CN113933406A - 一种白酒样品中甲醛含量的检测方法 - Google Patents

Abstract

本申请公开了一种白酒样品甲醛含量的检测方法，包括用乙酰丙酮衍生剂对酒样进行衍生、过滤，液相色谱‑质谱检测白酒样品中甲醛的含量。本申请的检测方法能够有效检测白酒样品中甲醛含量，该方法快速简单，准确度高，标准曲线线性相关系数大于0.999，线性良好，相较于现有方法准确度高，检出限低，检测效率高，可以有效避免白酒样品中其他醛类以及样品颜色干扰，适用于开展白酒样品中甲醛含量的全面有效分析。

Description

一种白酒样品中甲醛含量的检测方法

技术领域

本发明涉及一种化学检测领域，特别涉及一种白酒样品中甲醛含量的检测方法。

背景技术

白酒是人类餐桌上重要的饮品，其以粮谷为原料，经蒸煮、发酵、蒸馏、储存、勾兑而成。水和乙醇是白酒含量最多的成分，约占总量的98％，剩下2％的微量成分则是构成白酒典型风味特征的基础，形成了风格特点迥异的各类白酒。其中，醛类物质就是白酒中的一类微量成分，它的生成伴随着白酒酿造的全过程，包括生产原料、发酵过程中的美拉德反应、储存过程中的氧化还原反应等。醛类及其前体物质天然存在于植物中，只要微生物发酵，发生新陈代谢就会生成醛类物质，因此它广泛存在于果汁、酒类和各类天然植物甚至动物食品中。

白酒中含多种醛类物质，其呈香强烈，如：丁醛、己醛、庚醛能产生花香、水果香；乙醛、糠醛则略带刺激性和焦糊味。此外，白酒中的某些醛类具有一定生物活性，如：香草醛能够消除自由基、抗氧化；然而某些醛类也会危害人体健康，其中毒性最强的醛类物质就是甲醛。甲醛是一种无色、有刺激性气味的物质，可刺激神经系统、消化道和眼睛，能与蛋白质结合，诱发疾病，是一种潜在致癌物。欧洲食品安全管理局建议经口摄入甲醛的含量每天不超过11.0mg/kg。在我国，食品中禁止使用甲醛作为添加剂，并且《食品安全国家标准发酵酒及其配制酒》(GB 2758—2012)也规定了甲醛在啤酒的最大残留限量为2.0mg/L。

不可避免地，甲醛存在于各类白酒产品中，但由于沸点低、易挥发的性质使得其在白酒中的研究较少。目前，针对白酒样品中甲醛检测方法的研究主要包括分光光度法和色谱法。分光光度法是食品中甲醛检测的常用方法，由于甲醛缺乏发光基团，常用带有发光基团的试剂与甲醛反应，通过检测特定衍生物的方式来检测甲醛含量，常见的反应试剂有：乙酰丙酮、酚试剂、4-氨基-3-联氨-5-巯基-1，2，4-三氮杂茂、盐酸苯肼等。分光光度法对仪器设备要求低，能够满足一般检测要求，但该法只适合无颜色干扰的样品，且存在检出限高、易出现假阳性、准确性较差等问题，有的衍生试剂具有毒性，不适合推广。甲醛检测的色谱法包括液相色谱和气相色谱，色谱法一般用2,4-二硝基苯肼进行柱前衍生，该法对样品要求低，线性良好具有较高的检测准确性，但对于白酒样品，其大量的乙醇会使目标物产生基质增强效应、对峰型产生影响，降低方法稳定性，并且白酒中的其他醛类物质如糠醛、乙缩醛、异戊醛等都会影响色谱法检测的准确性。

由于白酒样品中乙醇含量高、醛类物质种类繁多、有的白酒还呈现微黄色等导致现有方法在检测白酒样品甲醛含量时会出现假阳性、方法稳定性差、检测时间长等问题，因此，亟需发明一种高效、快速、且能准确检测白酒样品甲醛含量的测定方法。

发明内容

为了克服现有技术中白酒样品甲醛含量检测效率低、检测方法稳定性差，易受白酒基质影响的缺点，本发明提供一种高效、准确的白酒样品甲醛含量检测方法。

一方面，本申请提供了一种白酒样品甲醛含量的检测方法，包括以下步骤：

S1、白酒样品衍生化：向白酒样品中加入乙酰丙酮衍生剂，水浴衍生，过滤，取滤液；

S2、液相色谱-质谱检测：取步骤S1制备的滤液上机检测。

在一些实施方案中，所述步骤S1中，所述乙酰丙酮衍生剂的浓度为2-4mmol/L；在一些实施方案中，所述乙酰丙酮衍生剂的pH为5.5-6.8；在一些实施方案中，所述乙酰丙酮衍生剂为用铵盐、酸、乙酰丙酮配置的溶液；在一些实施方案中，所述铵盐选自氯化铵、乙酸铵中的至少一种；在一些实施方案中，所述乙酰丙酮衍生剂的制备方法包括以下步骤：按(12.5-15)g乙酸铵：(0.5-1.5)ml乙酸：(0.2-0.4)g乙酰丙酮的比例混合，用水定容，1-6℃避光保存。

在一些实施方案中，所述步骤S1中，所述乙酰丙酮衍生剂的加入量和酒样体积比为1-3：5；在一些实施方案中，所述体积比为1：5。

在一些实施方案中，所述步骤S1中，水浴衍生的条件为50-60℃水浴；在一些实施方案中，所述水浴时间为30-60min。

在一些实施方案中，所述步骤S1中，过滤为用滤膜过滤；在一些实施方案中，用0.22-0.45μm的滤膜过滤。

在一些实施方案中，所述步骤S2中，所述液相色谱-质谱检测中，液相色谱以乙腈-水体系作为色谱流动相。

在一些实施方案中，流动相的洗脱程序如表1所示：

表1洗脱程序

在一些实施方案中，所述步骤S2中，所述液相色谱-质谱检测中，柱温为30-35℃，流速为0.2-0.4mL/min，进样体积为5-10μL。

在一些实施方案中，色谱柱为Hypersil GOLD色谱柱(100mm×2.1mm，1.9μm)；

在一些实施方案中，所述色谱条件为：柱温：35℃；进样体积：5μL；流动相：水相(A)为超纯水，有机相(B)为乙腈；流速：0.4mL/min。

在一些实施方案中，所述液相色谱-质谱检测中，所述质谱扫描模式为负离子模式。

在一些实施方案中，所述质谱条件为：离子化模式：电喷雾电离负离子模式；喷雾电压2.5kV；鞘气：50psi；辅助气：15arb；离子源加热温度：350℃；离子传输管温度：320℃；扫描模式：Full Mass；扫描范围：50m/z～200m/z。

在一些实施方案中，所述液相色谱-质谱检测选自高效液相色谱-四极杆静电场轨道阱质谱、超高效液相色谱-三重四级杆串联质谱、超高效液相色谱-三重四极杆飞行时间质谱中的至少一种；在一些实施方案中，所述高效液相色谱-四极杆静电场轨道阱质谱选自UPLC-Q/Orbitrap HRMS。

在一些实施方案中，所述方法还包括甲醛标准曲线的制备步骤；在一些实施方案中，所述标准曲线检测样品中甲醛含量为利用Xcalibur定量数据处理。

在一些实施方案中，本申请具有包括以下的有益效果：

(1)准确性好，本申请利用超高效液相色谱-高分辨质谱建立了适用于白酒样品甲醛含量检测的方法，通过甲醛衍生物定量离子峰面积来检测白酒样品中甲醛含量，可排除白酒样品中其他醛类物质的干扰。

(2)检测效率高，前处理简单，检测时间短，相较于液相色谱法甲醛衍生物出峰时间的10min，本发明仅需3.4min，检测时间缩短一半。

(3)适用性强，可适合任何白酒样品，不受产品颜色及色素干扰，且仅需1mL白酒样品便可完成检测。

(4)检出限低，线性良好，经实验验证，本方法检出限为5μg/L，定量限为15μg/L，在20μg/L-200μg/L范围内，线性相关系数大于0.999。

附图说明

图1为甲醛衍生物的提取离子流图；

图2为甲醛衍生物标准曲线校准图；

图3为实施例2中衍生产物峰面积随衍生时间及温度的变化(n＝3)；

图4为实施例3中不同扫描模式下目标物的提取离子流图(a：负离子；b：正离子)；

图5为实施例3中不同流动相体系目标物色谱图(a：乙腈-水；b：乙腈-0.1％甲酸水；c：乙腈-5mmol乙酸铵)；

图6为对比例1中白酒样品中甲醛衍生物色谱图；

图7为对比例2中白酒样品中醛类物质衍生物色谱图。

具体实施方式

以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案，具体实施例不代表对本发明保护范围的限制。其他人根据本发明理念所做出的一些非本质的修改和调整仍属于本发明的保护范围。

实施例1

1.乙酰丙酮衍生剂配制：称取12.5g乙酸铵，少量超纯水溶解后加入1.5mL乙酸和0.2g乙酰丙酮，超纯水定容至100mL，4℃冰箱中避光保存。

2.标准品配制：移取甲醛标准品(10.1mg/mL，中国计量科学研究院)用超纯水配制得到浓度为202.0μg/L、151.0μg/L、101.0μg/L、70.7μg/L、50.5μg/L、20.2μg/L的系列标准工作溶液。

3.样品前处理：吸取1.0mL白酒样品于10mL试管中，加入0.2mL步骤1制备的乙酰丙酮衍生剂，混匀，60℃水浴30min，冷却后0.22μm水系滤膜过滤。

4.上机检测：色谱条件：色谱柱Hypersil GOLD色谱柱(100mm×2.1mm，1.9μm)；柱温：35℃；进样体积：5μL；流动相：水相(A)为超纯水，有机相(B)为乙腈；流速：0.4mL/min；梯度洗脱条件见表2；质谱条件：离子化模式：电喷雾电离负离子模式；喷雾电压2.5kV；鞘气：50psi；辅助气：15arb；离子源加热温度：350℃；离子传输管温度：320℃；扫描模式：FullMass；扫描范围：50m/z～200m/z。根据标准曲线计算待测样品中甲醛含量。

表2梯度洗脱程序

5.标准曲线、检出限(LOD)、定量限(LOQ)、回收率和精密度的测定：以甲醛衍生物定量离子峰面积为纵坐标，甲醛标准物质量浓度为横坐标，绘制标准曲线得到线性范围和线性相关系数；由于实验环境、研究对象都含有痕量甲醛，本实验选择本底值较低的白酒样品为研究对象，按照实验操作分析的全部步骤，进行25次平行实验，计算测定结果的标准偏差，以3倍标准偏差为方法检出限，3倍检出限为定量限；重复性实验考察方法精密度；白酒样品加标实验考察方法回收率。以酒精度不同的酱香酒样53％vol–J01和浓香酒样42％vol-N01为研究对象，并配制50μg/L和100μg/L加标标准品，每个样品取5份，按照实验操作分析的全部步骤上机检测。

6.结果分析：利用超高效液相色谱-高分辨质谱能够有效检测白酒样品中甲醛含量，其保留时间、定量离子、碰撞能、线性范围、检出限及定量限见表3；回收率及精密度见表4。

表3甲醛的线性范围及相关系数

表4酒样甲醛衍生物的加标回收率及精密度

实施例2前处理条件的优化

1.衍生条件优化：以酱香酒样53％vol–J01为研究对象，按照实验操作分析的全部步骤操作，分别考察在50℃、60℃下衍生10、20、30、40、50、60min甲醛衍生物定量离子峰面积变化情况。

2.检测结果：以衍生时间为横坐标，目标物峰面积为纵坐标绘制曲线，分别考察白酒J01样品在50℃和60℃条件下目标物峰面积随衍生时间的变化，其变化结果如图3。

3.结果分析：由图3可知，在30min内，目标物峰面积随衍生时间的延长而增大，在30min以后达到最大峰值；在相同衍生时间内，衍生温度为60℃的目标物峰面积大于衍生温度为50℃，综合考虑，优化的最佳衍生条件为60℃下衍生30min。

实施例3方法优化

1.质谱条件优化：以101.0μg/L甲醛标准液为研究对象，按照实验操作分析的全部步骤操作，分别比较了其正、负离子扫描模式下质谱响应的差异。以目标物定量离子质荷比为横坐标，相对丰度对纵坐标绘制曲线，结果如图4所示，结果表明在不同扫描模式下，正离子响应较高，但是正离子模式下峰宽大，保留时间长，峰型不好，综合考虑选择负离子模式作为扫描模式。

2.色谱条件优化：以50.5μg/L甲醛标准液为研究对象，分别比较了乙腈-水体系、乙腈-0.1％甲酸水体系和乙腈-5mmol乙酸铵体系下目标物的色谱行为，其结果如图5所示，结果表明在不同体系对保留时间没有影响，但是在乙腈-水体系下，目标物的响应最高，基于综合考量，选择乙腈-水体系作为色谱流动相。

对比例1液相色谱法检测白酒中甲醛含量

1.试剂配制：

乙酰丙酮衍生剂：取0.2mL乙酰丙酮至100mL容量瓶，超纯水定容至刻度；0.5mol/L氯化铵：称取26.75g氯化铵至烧杯，加入1L超纯水，搅拌使其完全溶解；

pH6.8的缓冲溶液：分别称取烘干至恒重的磷酸二氢钠11.99g和磷酸氢二钠14.19g至两个烧杯中，加入500mL超纯水搅拌使其完全溶解，得到0.2mol/L磷酸二氢钠和0.2mol/L磷酸氢二钠的溶液各500ml；取195ml磷酸二氢钠，305ml磷酸氢二钠，混合均匀即可得500ml pH＝7浓度为0.2mol/L的磷酸盐标准缓冲液。

2.实验条件：高效液相色谱(HPLC)：安捷伦1260，配备DAD检测器；

色谱柱Agilent C18色谱柱(4.6mm×150mm，5μm)；柱温：30℃；流动相：乙腈(V)/水(V)＝20/80；流速：1.0mL/min；测定波长：412nm；进样量：10μL。

3.实验方法：分别移取2020.0μg/L、1010.0μg/L、505.0μg/L、202.0μg/L、101.0μg/L、50.5μg/L及待测样品各1mL置于10mL玻璃试管中，加入0.5mL乙酰丙酮，0.5mL氯化铵，然后用pH缓冲液调节pH至5.5，用水稀释至刻度，于50℃水浴恒温加热20min。冷却后，按色谱条件进行测定。

4.实验结果：以时间为横坐标，目标物检测信号为纵坐标绘制曲线，其结果如图6所示，液相法和本申请的超高效液相色谱-高分辨质谱检测(液质法)结果如表5所示。结果显示，相比液相色谱法目标物出峰时间为10.73min，本申请方法的目标物出峰时间为3.42min检测时间更短，前处理更简单，检测效率高；相比液相法，本申请方法检出限更低，检测结果更加可靠。

表5两种方法检测白酒中甲醛含量(单位：μg/L)

对比例2液相色谱法检测白酒中醛类物质含量

1.实验方法：按照对比例1操作分析的全部步骤操作，分别研究乙醛、糠醛、乙缩醛、异戊醛、丙醛、异丁醛等醛类化合物在液相色谱法中对甲醛含量检测的影响情况。

2.检测结果：以时间为横坐标，目标物检测信号为纵坐标绘制曲线，其结果如图7所示，结果表明白酒样品中的其他醛类物质，如糠醛、乙缩醛、异戊醛、丙醛等均可能影响液相法检测白酒中甲醛结果的准确性，而本申请方法可以有效排除此类影响，提高定量准确度，是一种特别适用于白酒样品中甲醛含量检测的方法。

Claims (10)

1.一种白酒样品甲醛含量的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、白酒样品衍生化：向白酒样品中加入乙酰丙酮衍生剂，水浴衍生，过滤，取滤液；

S2、液相色谱-质谱检测：取步骤S1制备的滤液上机检测。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S1中，所述乙酰丙酮衍生剂中乙酰丙酮的浓度为2-4mmol/L；

优选地，所述乙酰丙酮衍生剂的pH为5.5-6.8；

优选地，所述乙酰丙酮衍生剂为用铵盐、酸、乙酰丙酮配置的溶液；

优选地，所述铵盐选自氯化铵、乙酸铵中的至少一种；

优选地，所述乙酰丙酮衍生剂的制备方法包括以下步骤：按(12.5-15)g乙酸铵：(0.5-1.5)mL乙酸：(0.2-0.4)g乙酰丙酮的比例混合，用水定容，1-6℃避光保存。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S1中，所述乙酰丙酮衍生剂的加入量和酒样体积比为1-3：5；

优选地，所述体积比为1：5。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S1中，水浴衍生的条件为50-60℃水浴；

优选地，所述水浴时间为30-60min。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S1中，过滤为用滤膜过滤；

优选地，用0.22-0.45μm的滤膜过滤。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S2中，所述液相色谱-质谱检测中，液相色谱以乙腈-水体系作为色谱流动相；

优选地，流动相的洗脱程序为：

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S2中，所述超液相色谱-质谱检测中，柱温为30-35℃，流速为0.2-0.4mL/min，进样体积为5-10μL；

优选地，色谱柱为Hypersil GOLD色谱柱(100mm×2.1mm，1.9μm)；

优选地，所述色谱条件为：柱温：35℃；进样体积：5μL；流动相：水相(A)为超纯水，有机相(B)为乙腈；流速：0.4mL/min。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述液相色谱-质谱检测中，所述质谱扫描模式为负离子模式；

优选地，所述质谱条件为：离子化模式：电喷雾电离负离子模式；喷雾电压2.5kV；鞘气：50psi；辅助气：15arb；离子源加热温度：350℃；离子传输管温度：320℃；扫描模式：FullMass；扫描范围：50m/z～200m/z。

9.如权利要求1-8任一所述的方法，其特征在于，所述液相色谱-质谱检测选自高效液相色谱-四极杆静电场轨道阱质谱、超高效液相色谱-三重四级杆串联质谱、超高效液相色谱-三重四极杆飞行时间质谱中的至少一种；

优选地，所述高效液相色谱-四极杆静电场轨道阱质谱选自UPLC-Q/Orbitrap HRMS。

10.如权利要求1-8任一所述的方法，其特征在于，所述方法还包括甲醛标准曲线的制备步骤；

优选地，所述标准曲线检测样品中甲醛含量为利用Xcalibur定量数据处理。

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