜불린 (α-Tubulin) (Cell Signaling Technologies, Massachusetts, USA)에 대한 항체를 각각 이용하여 ChmiDoc XRS+ imaging system (Bio-Rad, CA, USA)으로 검출하였다.
한편, 항염증 활성의 상위 신호전달 기전으로 작용하는 NF-κB 및 pIκB의 활성 정도를 분석하기 위하여 세포를 세포질과 핵 단백질을 분리하여 확인하였다. 구체적으로, 상기 실시예 5-5와 동일한 방법으로 유산균 또는 아미노구아디닌을 전처리하고 MGO를 후처리한 후, 세포를 PBS로 수세한 다음 NEPER nuclear and cytoplasmic extraction reagents (Thermo scientific, Rockford, IL, USA)를 이용하였다. Cytoplasmic extraction reagent (CER) I에서 10 분, CERII에서 1분간 반응한 후, 15,000 rpm에서 5분간 원심분리하여 얻은 상등액은 세포질 획으로 사용하였다. 남은 cell pellet은 nuclear extraction reagent (NER)을 넣어 40분 동안 반응하여 15분간 원심 분리를 통해 핵 분획 단백질을 추출하였다. 얻어진 브래드퍼드 단백질 정량법 (Bradford assay)을 통해 정량화 하였고, 30 μg의 단백질은 8-12% SDS-PAGE gel에서 전기영동하여 PVDF 멤브레인에 전이시킨 후, NF-κB, pIκB, histamine, 및 α-튜불린 (α-Tubulin) (Cell Signaling Technologies, Massachusetts, USA)에 대한 항체를 각각 이용하여 ChmiDoc XRS+ imaging system (Bio-Rad, CA, USA)으로 단백질 발현량을 검출하여 도 5a 내지 5c에 나타내었다.
도 5a, 도 5b 및 도 5c에서 알 수 있는 바와 같이, 메틸글리옥살 (MGO) 만을 처리하였을 때 p38, pERK1/2, 및 pJNK의 발현이 정상 대조군에 비해 현저히 증가하였다. 반면, 본 발명의 유산균을 전처리한 군에서는 농도의존적으로 상기 단백질의 발현이 현저히 억제되었다. 이는 유산균이 MAPK 신호전달경로의 억제를 통해 항염증 작용을 발휘하는 것임을 알 수 있다.
염증 활성의 상위 신호전달 기전으로 작용하는 NF-κB 신호전달과 연관성이 있는지를 알아보기 위해 NF-κB 및 IκB의 활성정도를 분석하였다. NF-κB는 염증성 단백질의 발현을 조절하는 전사인자로 핵으로의 전좌 (translocation)와 IκB의 인산화를 통해 이의 활성화가 조절된다. 도 5d 와 5e에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 유산균의 신경염증 저해 작용은 IκB의 인산화를 억제하여 NF-κB의 핵으로의 전이를 억제시켜 NF-κB의 활성화를 조절함으로써 이루어지는 것을 확인하였다. NF-κB의 활성 조절은 알츠하이머 질환을 유발하는 신경염 진행과정에 중요한 역할을 수행한다. 본 발명의 유산균에 의한 NF-κB 활성의 적절한 조절은 염증으로 촉발되는 신경 질환 제어에 효율적으로 적용될 수 있다.
5-7. 500 μM의 메틸글리옥살 (MGO)로 유도된 신경세포주에서의 Glo-1, Glo-2 및 산화적 손상이 유도된 세포의 보호와 관련된 단백질 발현 확인
Glo-1 및 Glo-2 단백질 발현을 확인하기 위하여, 상기 실시예 5-5와 동일한 방법을 통하여 진행하였다. Glo-1, Glo-2 및 α-튜불린 (α-Tubulin) (Cell Signaling Technologies, Massachusetts, USA)에 대한 항체를 각각 이용하여 ChmiDoc XRS+ imaging system (Bio-Rad, CA, USA)으로 단백질 발현량을 검출하였다.
한편, 산화적 손상이 유도된 세포 보호에 작용하는 Nrf-2, HO-1 등과 같은 단백질 발현을 확인하기 위하여 세포를 세포질과 핵 단백질을 분리하여 확인하였다. 구체적으로, 상위 실시예 5-6와 동일한 방법으로 처리한 후, 세포를 PBS로 수세한 다음 NEPER nuclear and cytoplasmic extraction reagents (Thermo scientific, Rockford, IL, USA)를 이용하였다. Cytoplasmic extraction reagent (CER) I에서 10 분, CERII에서 1분간 반응한 후, 15,000 rpm에서 5분간 원심분리하여 얻은 상측액은 세포질 획으로 사용하였다. 남은 cell pellet은 nuclear extraction reagent (NER)을 넣어 40분 동안 반응하여 15분간 원심 분리를 통해 핵 분획 단백질을 추출하였다. 얻어진 브래드 퍼드 단백질 정량법 (Bradford assay)을 통해 정량화 하였고, 30 μg의 단백질은 8-12% SDS-PAGE gel에서 전기영동하여 PVDF 멤브레인에 전이시킨 후, Nrf2, Keap1, HO-1, histamine 및 α-Tubulin (Cell Signaling Technologies, Massachusetts, USA)에 대한 항체를 각각 이용하여 ChmiDoc XRS+ imaging system (Bio-Rad, CA, USA)으로 단백질 발현량을 검출하였다.
글리옥살레이즈 시스템 (Glyoxalase system)의 생리적 역할은 생체 내에서 생성되거나 장내세균이 합성하여 흡수한 최종당화산물의 중간산물 중 한가지인 메틸글리옥살 (MGO)을 젖산으로 생성하게 함으로써 해독작용을 하는 것이다. 이 무독화 반응은 Glo-1과 Glo-2의 2종의 티올 (thiol) 의존성 효소의 연속적인 반응에 의해서 이루어져 있다.
도 6a와 도 6b에서 알 수 있는 바와 같이, 메틸글리옥살 (MGO)로 유도한 N2a 세포주에서 Glo-1과 Glo-2의 발현이 정상 대조군에 비해 유의적으로 현저히 증가하였다. 반면, 본 발명의 유산균을 전처리한 군에서는 농도의존적으로 신경세포주에서 현저히 억제하였다. 이는 유산균이 최종당화산물 중간산물체인 메틸글리옥살 (MGO)을 무독화시키는 작용을 하는 것으로 나타났다.
항산화/해독화 효소의 발현에 기여하는 Nrf2는 세포질에서 Keap1와 함께 복합체로 존재하다가, 활성산소종 (ROS)을 감지함으로써 산화-환원 신호전달 체계를 인지하고 분리된다. 분리된 Nrf2는 핵으로 이동하여 해독화 또는 항산화 효소의 전사를 활성화시키며, HO-1의 효소 활성 및 발현 증가를 유도하여 세포보호를 유지시켜 준다.
도 6c, 도 6d 및 도 6e에서 알 수 있는 바와 같이, 세포질과 핵 내에서 유산균의 처리에 따라 Nrf2의 발현이 정상 대조군에 비해 유의적으로 현저히 증가하였고, Keap1 또한 유의적으로 증가되는 것을 확인할 수 있었다. 최종적으로 Nrf2의 대표적인 표적 유전자인 HO-1의 발현이 유의적으로 증가되었다. 이러한 효소 반의 생성물들은 활성산소종 (ROS) 제거를 통해 항산화 및 세포 보호 기능에서 중요한 역할을 하는 것으로 확인되었다.
5-8. Glo-1 활성도 측정 확인
Glo-1은 글리옥살레이즈 시스템 (Glyoxalase system)에서 해독작용을 하는 세포질 효소이다. 구체적으로 Glo-1은 글리옥살레이즈 시스템 (glyoxalase system)의 중간체인 S-D-락토일글루타티온 (S-D-lactoylglutathione)을 통하여 메틸글리옥살 (MGO)과 같은 α-케토알데히드 (α-ketoaldehydes)를 D-젖산(D-lactic acid)으로 해독하는 역할을 한다. 이러한 역할을 본 발명의 유산균이 직접적으로 Glo-1 활성을 지니는 지를 Glyoxalase 1 activity assay kit을 사용하여 240 nm에서 미세분광광도계 (microspectrophotometer)로 측정하였다. 아무것도 처리하지 않은 정상 대조군 (Control)의 활성산소종 (ROS) 함량을 1로 하여, 메틸글리옥살 (MGO) 또는 유산균을 처리한 경우의 Glo-1 활성을 나타내었다.
7a에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 유산균을 직접적으로 처리하였을 때 농도의존적으로 활성도가 높아지는 것을 확인할 수 있었다.
7b에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 유산균은 메틸글리옥살 (MGO)로 유도된 신경세포주 내에서 처리하였을 때에도 농도의존적으로 glo-1 활성을 양성 대조군만큼 증대시키는 것으로 나타났다. 이는 유산균이 직접적으로 글리옥살레이즈 시스템 (glyoxalase system)에서 glo-1 활성을 직접적으로 증가시킬 수 있다.
[실시예 6]
비피도박테리움 롱검 Z1 균주 투여
C57BL/6 (Male, 6주령)은 대한바이오링크 (Korea)에서 구입하였으며, 고형사료 (삼양사료)와 물을 충분히 공급하고 실온 22 ± 2℃ 습도 50~70%, 조명시간 12시간(08:00∼20:00), 조도 150∼300 Lux로 설정하여 1주일 간 실험실 환경에 적응시킨 후 실험에 사용하였다. C57BL/6 생쥐를 동물 사육실의 환경에 1주일간 적응시킨 후, 7일동안 매일 1x109 cfu/kg (중량비 약 100 mg/kg, naive.) 로 경구투여를 하였다. 또한, 생쥐에는 0.2 ml씩 투여하였고, 정상군 (n = 4, control)과 경구투여군을 나누어 진행하였다. 7일째에 플라스마, 소장, 대장, 간 및 뇌를 채취하였고 HPLC 분석 및 분자 생물적 기전을 확인하였다.
6-1. HPLC 분석
Dhar et al. 논문을 참고로 메틸글리옥살 (MGO)의 양을 전처리 한 각 시료를 측정하였다 (PMID: 19299210). 혈액은 30분간 12,000 rpm으로 원심분리한 후, 상층액을 채취하여 플라스마를 얻었다. 채취한 플라스마 100 μl에 냉각 과염소산 (PBS 중 0.1M)을 즉시 첨가한 다음, 1분 동안 초음파 처리하여 완전히 균질화 하였다. 균질화한 (homogenized) 후 24시간 동안 10 mM o-phenlyenediamine (o-PD) 및 0.45N perchloric acid 용매와 각각 반응시켰다. 반응 후, 여과하고 HPLC vial에 옮겨 20% ACN 용매 조건으로 분석하였다. 메틸글리옥살 (MGO)은 o-PD와 반응하여 2-Quinoxaline의 유도체가 생성되어 HPLC에 검출되며 internal standard로 5-methylauinoxlaine (5-MQ)을 처리 후, 0.2 μm 주사기 필터를 통해 여과하여 HPLC (high performance liquid chromatography)를 이용하여 분석하였다.
소장, 대장, 간 및 뇌는 무게보다 약 2배의 PBS를 첨가하여 균질화 하였다. 100 μl의 균질액을 채취하고, 냉각 과염소산 (PBS 중 0.1M)을 즉시 첨가한 다음, 1분 동안 초음파 처리하여 완전히 균질화 하였다. 균질화한 후, 플라스마 분석방법과 동일하게 진행하였다.
상위 분석들은 분리 모듈 (e2695)에서 포토다이오드 어레이 (photodiode array) 검출기와 연결되는 liquid chromatographic water system (Waters Corp., Milford, MA, USA)을 사용하여 분석하였다.
도 8a에서 알 수 있는 바와 같이, 정상 대조군에 비하여 유산균 투여군에서 유의적이지는 않으나 메틸글리옥살 (MGO) level이 감소하는 것으로 나타났다.
도 8b와 도 8c에서 알 수 있는 바와 같이, 소장과 대장에서는 정상군과 유사한 메틸글리옥살 (MGO) level인 것을 보였다.
도 8d와 도 8e에서 알 수 있는 바와 같이, 간과 뇌에서 정상군보다 유의적으로 메틸글리옥살 (MGO) level 현저히 감소되는 것을 확인할 수 있었다. 이는 세포상에서 실시된 실시예 5의 결과를 뒷받침할 수 있는 근거로서, 뇌 질환 등과 같은 당뇨합병증의 예방, 개선 또는 치료에 효과적으로 사용될 수 있는 것을 확인하였다.
6-2. 간 조직에서의 Glo-1, Glo-2 및 세포보호와 관련된 단백질 발현 확인
본 실험예에서는 마우스의 간 조직을 균질화한 후 24시간 동안 용해 버퍼 (lysis buffer)를 넣고 단백질을 추출하였다. 단백질 추출 후, 브래드 퍼드 단백질 정량법 (Bradford assay)을 통해서 정량한 후 샘플을 제작하였다. 그 후, SDS-PAGE로 변성 분리하여, 이를 PVDF membrane에 transfer하였다. 그 후, 1차 항체를 하룻밤 동안 반응시킨 후, 2차 항체를 결합시키고 ChmiDoc XRS+ imaging system (Bio-Rad, CA, USA)을 이용해서 실시예 5-7과 동일한 방법으로 진행하였다.
도 9a와 도 9b에서 알 수 있는 바와 같이, Glo-1과 Glo-2의 발현이 정상 대조군에 비해 유산균 경구투여군에서 유의적으로 현저히 증가하였다. 세포 상에서 확인한 최종당화산물의 중간산물체인 메틸글리옥살 (MGO)을 무독화시키는 작용을 하는 것을 뒷받침할 수 있는 근거임을 시사한다.
도 9c, 도 9d, 도 9e 및 도 9f에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 유산균을 경구 투여한 군에서 Nrf2의 발현 인자를 유의적으로 증가시켰으며, Nrf2의 표적 유전자인 HO-1의 발현이 유의적이지는 않으나 증가시켰다. 이는 도 8d에서 보여주는 결과와 같이 최종당화산물의 중간산물체인 메틸글리옥살 (MGO) level를 떨어트리면서 세포보호 효능을 증가시킬 수 있는 것으로 나타났다.
6-3. 뇌 조직에서의 신경영양인자 관련 단백질 발현 확인
본 실험예에서는 마우스의 뇌 조직을 균질화한 후 24시간 동안 용해 버퍼 (lysis buffer)를 넣고 단백질을 추출하였다. 단백질 추출 후, 브래드 퍼드 단백질 정량법 (Bradford assay)을 통해서 정량한 후 샘플을 제작하였다. 그 후, SDS-PAGE로 변성 분리하여, 이를 PVDF membrane에 transfer하였다. 그 후, BDNF, TrkA, pTrkA, NGF, AKT, pAKT, ERK, pERK, CREB, pCREB 및 (α-튜불린) α-Tubulin (Cell Signaling Technologies, Massachusetts, USA)에 대한 항체를 각각 이용하여 ChmiDoc XRS+ imaging system (Bio-Rad, CA, USA)으로 검출하였다.
신경성장인자인 NGF는 TrkA 수용기에 결합하여 phosphatidylinositol 3-kinase (PI3-K)와 같은 effector들을 끌어 들인다. PI3-K와 extracellular signal-regulated kinase (ERK) 또는 MAPK 활성화시킨다. 이러한 활성화는 AKT (protein kinase B)의 활성을 유도함으로써 신경세포의 생존을 조절하고, ERK활성을 유도함으로써, CREB 인자를 활성화시킨다. CREB는 세포주기, 신경 돌기 성장 및 시냅스 가소성 조절에 중요한 역할을 담당한다. BDNF는 신경 성장촉진인자 중 하나로 신경 전달 물질의 조절이나 신경 가소성에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 뇌에서 BDNF 발현과 수용체인 TrkB의 자극을 통하여 신호전달 물질인 CREB, ERK, AKT 활성화를 가속화시켜 신경세포 보호에 관여한다.
도 10에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 유산균을 경구투여시에 NGF의 발현을 증가시킴에 따라 TrkA의 발현을 증가시킴을 확인하였다. 이를 통하여 AKT와 ERK 단백질 발현을 증가시킴을 확인할 수 있었고, 최종적으로 CREB의 발현을 높이는 것으로 확인되었다. 또한, 유산균의 경구투여는 정상 대조군에 비하여 BDNF도 발현을 증가시킴을 확인할 수 있었다. 따라서, 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) Z1 균주는 도 8e에서 보여지는 바와 같이 메틸글리옥살 (MGO) level을 감소할 뿐 만 아니라, 신경성장인자를 자극에 따른 신경보호 효과를 나타내었다.
6-4. 간과 뇌조에서의 조직병리학적 (H&E staining) 분석
고정한 간 및 뇌 조직은 삭정, 탈수 및 파라핀 포매 등의 일반적인 조직처리 과정을 거쳐 조직절편을 제작하여 작절한 후, Hematoxylin & Eosin (H&E) 염색을 실시하였다. 이 방법은 동물조직학에서 일반적으로 염색법으로 H&E staining은 검 푸른색을 내는 헤마톡실린 (Hematoxylin)과 붉은 색을 나타내는 에오신 (Eosin)의 두 염료를 이용하여 세포의 핵과 세포질을 관찰할 수 있다. 세포 핵은 검푸른색으로 염색되며 대부분의 세포질 성분은 분홍색 또는 붉은색으로 염색된다.
도 11a에서 알 수 있는 바와 같이, 간을 적출한 후 H&E 염색을 통하여 관찰한 결과, 정상 대조군의 간조직에서 간문맥과 실질이 정상적인 구조를 유지하고 있었다. 본 발명의 유산균을 경구투여 한 간조직에서는 정상 대조군 이상으로 간문맥과 실질이 정상적인 구조를 유지하고 있었다. 뿐 만 아니라, 간 세포의 괴사, 염증세포 침윤, 혹은 지방변성 등의 변화를 발견할 수 없었다.
도 11a에서 알 수 있는 바와 같이, 정상 대조군의 H&E 염색 조직표본에서 해마의 조직학적 관찰을 확인한 바, 피라미드 층의 신경세포들은 핵과 신경세포체가 원형이고, 핵소체가 뚜렷하며, 핵염색질은 산재된 상염색질 상태였고, 경계가 명확한 4-6층으로 균일하게 배열되어 있었다. 본 발명의 유산균을 경구투여 한 뇌조직에서는 정상 대조군보다 피라미드 층의 신경세포들이 깨끗한 형태로 있었다.
위 결과로부터 본 발명의 유산균은 최종당화산물을 파쇄하는 활성을 가지고, 장-간-뇌 축을 통하여 신경 보호 효능을 나타냄을 확인할 수 있었다.
[실시예 7]
1 mM 메틸글리옥살 (MGO)로 유도된 간 세포주에서의 세포사멸율
HepG2 세포를 2 x 104 cell/well로 96-웰 플레이트에 분주하고 24시간 동안 안정화시켰다. 그 후, 세포에 1, 5, 10 및 100 μg/ml의 Z1 유산균을 1시간 동안 전처리한 후, 1 mM의 메틸글리옥살 (MGO) 후처리하여 24시간 동안 배양하였다. 배지를 제거한 후, 0.5 mg/ml MTT 용액을 1시간 처리하고, 환원된 포르마잔 (formazan)을 150 μl의 디메틸설폭사이드 (DMSO)에 녹여 570 nm 파장에서 미세분광광도계 (microspectrophotometer)로 세포 생존율 (cell viability)을 측정하였다.
도 12a에 나타낸 바와 같이, 간세포주에서 Z1는 독성을 나타내지 않았으며, 도 12b에 나타낸 바와 같이 MGO로 유도된 간세포주에서 농도의존적으로 세포 보호 효능을 갖는 것을 확인하였다.
[실시예 8]
Z1 균주의 인지기능 개선 효능 확인
하기의 실험방법을 이용하여, Z1 균주를 1주일간 처리 후 기억력이 개선되는지 여부를 확인하였다.
C57BL/6 (Male, 6주령)은 오리엔트바이오 (한국)에서 구입하였으며, 고형사료 (삼양사료)와 물을 충분히 공급하고 실온 22 ± 2℃ 습도 50~70%, 조명시간 12시간 (08:00∼20:00), 조도 150∼300 Lux로 설정하여 1주일간 실험실 환경에 적응시킨 후 실험에 사용하였다. C57BL/6 생쥐를 동물 사육실의 환경에 1주일간 적응시킨 후, 7일동안 매일 2.5x107 cfu/kg (중량비 약 5 mg/kg, naive.) 및 1x108 cfu/kg (중량비 약 20 mg/kg, naive.) 로 경구투여를 하였다. 또한, 생쥐에는 0.2 ml씩 투여하였고, 정상군 (n = 7, control), 2.5x107 cfu/kg Z1 경구투여군 (n = 7) 및 1x108 cfu/kg Z1 경구투여군 (n = 7)을 나누어 진행하였다.
양성대조군으로 인지력 장애증상 개선에 사용되고 있는 피라세탐 (piracetam, PC) 400 mg/kg를 사용하였다.
8-1. Y자형 미로 실험 (Y-maze task)
공간 인지능력 평가를 위하여 Y자형 미로 실험을 수행하였다. 길이 60 cm, 넓이 4 cm, 높이 12 cm의 Y자 모양의 사방이 막힌 미로에서 세 개의 길을 각각 A, B, C로 정한 후 가운데에 마우스를 넣고 8분 동안 관찰하여 들어간 총 출입 횟수를 기록하였다. 세 개의 다른 가지에 차례로 들어간 경우, 변경 횟수 (alternation number) 1 회로 계산하였고, 연속으로 들어가지 않으면 변경 횟수로 계산하지 않았다. 변경 횟수는 3 가지 모두에 차례로 들어가는 것으로 정의되며, 공간 인지기능 평가를 위한 계산은 다음의 수식을 이용하여 계산하였다.
자발적 변경 행동 비율 (spontaneous alternation, %) = 총 변경 횟수/(총 출입 횟수-2)Х100
도 13a에 나타낸 바와 같이 Y자형 미로 실험 결과, 자발적 변경 행동 비율 (spontaneous alternation)은 Z1 투여한 군에서 각각 52.25% (2.5x107 cfu/kg Z1 경구투여군), 56.82% (1.0x108 cfu/kg Z1 경구투여군)로, 양성대조군 (PC)인 피라세탐 투여한 군과 비교하여 각각 5.54%, 10.11% 더 높은 수치를 나타내어 더욱 우수한 기억력 개선 효과를 나타내었다.
8-2. 신물체 탐색 실험 (novel object recognition test, NORT)
마우스를 행동 관찰실로 옮겨 5분간 적응시킨 뒤 3분의 노출시행에서는 상자에 동일한 물체 두 개 (1 set)를 40 cm 간격으로 놓고, 마우스가 3분 동안 물체를 탐색하는 시간을 측정하였다. 하루가 지난 후 인출시행에서는 동일한 상자에 노출시 계시했던 물체 한 개와 새롭게 대치된 물체 한 개를 준비해 놓고, 마우스가 탐색하는 시간을 측정하였다. 인지 지표 (recognition index, %)는 신물체의 선호도 (신물체를 탐색하는 시간/전체 탐색한 시간) X 100으로 환산한 것이다.
도 13b에 나타낸 바와 같이 신물체 탐색 결과, Z1 투여한 군에서 각각 60.83% (2.5x107 cfu/kg Z1 경구투여군) 및 67.40% (1.0x108 cfu/kg Z1 경구투여군)로, 양성대조군 (PC)인 피라세탐 투여한 군과 비교하여 각각 3.81%, 10.37% 더 높은 수치를 나타내어 우수한 인지기능 개선 효과를 갖는 것을 확인하였다.
[실시예 9]
TNF-α로 유도된 소장상피 세포주에서 Z1 균주의 cytokine 억제능
Human small intestinal epithelial cell(HIEC)-6 (소장상피 세포주)를 8 x 104 cell/well로 96 well plate에 분주하고, 세포에 Z1 균주를 1, 5, 10, 25, 50 및 100 μg/ml 처리하고 30분 후에 TNF-α(10 ng/ml)를 24시간 동안 배양하였다. 이후, 배양 배지를 모아 효소면역측정법인 Competitive Enzyme-Linked Immuno Assay (ELISA) kit (R&D systems, Minneapolis, MN, USA)를 통해, HIEC-6 소장상피세포 배양 상층액에 생성된 사이토카인 (IL-1β와 IL-6) 분비량을 정량하여 측정하였다.
도14a에 나타낸 바와 같이, Z1 균주는 TNF-α (10 ng/ml)로 처리된 소장상피 세포주에서 농도의존적으로 세포독성을 보호하는 것을 확인할 수 있다.
도14b 및 14c에 나타낸 바와 같이 Z1 균주는 IL-1β와 IL-6 각각을 TNF-α(10 ng/ml)로 처리된 그룹에 비하여 농도의존적으로 분비량을 감소시키는 것을 확인하였다.
따라서, Z1 균주는 장내세포에서 TNF-α와 같은 염증성 인자를 억제시키는 우수한 효과를 갖는 것을 알 수 있다.
[실시예 10]
유산균의 대장염 개선 효능 확인
C57BL/6 수컷 생쥐 (5주령 19-21 g)를 한 군에 6마리씩으로 하여 1주간 실험실에 적응시켰다. 한 군은 정상군으로 나머지 군은 실험 군으로 하였다. 정상군에는 생리식염수를 투여하였으며, 실험군에는 대장균 (1x109 CFU/mouse/day)을 매일 1회씩 5일간 경구투여하였다. 이후, 익일부터 Z1 균주를 1x108 CFU/마우스, 5x108 CFU/마우스, 1x109 CFU/마우스 농도로, sulfasalazine 50 mg/kg (마우스)을 농도로 각각 5일간 매일 1회씩 투여하였다.
이후 익일 (최종 유산균 투여하고 20시간후)마우스를 마취시키고, 장길이, myeloperoxidase activity (MPO), TNF-α, IL-1β의 염증 반응 지표 물질을 측정하였다.
10-1. 장길이 측정
상기 마우스의 복부를 해부하여 대장을 분리하여 장길이를 측정하였으며, 그 결과를 도 15a에 나타내었다. 도 15a에 나타낸 바와 같이, Z1 유산균의 농도가 증가할수록 장길이가 증가하고 고농도에서는 정상 대조군과 동일한 장길이를 나타내는 것을 확인하였다
10-2. 미엘로퍼옥시다아제 (Myeloperoxidase, MPO) 활성 측정
대장조직 100㎎에 0.5% 헥사데실 트리메틸 암모늄 브롬화물 (hexadecyl trimethyl ammonium bromide) 함유 10 mM 인산칼슘 완충액 (potassium phosphate buffer, pH 7.0) 200 ㎕를 넣고 균질화하였다. 4℃ 및 10,000 g의 조건에서 10 분간 원심분리하여 상등액을 얻었다. 이를 조효소액으로 사용하였다. 조효소액 50 ㎕를 0.95 ㎖의 반응액 (1.6 mM 태투러매탈 밴자단 (tetramethyl benzidin)과 0.1 mM H2O2 함유)에 넣고 37℃에서 반응시키면서 650 ㎚에서 경시적으로 흡광도를 측정하였다. 상기 미엘로퍼옥시다아제의 활성은 반응물로서 생긴 H2O2 1μmol/ml을 1 유닛으로 계산하였다. 상기 측정 결과를 도 15b에 나타내었다. 도 15b에 나타낸 바와 같이, Z1 균주를 투여한 군에서 미엘로퍼옥시다아제의 활성이 현저히 감소하는 것을 확인하였다.
10-3. 염증 지표 측정
TNF-α, IL-1β과 같은 염증 반응 지표 물질을 측정하였다. 구체적으로, 상기 미엘로퍼옥시다아제 (Myeloperoxidase, MPO) 활성 측정 실험과 동일한 방법으로 상등액을 얻고, 상등액 50 ㎍을 취해 ELISA 키트 (eBioscience사)를 이용하여 사이토카인은 측정하여 그 결과를 도 15c 및 도 15d에 나타내었다. 도 15c 및 도 15c에 나타낸 바와 같이, Z1 균주를 투여한 군에서 TNF-α 및 IL-1β 발현이 감소하는 것을 확인하였다.
결국, Escherichia coli의 투여군은 다양한 지표를 통해 대장염을 유발한 것을 확인할 수 있고, Z1 균주는 농도의존적으로 Escherichia coli에 의해 야기된 다양한 대장염 지표들 (장길이수축, MPO 활성, TNF-α/IL-1β 발현)을 현저히 개선하는 효과를 갖는 것을 알 수 있다. 따라서, Z1 균주는 현재 의약품으로 사용하는 sulfasalazine (SF)와 같이, 과민성 대장 증후군, 염증성 장질환 등의 대장 질환을 예방 및 치료하는 효과를 갖는 것을 알 수 있다.
[실시예 11]
TNF-α+INFγ로 유도된 소장상피 세포주에서 Z1 균주의 세포 보호능 확인
Human small intestinal epithelial cell(HIEC)-6 (소장상피 세포주)를 8 x 105 cell/well로 96 well 조직 배양 플레이트에 분주하여 24시간 배양시켰다. 각 균주 (BA1: Bifidobacterium longum subsp. Longum, BA3: Bifidobacterium pseudocatenulatum, Z1: Bifidobacterium longum subsp.longum, PH3: Lactobacillus curvatus, H92: Lactobacillus plantarum, L1: Lactobacillus gasseri, L2: Pediococcus acidilactici, L3: Enterococcus faecium, Y4: Lactobacillus sakei)를 1 및 10 μg/ml로 1시간 전처리한 후, 10 ng/ml TNF-α+INFγ으로 후처리하여 24시간 배양하였다. 배지를 제거한 후, 0.5 mg/ml 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) 용액을 1시간 처리하고, 환원된 포르마잔 (formazan)을 150 μl의 디메틸설폭사이드 (DMSO)에 녹여 570 nm 파장에서 미세분광광도계 (microspectrophotometer)로 세포 생존율 (cell viability)을 측정하였다.
도 16에 나타낸 바와 같이, Z1 균주는 TNF-α+INFγ (10 ng/ml)로 유도된 소장상피 세포주에서 가장 높은 세포 생존율을 나타내었고, 따라서 Z1 외 다른 균주들 (BA1, BA3, Z1, PH3, H92, L1, L2, L3, Y4)보다 우수한 세포 보호능을 갖는 것을 확인하였다. 특히, 동일한 종의 비피도박테리움 롱검 균주 (BA1)보다도 현저하게 우수한 것을 확인하였다.
[실시예 12]
Z1 균주의 최종당화산물(AGEs) 분해 효과 확인
메틸글리옥살 (MGO)을 소 혈청 알부민 (BSA)과 혼합하여 최종당화산물을 생성한 후, 1 mg/ml 최종당화산물에 각 균주 (BA1: Bifidobacterium longum subsp. Longum, BA3: Bifidobacterium pseudocatenulatum, Z1: Bifidobacterium longum subsp.longum, PH3: Lactobacillus curvatus, H92: Lactobacillus plantarum, L1: Lactobacillus gasseri, L2: Pediococcus acidilactici, L3: Enterococcus faecium, Y4: Lactobacillus sakei)를 1 mg/ml의 농도로 24시간 처리하였다. 반응 후, TNBSA (2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid), 4% 소듐바이카보네이트 (sodium bicarbonate), 10% 소듐 도델실 설페이트 (sodium dedecylsulfate) 및 1N 염산용액을 포함하는 시약을 첨가하였다. 마이크로플레이트 리더기를 이용하여 최종당화산물의 분해물인 유리 아민 (free amine)의 양을 335 nm에서 측정하여, 최종당화산물의 분해 정도를 확인하였다. 최종당화산물의 억제제인 아미노구아니딘 (AG)을 양성대조군으로 사용하였다.
도 17에 나타낸 바와 같이, Z1 균주는 가장 많은 유리 아민양을 나타내었으며, 따라서 Z1 외 다른 균주들 (BA1, BA3, Z1, PH3, H92, L1, L2, L3, Y4)보다 우수하게 최종당화산물 분해하는 것을 확인하였다. 특히, 동일한 종의 비피도박테리움 롱검 균주 (BA1)보다도 현저하게 우수한 것을 확인하였다.
Figure PCTKR2021015482-appb-img-000001

Claims (9)

  1. 비피도박테리움 롱검 Z1 (기탁번호 KCCM12660P) 균주.
  2. 비피도박테리움 롱검 Z1 (기탁번호 KCCM12660P) 균주, 이의 생균체, 이의 사균체, 이의 배양물, 이의 파쇄물, 이의 추출물, 이의 천연물 또는 이의 화합물을 포함하는, 과민성 대장 증후군, 염증성 장질환, 간질환 또는 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 간 질환은 비알코올성 지방간, 비알코올성 지방간염, 간경화 및 간암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 과민성 대장 증후군, 염증성 장질환, 간질환 또는 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  4. 제2항에 있어서,
    상기 뇌질환은 알츠하이머병, 헌팅턴병, 혈관성 치매증, 파킨슨병, 루게릭병, 크로이츠펠트-야코프병, 두부 손상에 의한 치매, 학습장애, 경도 인지 장애, 픽병, 실인증, 건망증, 실어증, 실행증 및 섬망으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 과민성 대장 증후군, 염증성 장질환, 간질환 또는 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  5. 비피도박테리움 롱검 Z1 (기탁번호 KCCM12660P) 균주, 이의 생균체, 이의 사균체, 이의 배양물, 이의 파쇄물, 이의 추출물, 이의 천연물 또는 이의 화합물을 포함하는, 과민성 대장 증후군, 염증성 장질환, 간질환 또는 뇌질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
  6. 비피도박테리움 롱검 Z1 (기탁번호 KCCM12660P) 균주, 이의 생균체, 이의 사균체, 이의 배양물, 이의 파쇄물, 이의 추출물, 이의 천연물 또는 이의 화합물을 포함하는, 과민성 대장 증후군, 염증성 장질환, 간질환 또는 뇌질환의 예방 또는 개선용 정장용 조성물.
  7. 비피도박테리움 롱검 Z1 (기탁번호 KCCM12660P) 균주, 이의 생균체, 이의 사균체, 이의 배양물, 이의 파쇄물, 이의 추출물, 이의 천연물 또는 이의 화합물을 포함하는, 과민성 대장 증후군, 염증성 장질환, 간질환 또는 뇌질환의 예방 또는 개선용 생균제 조성물.
  8. 비피도박테리움 롱검 Z1 (기탁번호 KCCM12660P) 균주, 이의 생균체, 이의 사균체, 이의 배양물, 이의 파쇄물, 이의 추출물, 이의 천연물 또는 이의 화합물을 포함하는, 과민성 대장 증후군, 염증성 장질환, 간질환 또는 뇌질환의 예방 또는 개선용 사료용 조성물.
  9. 비피도박테리움 롱검 Z1 (기탁번호 KCCM12660P) 균주, 이의 생균체, 이의 사균체, 이의 배양물, 이의 파쇄물, 이의 추출물, 이의 천연물 또는 이의 화합물을 포함하는, 과민성 대장 증후군, 염증성 장질환, 간질환 및 뇌질환의 예방 또는 개선용 발효 제품.
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Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115887504B (zh) * 2022-09-16 2024-03-26 江南大学 长双歧杆菌ccfm1029在缓解帕金森病中的应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2110028A1 (en) * 2008-04-15 2009-10-21 Nestec S.A. Bifidobacterium longum and hippocampal BDNF expression
JP2010522553A (ja) * 2007-03-28 2010-07-08 アリメンタリー・ヘルス・リミテッド プロバイオティック性のビフィドバクテリウム菌株
KR20180091802A (ko) * 2015-09-15 2018-08-16 경희대학교 산학협력단 다양한 기능성을 가진 신규 유산균 및 이의 용도
KR20190058332A (ko) * 2017-11-20 2019-05-29 경희대학교 산학협력단 신규 유산균 및 이의 용도

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101087972B1 (ko) 2009-11-24 2011-12-01 일동제약주식회사 치매, 치매관련 질환의 예방/치료 및 인지기능장애 개선에 효과가 있는 유산균 발효 산물, 이의 제조방법 및 용도
ITMI20120471A1 (it) * 2012-03-26 2013-09-27 Giovanni Mogna Composizione a base di ceppi di batteri bifidobacterium longum in grado di aiutare il prolungamento della vita
CN104781390B (zh) 2012-08-16 2017-07-28 庆熙大学校产学协力团 具有对衰老及痴呆的预防和/或治疗活性的乳酸菌
KR101899234B1 (ko) 2017-01-12 2018-09-17 가천대학교 산학협력단 전나무 메탄올 추출물, 이의 분획물 또는 이들로부터 분리한 화합물을 포함하는 최종당화산물 관련 질환의 예방 또는 치료용 조성물
JP6894242B2 (ja) * 2017-01-24 2021-06-30 雪印メグミルク株式会社 非アルコール性肝障害抑制剤

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010522553A (ja) * 2007-03-28 2010-07-08 アリメンタリー・ヘルス・リミテッド プロバイオティック性のビフィドバクテリウム菌株
EP2110028A1 (en) * 2008-04-15 2009-10-21 Nestec S.A. Bifidobacterium longum and hippocampal BDNF expression
KR20180091802A (ko) * 2015-09-15 2018-08-16 경희대학교 산학협력단 다양한 기능성을 가진 신규 유산균 및 이의 용도
KR20190058332A (ko) * 2017-11-20 2019-05-29 경희대학교 산학협력단 신규 유산균 및 이의 용도

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LEE HAE-JI, LEE KYUNG-EON, KIM JEON-KYUNG, KIM DONG-HYUN: "Suppression of gut dysbiosis by Bifidobacterium longum alleviates cognitive decline in 5XFAD transgenic and aged mice", SCIENTIFIC REPORTS, vol. 9, no. 1, 1 December 2019 (2019-12-01), pages 11814, XP055926738, DOI: 10.1038/s41598-019-48342-7 *

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