CN114487193B - 一种同时测定多种水溶性维生素的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及维生素检测分析领域，具体涉及一种同时测定多种水溶性维生素的方法。所述方法采用高效液相色谱进行检测分析，其中供试品溶液的制备包括将待测样品加入酸化乙醇溶液中，超声，过滤，加溶剂溶解即得，所述酸化乙醇为盐酸乙醇或冰乙酸乙醇，可以避免含有钙、镁、铁、锌、铜等多营养成分的样品中各种成分的干扰，方法简便，安全，只需要一次样品前处理，一种流动相，试剂简单，且进一次样就可以同时测定5种维生素的含量。

Description

一种同时测定多种水溶性维生素的方法
技术领域
本发明涉及维生素检测分析领域，具体涉及一种同时测定多种水溶性维生素的方法。
背景技术
多种维生素矿物质片(简称多维多矿片)中含有人体所必需的多种维生素和矿物质，如维生素A、维生素D、维生素E、维生素K2、维生素B1、维生素B2、维生素B6、维生素B12、烟酰胺/烟酸、泛酸、生物素，钙、铁、锌、镁、铜、硒等，添加的化合物种类多，添加量差别大，能够快速、准确的对每种营养素进行定量，是产品质量控制的关键。
目前维生素检测的方法主要依据是食品国家标准和中国药典，比如维生素B1检测标准是GB 5009.84，按国标和药典测定，一种高效液相检测方法只能检测一种维生素，检测效率低，周期长，人工和设备成本高，不利于产品的质量控制，并且检测过程中过多有毒有害试剂的使用，会对人体造成损害，对环境也造成了污染。
现有的高效液相检测方法最多一次只能同时测定3种以上所述的维生素含量，如“GB/T5009.197-2003《保健食品中盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇、烟酸、烟酰胺和咖啡因的测定》”可以同时测定盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇、烟酰胺/烟酸的含量，但是该方法的流动相中添加了离子对试剂硫酸月桂酯钠、1-癸烷磺酸钠容易污染损坏色谱柱，大大增加检测成本。
除国家标准外，还有一些文献也记载了同时测定多种维生素的方法如下。
中国发明专利申请CN111595970A公开了高效液相色谱检测复方三维右旋泛酸钙糖浆维生素的方法，以乙睛为流动相A相，以含十二烷基硫酸钠的甲酸水溶液为流动相B相，取待测溶液进行HPLC检测后，根据色谱图对维生素B1、维生素B2、维生素B6、烟酰胺4种维生素进行定性和/或定量分析；所述HPLC检测过程中采用梯度洗脱。中国发明专利申请CN105116087A公开了一种复合维生素B中多种组分含量的检测方法，HPLC检测的色谱条件为采用C18色谱柱,以乙腈为流动相有机相，庚烷磺酸钠和磷酸的水溶液为流动相水相，进行梯度洗脱，获得泛酸、烟酰胺、维生素B6、维生素B2、维生素B1含量。中国发明专利申请CN108088920B公开了一种复方三维右旋泛酸钙糖浆中5种维生素的UHILIC_MS_MS检测方法，包括，取样品滤液按样品滤液：内标溶液体积比为10:990的比例加入内标溶液后得到供试品溶液；将上述操作得到的供试品溶液注入快速，液相色谱串联质谱仪按如下条件进行检测后，用于复方三维右旋泛酸钙糖浆中5种维生素的定性和/或定量分析，流动相条件为流动相A，含甲酸的90％乙腈溶液；流动相B，含甲酸和甲酸铵水溶液。
上述方法对多种水溶性维生素的检测分析进行了研究，但是有的用液质联用或者流动相中有离子对试剂的方法，其液质联用仪器昂贵，使用成本高，应用范围少；其含有离子对的流动相容易污染和损坏色谱柱。同时以上专利涉及的产品，都只含有多种维生素，不含容易干扰维生素检测的钙、镁、锌、铜、锰、硒等矿物质，不能用于同时含维生素和矿物质的产品。
中国发明专利申请CN201911422329.6公开了测定复杂组分中生物素的高效液相色谱分析方法，是以0.1M磷酸二氢钾、0.01M磷酸氢二钾混合溶液-乙腈为流动相进行梯度洗脱，可避免其他组分的干扰，在30分钟内准确灵敏地检测出生物素的含量。该方法专属性强，但是仅能准确测定一种维生素的含量。
针对本发明技术方案，实际拟解决的是现有技术当中存在的如下技术问题：
同时含有多种维生素和矿物质的多维多矿片，由于钙、镁、锌、铜、锰、硒等矿物质的存在，在样品检测前处理过程中，容易与维生素络合而影响液相检测结果的准确性。为了排除干扰物保证检测结果的准确性，样品前处理过程通常比较繁琐。复杂繁琐的前处理虽然去掉了干扰物，相应的一次可以同时检测的目标物也会减少，不能一次同时检测多种维生素。目前现有的技术文献中没有可以同时测定多维多矿片中5种水溶性维生素(维生素B1、维生素B2、维生素B6、烟酰胺、泛酸)，本发明利用简单的前处理过程排除了多种矿物质的干扰，而且可以同时测定5种水溶性维生素。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明提供一种同时测定多种水溶性维生素的方法，方法简便可行，快速、准确，可以大大降低产品的质量控制成本，安全无害，可适用于企业质量控制。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种同时测定多种水溶性维生素的方法，所述方法中供试品溶液的制备包括将待测样品加入酸化乙醇溶液中，超声，过滤，加溶剂溶解即得。
优选地，所述酸化乙醇为盐酸乙醇或冰乙酸乙醇。
优选地，所述盐酸乙醇中盐酸的体积浓度为1‰～1％，所述冰乙酸乙醇中冰乙酸的体积浓度为5‰～1％。
优选地，所述样品与酸化乙醇溶液的质量体积比为0.25g:10-30mL。
优选地，所述超声的时间15-25min，所述过滤还包括过滤后取滤液0.5-2mL进行氮吹至全干；所述溶剂与待测样品的体积质量比为2-10mL：1g。
优选地，所述方法中对照品溶液的制备包括将对照品用磷酸溶液溶解即得，所述对照品包括维生素B1、维生素B2、维生素B6、烟酰胺、泛酸或泛酸盐中的至少一种。
优选地，所述维生素B1、维生素B2、维生素B6的质量浓度分别为1.5-5μg/mL，烟酰胺、泛酸或泛酸盐的质量浓度分别为6-20μg/mL。
优选地，所述方法采用高效液相色谱进行检测分析，其中液相色谱条件中流动相A为磷酸溶液，流动相B为乙腈，梯度洗脱程序为：
0min，A：B为96-100:0-4，V/V；
10-13min，A：B为96-100:0-4，V/V；
13-15min，A：B为83-88:12-17，V/V；
18-21min，A：B为83-88:12-17，V/V；
22-23min，A：B为96-100:0-4，V/V；
34-36min，A：B为96-100:0-4，V/V；
或：
0min，A：B为96-100:0-4，V/V；
18-20min，A：B为96-100:0-4，V/V；
21-25min，A：B为88-93:12-17，V/V；
38-41min，A：B为88-93:12-17，V/V；
42-44min，A：B为96-100:0-4，V/V；
48-52min，A：B为96-100:0-4，V/V。
优选洗脱程序如下：
0min，A：B(96-100:0-4，V/V)；
12min，A：B(96-100:0-4，V/V)；
14min，A：B(83-88:12-17，V/V)；
20min，A：B(83-88:12-17，V/V)；
22min，A：B(96-100:0-4，V/V)；
35min，A：B(96-100:0-4，V/V)。
优选地，所述流动相A的pH＝2.0。
优选地，所述液相色谱条件中流速为0.8-1.5mL/min，柱温为20-30℃。
优选地，所述水溶性维生素包括维生素B1、维生素B2、维生素B6、烟酰胺、泛酸或泛酸盐中的至少一种。
优选地，所述维生素B1、维生素B2、维生素B6和烟酰胺的检测波长为260-280nm，所述泛酸或泛酸盐的检测波长为200-220nm。
优选地，所述液相色谱条件中色谱柱选自反相C18色谱柱或反相C8色谱柱。
本发明的再一目的是提供上述方法在检测分析包含有维生素B1、维生素B2、维生素B6、烟酰胺或或泛酸盐中至少一种的产品中的应用。
优选地，所述产品同时含有维生素类物质和矿物质。
优选地，所述矿物质包括钙、镁、铁、锌、铜中的一种或几种。
优选地，上述方法在同时测定含有维生素B1、维生素B2、维生素B6、烟酰胺、泛酸钙的药品或保健食品或食品中的应用。
本发明的有益效果：
(1)本发明提供一种同时测定多种维生素的方法，并且流动相中不含离子对试剂，可极大地提高检测效率和降低检测成本。
(2)由于多种维生素矿物质片除目标营养素外，还含有钙、镁、铁、锌、铜等矿物质，辅料大多为碳水化合物，有的营养素中还含有蛋白质、氨基酸等多种营养成分，在研究过程中发现，这种多营养成分的样品只用无水乙醇提取比同种样品用国标检测维生素B6和烟酰胺重复性差，国标中大多需要添加离子对试剂或者荧光检测，否则杂峰过多，峰分离度也差；本发明采用酸化乙醇等处理方法对样品进行前处理，可以排除这些矿物质对目标B族维生素含量检测的影响，可完全做到杂质峰无干扰，方法重复性好，回收率高等。方法简便可行，安全无害，可适用于企业质量控制。
(3)本发明建立的方法可以快速、准确的测定多种维生素矿物质片中五种维生素，只需要一次样品前处理，一种流动相，试剂简单，绿色环保，且进一次样就可以同时测定5种维生素的含量。
附图说明
图1为实施例1维生素B1、维生素B2、维生素B6和烟酰胺在270nm处标准品图谱；270nm处图谱的目标峰为B1(维生素B1)，YXA(烟酰胺)、B6(维生素B6)、B2(维生素B2)。
图2为实施例1泛酸钙在210nm处的标准品图谱；210nm处图谱的目标峰为FS(泛酸钙)。
图3为实施例1供试品在270nm处图谱。
图4为实施例1供试品在210nm处图谱。
图5为实施例6多种维生素矿物质片(成人型)在270nm处图谱。
图6为实施例6多种维生素矿物质片(成人型)在210nm处图谱。
图7为实施例7多种维生素矿物质片(乳母型)在270nm处图谱。
图8为实施例7多种维生素矿物质片(乳母型)在210nm处图谱。
图9为维生素B1标准曲线图。
图10为维生素B2标准曲线图。
图11为维生素B6标准曲线图。
图12为烟酰胺标准曲线图。
图13为泛酸钙标准曲线图。
图14为实施例8供试品色谱图。
图15为对比例1在270nm图谱。
图16为对比例1在210nm图谱。
图17为对比例2在270nm图谱。
图18为对比例2在210nm图谱。
图19为对比例3色谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步阐述。
以下实施例中采用的样品为多种维生素矿物质片(孕妇乳母型)，片重1.1g/片，样品中含有维生素A、维生素D3、维生素E、维生素K2、维生素B1、维生素B2、维生素B6、维生素B12、烟酰胺、泛酸钙、生物素等11种维生素和钙、铁、锌、镁、铜、硒等多种矿物质。
对照品溶液的制备：
五种维生素储备液：分别精密称取维生素B1、维生素B2、维生素B6、烟酰胺标准品和泛酸钙标准品10mg于5个10mL容量瓶中，用流动相磷酸水溶液(pH＝2)分别稀释得到浓度分别为1.0mg/mL、1.0mg/mL、1.0mg/mL、1.0mg/mL和1.0mg/mL的贮备溶液，此总称为贮备溶液①；
五种维生素混合中间液：准确吸取维生素B1标准储备液1.00mL、维生素B2标准储备液1.00mL、维生素B6标准储备液1.00mL、烟酰胺标准储备液4.0mL和泛酸钙标准储备液4.0mL于20mL容量瓶中，用流动相定容至刻度，混匀。此为贮备溶液②；此时贮备溶液②中维生素B1浓度为50.0μg/mL、维生素B2浓度为50.0μg/mL、维生素B6浓度为50.0μg/mL、烟酰胺浓度为200.0μg/mL和泛酸钙浓度为200.0μg/mL。
五种维生素对照品溶液：准确吸取贮备溶液②3.00mL于50mL容量瓶中，用流动相定容至刻度，混匀，此为贮备溶液③，即得。
实施例1
供试品溶液的制备：精确称取0.25g多种维生素矿物质片(孕妇乳母型)于锥形瓶中，精密量取加入20mL酸化乙醇(1‰的盐酸乙醇)，超声20min充分提取后，放漏斗滤纸过滤，滤液滤尽后，精密量取1.00mL滤液于10mL离心管中，氮吹至全干后，加入流动相磷酸溶液5.00mL定容至刻度。充分摇匀，将供试品溶液和上述制备得到的五种维生素对照品溶液过0.45μm微孔滤膜后注入进样瓶，排列在进样板上，等待仪器分析。
高效液相色谱条件：
色谱柱：5μm反相C18色谱柱(250mm×4.6mm)或具有相同效果的色谱柱，如：反相C8色谱柱(250mm×4.6mm)；
流动相：流动相A为磷酸溶液(pH＝2.0)，流动相B为乙腈，梯度洗脱条件如下表1。
表1梯度洗脱程序
时间(min) 流动相(A) 流动相(B)
0 100 0
12 100 0
14 85 15
20 85 15
22 100 0
35 100 0
检测波长：泛酸钙波长210nm，维生素B1、维生素B2、维生素B6和烟酰胺/烟酸波长270nm；
流速：1.0mL/min；
柱温：25℃；
进样量：20μL；
检测器：紫外检测器。
计算公式
将维生素B1、烟酰胺/烟酸、维生素B6、泛酸钙和维生素B2标准系列工作溶液分别注入高效液相色谱仪中，测定相应的色谱峰面积，以标准工作液的浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线；将供试品溶液注入高效液相色谱仪中，在同样色谱条件下得到色谱峰面积，根据标准曲线得到供试品溶液中目标物的浓度。计算公式如下：
其中：Xi为待测样品中维生素的含量，单位为mg/100g；
C：根据标准曲线计算得到的维生素的浓度，单位为μg/mL；
V：待测样品的最终定容体积，单位为mL；
m：待测样品质量，单位为g；
100：换算为100克样品中含量的换算系数；
1000：将浓度单位μg/mL换算为mg/mL的换算系数。
对照品溶液的色谱图见图1-2，供试品溶液的色谱图见图3-4。
测得维生素B1含量为1.091mg/片，标示量的109.1％(标示量为1.0mg/片)；
维生素B2含量为1.067mg/片，标示量的106.7％(标示量为1.0mg/片)；
维生素B6含量为0.967mg/片，标示量的107.4％(标示量为0.9mg/片)；
烟酰胺含量为5.787mg/片，标示量的105.2％(标示量为5.5mg/片)；
泛酸钙含量为3.381mg/片，标示量的105.7％(标示量为3.2mg/片)；
测定维生素含量均合格。
实施例2
供试品溶液的制备：精确称取0.25g多种维生素矿物质片(孕妇乳母型)于锥形瓶中，精密量取加入10mL酸化乙醇(5‰的盐酸乙醇)，超声15min充分提取后，放漏斗滤纸过滤，滤液滤尽后，精密量取1.00mL滤液于10mL离心管中，氮吹至全干后，加入流动相磷酸溶液4.00mL定容至刻度。充分摇匀，将该溶液过0.45μm微孔滤膜后注入进样瓶，排列在进样板上，等待仪器分析。
高效液相色谱条件：
色谱柱：5μm反相C18色谱柱(250mm×4.6mm)或具有相同效果的色谱柱，如：反相C8色谱柱(250mm×4.6mm)；
流动相：磷酸溶液(pH＝2.0)和乙腈，梯度洗脱，洗脱条件同实施例1；
检测波长：泛酸钙波长210nm，维生素B1、维生素B2、维生素B6和烟酰胺/烟酸波长270nm；
流速：0.8mL/min；
柱温：20℃；
进样量：20μL；
检测器：紫外检测器。
计算公式同实施例1。
测得维生素B1含量为1.045mg/片，标示量的104.5％(标示量为1.0mg/片)；
维生素B2含量为1.012mg/片，标示量的101.2％(标示量为1.0mg/片)；
维生素B6含量为0.987mg/片，标示量的109.7％(标示量为0.9mg/片)；
烟酰胺含量为5.776mg/片，标示量的105.0％(标示量为5.5mg/片)；
泛酸钙含量为3.421mg/片，标示量的106.9％(标示量为3.2mg/片)；
测定维生素含量均合格。
实施例3
供试品溶液的制备：精确称取0.25g多种维生素矿物质片(孕妇乳母型)于锥形瓶中，精密量取加入30mL酸化乙醇(1％的冰乙酸乙醇)，超声20min充分提取后，放漏斗滤纸过滤，滤液滤尽后，精密量取1.00mL滤液于10mL离心管中，氮吹至全干后，加入流动相磷酸溶液8mL定容至刻度。充分摇匀，将该溶液过0.45μm微孔滤膜后注入进样瓶，排列在进样板上，等待仪器分析。
高效液相色谱条件：
色谱柱：5μm反相C18色谱柱(250mm×4.6mm)或具有相同效果的色谱柱，如：反相C8色谱柱(250mm×4.6mm)；
流动相：磷酸溶液(pH＝2.0)和乙腈，梯度洗脱，洗脱条件同实施例1；
检测波长：泛酸钙波长210nm，维生素B1、维生素B2、维生素B6和烟酰胺/烟酸波长270nm；
流速：1.5mL/min；
柱温：30℃；
进样量：20μL；
检测器：紫外检测器。
计算公式同实施例1。
测得维生素B1含量为1.037mg/片，标示量的103.7％(标示量为1.0mg/片)；
维生素B2含量为1.002mg/片，标示量的100.2％(标示量为1.0mg/片)；
维生素B6含量为0.959mg/片，标示量的106.6％(标示量为0.9mg/片)；
烟酰胺含量为5.785mg/片，标示量的105.2％(标示量为5.5mg/片)；
泛酸钙含量为3.431mg/片，标示量的107.2％(标示量为3.2mg/片)；
测定维生素含量均合格。
实施例4
将实施例1中的酸化乙醇中的盐酸比例调整为1％，其余步骤同实施例1。
检测多种维生素矿物质片(孕妇乳母型)产品中5种水溶性维生素的含量，结果分别为：
测得维生素B1含量为1.075mg/片，标示量的107.5％(标示量为1.0mg/片)；
维生素B2含量为1.042mg/片，标示量的104.2％(标示量为1.0mg/片)；
维生素B6含量为1.046mg/片，标示量的116.2％(标示量为0.9mg/片)；
烟酰胺含量为5.643mg/片，标示量的102.6％(标示量为5.5mg/片)；
泛酸钙含量为3.542mg/片，标示量的110.7％(标示量为3.2mg/片)；
测定维生素含量均合格。
实施例5
将实施例1中的酸化乙醇中的盐酸调整为冰乙酸，添加比例为5‰，其余步骤同实施例1，冰乙酸酸化乙醇的配制方法：准确吸取0.5mL冰乙酸于100mL容量瓶中，用无水乙醇定容至刻度，混匀备用。
检测多种维生素矿物质片(孕妇乳母型)产品中5种水溶性维生素的含量，结果分别为：
测得维生素B1含量为1.058mg/片，标示量的105.8％(标示量为1.0mg/片)；
维生素B2含量为1.036mg/片，标示量的103.6％(标示量为1.0mg/片)；
维生素B6含量为0.987mg/片，标示量的109.7％(标示量为0.9mg/片)；
烟酰胺含量为5.879mg/片，标示量的106.9％(标示量为5.5mg/片)；
泛酸钙含量为3.413mg/片，标示量的106.7％(标示量为3.2mg/片)；
测定维生素含量均合格。
实施例6
与实施例1不同的是，用多种维生素矿物质片(成人型)做供试品，该产品中同时有人体所必需的12种维生素和7种矿物质元素，其余步骤同实施例1，其检测图谱见图5和图6。
实施例7
与实施例1不同的是，以市售多种维生素矿物质片(乳母型)做供试品，该产品含10种维生素(含有五种目标维生素)和4种矿物质，取十片供试品研磨后，精密称取1.0g样品，采用实施例1的检测方法进行检测，图谱见图7和图8。
检测出供试品中维生素B1含量为0.612mg/片，为标示量的97.92％；
维生素B2含量为0.64mg/片，为标示量的96.97％；
维生素B6含量为0.72mg/片，为标示量的101.12％；
烟酰胺含量为6.52mg/片，为标示量的98.78％；
泛酸钙含量为3.14mg/片，为标示量的101.29％；
测定维生素含量均合格。
方法学试验
(1)系统适用性试验
五种维生素储备液：分别精密称取维生素B1、维生素B2、维生素B6、烟酰胺标准品和泛酸钙标准品10mg于5个10mL容量瓶中，用流动相磷酸溶液分别稀释得到浓度分别为1.0mg/mL、1.0mg/mL、1.0mg/mL、1.0mg/mL和1.0mg/mL的贮备溶液，此总称为贮备溶液①；
五种维生素混合中间液：准确吸取维生素B1标准储备液1.00mL、维生素B2标准储备液1.00mL、维生素B6标准储备液1.00mL、烟酰胺标准储备液4.0mL和泛酸钙标准储备液4.0mL于20mL容量瓶中，用流动相定容至刻度，混匀。此为贮备溶液②；此时贮备溶液②中维生素B1浓度为50.0μg/mL、维生素B2浓度为50.0μg/mL、维生素B6浓度为50.0μg/mL、烟酰胺浓度为200.0μg/mL和泛酸钙浓度为200.0μg/mL。
五种维生素对照品溶液：准确吸取贮备溶液②3.00mL于50mL容量瓶中，用流动相定容至刻度，混匀，此为贮备溶液③；按照实施例1的色谱方法，储备液③连续进样5次，每次20μL，计算出维生素B1的峰面积RSD％为0.55％，维生素B2的峰面积RSD％为0.44％，维生素B6的峰面积RSD％为0.40％，烟酰胺的峰面积RSD％为0.52％，泛酸钙的峰面积RSD％为0.53％，RSD％均小于2％表明仪器的精密度良好，结果见表2。
表2系统适用性试验结果
名称 峰面积1 峰面积2 峰面积3 峰面积4 峰面积5 平均值 RSD％
维生素B1 231637 229480 232551 231951 230286 231181 0.55
维生素B2 267619 270297 270286 270455 269996 269731 0.44
维生素B6 98752 98747 98441 97787 98504 98446 0.40
烟酰胺 629983 621855 629173 627945 626110 627013 0.52
泛酸钙 74336 74595 74509 73683 74654 74355 0.53
(2)线性回归试验
五种维生素标准系列工作液：分别精密量取五种维生素贮备溶液②1.50mL、2.00mL、3.00mL、4.00mL和5.00mL，置50mL容量瓶中，用磷酸溶液定容至刻度，配制成系列溶液浓度：维生素B1、B2、B6同为1.5μg/mL、2.0μg/mL、3.0μg/mL、4.0μg/mL和5.0μg/mL；烟酰胺为6.0μg/mL、8.0μg/mL、12.0μg/mL、16.0μg/mL和20.0μg/mL；泛酸钙为6.0μg/mL、8.0μg/mL、12.0μg/mL、16.0μg/mL和20.0μg/mL，五种维生素的标准曲线图见图9-13。
按照实施例1方法将五种维生素对照品标准系列工作液进样，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标作图，分别得到各维生素的线性回归方程如下：
维生素B1的线性方程为Y＝6.66e+004X+2.49e+003，R2＝0.9998；表明维生素B1在1.5～5.0μg/mL范围内具有良好的线性关系；
维生素B2的线性方程为Y＝8.33e+004X+8.57e+003，R2＝0.9998，表明维生素B2在1.5～5.0μg/mL范围内具有良好的线性关系；
维生素B6的线性方程为Y＝3.23e+004X-6.86e+002，R2＝0.9999，表明维生素B6在1.5～5.0μg/mL范围内具有良好的线性关系；
烟酰胺的线性方程为Y＝5.31e+004X+5.76e+002，R2＝0.9999，表明烟酰胺在6.0～20.0μg/mL范围内具有良好的线性关系；
泛酸钙的线性方程为Y＝4.30e+004X+4.87e+003，R2＝0.9992，表明泛酸钙在6.0～20.0μg/mL范围内具有良好的线性关系。
(3)重复性试验
试验样品：多种维生素矿物质片(孕妇乳母型)。
取以上样品10片研磨后，准确称取6份样品，按照实施例1方法进行五种维生素的含量测定，结果维生素B1的含量为1.080mg/片，RSD％为1.02％；维生素B2的含量为1.060mg/片，RSD％为0.82％；维生素B6的含量为0.968mg/片，RSD％为0.48％；烟酰胺的含量为5.788mg/片，RSD％为1.99％；泛酸钙的含量为3.402mg/片，RSD％为2.25％，RSD％均小于3％，均符合中国药典要求，表明该检测方法重复性良好，结果见表3。
表3重复性试验结果
(4)回收率实验
精密称取维生素B1、维生素B2、维生素B6、烟酰胺和泛酸钙标准品于容量瓶中，用1‰盐酸乙醇溶解并定容至刻度，配制成的溶液维生素B1浓度为6.37μg/mL、维生素B2浓度为5.58μg/mL、维生素B6浓度为6.19μg/mL、烟酰胺浓度为30.44μg/mL、泛酸钙浓度为17.89μg/mL的贮备液。精密称定6份样品，每份0.125g于锥形瓶中，用20mL贮备液溶解，按实施例1方法，进行维生素含量测定，结果见表4，(加入对照品量与供试品含量1:1)。
维生素B1回收率在98.16％～101.49％之间，RSD％为1.41％；
维生素B2回收率在98.09％～101.04％之间，RSD％为1.07％；
维生素B6回收率在98.23％～101.97％之间，RSD％为1.54％；
烟酰胺回收率在98.16％～103.96％之间，RSD％为2.08％；
泛酸钙回收率在96.90％～103.55％之间，RSD％为2.33％，均符合中国药典标准。
表4回收率试验结果
(5)稳定性实验
按照实施例1方法配制供试品溶液。在0、1、2、4、8、12、18、24h时间点按实施例1方法测定供试品溶液(0h样品在制备完成后立即进行测定)，结果见表5。
从表中可以看出，五种维生素的峰面积的RSD％均小于3％，表明供试品溶液在24h内是稳定的。
表5稳定性试验结果
实施例8
本实施例与实施例1的不同在于流动相的梯度洗脱程序不同，为梯度洗脱的次选方案，具体洗脱程序如下表6，其余与实施例1保持不变，其分析图谱见图14。
表6洗脱程序
时间(min) 流动相(A) 流动相(B)
0 100 0
20 100 0
22 90 10
40 90 10
42 100 0
50 100 0
应用该方法检测时，维生素B2和泛酸出峰时间过长，耗时，溶剂消耗多，从环保、节约时间的角度不太有利，作为本发明最佳梯度洗脱程序的次选方案。
对比例1
本对比例与实施例1的不同在于酸化乙醇采用1‰磷酸乙醇替换，其余与实施例1保持不变，其分析图谱见图15-16。
针对泛酸含量为实施例1的同一样品，采用本对比例的处理方法，会导致泛酸含量降低，峰面积过低，无法准确定量。
对比例2
本对比例与实施例1的不同在于酸化乙醇采用乙醇替换，其余与实施例1保持不变，其分析图谱见图17-18。
应用对比例2方法检测VB6重复性RSD％为8.3％；本发明实施例1测定VB6重复性RSD％为0.48％，对比例2检测VB6重复性差。
对比例3
本对比例与实施例1的不同在于流动相的梯度洗脱程序不同，具体洗脱程序如下表7，其余与实施例1保持不变，其分析图谱见图19。
表7洗脱程序
时间(min) 流动相(A) 流动相(B)
0 90 10
30 90 10
应用对比例3方法检测时，B1出峰时间太早，与溶剂峰堆积在一起，无法准确定量，烟酰胺和B6同时出峰，因此该流动相条件不适用。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种同时测定多种水溶性维生素的方法，其特征在于，所述方法中供试品溶液的制备包括将待测样品加入酸化乙醇溶液中，超声，过滤，加溶剂溶解即得；
所述酸化乙醇为盐酸乙醇或冰乙酸乙醇，所述盐酸乙醇中盐酸的体积浓度为1‰-1％，所述冰乙酸乙醇中乙酸的体积浓度为5‰-1％，所述水溶性维生素为维生素B1、维生素B2、维生素B6、烟酰胺、泛酸或泛酸盐，所述样品与酸化乙醇溶液的质量体积比为0.25g:10-30mL，所述溶剂与待测样品的体积质量比为2-10mL:1g，所述溶剂为磷酸水溶液，
所述方法采用高效液相色谱进行检测分析，其中液相色谱条件中流动相A为磷酸水溶液，流动相B为乙腈，梯度洗脱程序为：
0min，A:B(96-100:0-4，V/V)；
12min，A:B(96-100:0-4，V/V)；
14min，A:B(83-88:12-17，V/V)；
20min，A:B(83-88:12-17，V/V)；
22min，A:B(96-100:0-4，V/V)；
35min，A:B(96-100:0-4，V/V)。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述超声的时间为15-25min，所述过滤还包括过滤后取滤液0.5-2mL进行氮吹至全干。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括对照品溶液的制备，包括将对照品用磷酸水溶液溶解即得，所述对照品包括维生素B1、维生素B2、维生素B6、烟酰胺、泛酸或泛酸盐中的至少一种。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述流动相A的pH＝2.0。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述液相色谱条件中流速为0.8-1.5mL/min，柱温为20-30℃。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述水溶性维生素包括维生素B1、维生素B2、维生素B6、烟酰胺、泛酸或泛酸盐中的至少一种；所述维生素B1、维生素B2、维生素B6和烟酰胺的检测波长为260-280nm，所述泛酸或泛酸盐的检测波长为200-220nm。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述液相色谱条件中色谱柱选自反相C18色谱柱或反相C8色谱柱。
8.一种权利要求1-7任意一项所述的方法在检测分析包含有维生素B1、维生素B2、维生素B6、烟酰胺、泛酸或泛酸盐中至少一种的产品中的应用。
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