CN113702523B - 奥泽沙星中n-亚硝基二甲胺含量的测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种奥泽沙星中N‑亚硝基二甲胺含量的测定方法，其中包括：将奥泽沙星样品溶解于强碱溶液与甲醇的混合溶剂中，加入二氯甲烷和无机盐，充分振荡，静置分层，取下层二氯甲烷相作为供试品溶液，采用气相‑质谱法检测样品中N‑亚硝基二甲胺的含量。该方法检测准确度和灵敏度高、操作简单方便，方法回收率良好，为奥泽沙星产品的质量控制提供了依据。

Description

奥泽沙星中N-亚硝基二甲胺含量的测定方法

技术领域

本发明属于药物检测分析技术领域，具体涉及一种奥泽沙星中N-亚硝基二甲胺含量的测定方法。

背景技术

奥泽沙星(Ozenoxacin)是Ferrer公司研发的非氟化喹诺酮抗菌素，用于治疗脓疱性皮炎和其他皮肤感染，包括革兰氏阳性的皮肤和软组织感染。奥泽沙星的作用机制为抑制细菌DNA复制酶，DNA促旋酶A和拓扑异构酶IV。奥泽沙星于2015年9年获日本厚生劳动省批准，成为全球首次批准的新分子实体，于2017年12月11日获得美国FDA批准上市。奥泽沙星的化学名为1-环丙基-8-甲基-7-[5-甲基-6-(甲基氨基)吡啶-3-基]-4-氧代-1,4-二氢喹啉-3-羧酸，其结构式如下所示：

由于奥泽沙星的合成工艺中使用到N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，因此存在N-亚硝基二甲胺(NDMA)的风险。N-亚硝基二甲胺属于潜在遗传毒性杂质，其含量超标将严重威胁糖尿病患者的健康。美国FDA将NDMA已被分类为2A类致癌物质。根据ICH相关规定，人对N-亚硝基二甲胺的最大摄入量为96ng/d，奥泽沙星的最大日使用量为200mg，96ng/200mg＝0.48ppm，即奥泽沙星中N-亚硝基二甲胺的限度为0.48μg/g。因此，需要对奥泽沙星中残留的N-亚硝基二甲胺含量进行精确测定研究。

FDA、EP、中国药典和中国食品药品检定研究院均有发布关于NDMA的气相质谱分析方法。FDA的HS-GCMS测定亚硝胺，使用N-甲基吡咯烷酮(NMP)做样品溶剂，顶空分析线性范围在0.025μg～100μg，但奥泽沙星在N-甲基吡咯烷酮中溶解度低，达不到其检测所需要的浓度水平；中国药典的GCMS液体进样法测定亚硝胺，选择甲醇做样品溶剂，0.03μg/mL NDMA的信号噪音比(S/N)为62.1。FDA、中国食品药品检定研究院和EP相继发布了GC-MSMS直接进样法测定亚硝胺类物质(NDMA、NDEA、NDBA、NAIPA、NEIPA)，其中，盐酸二甲双胍中N-亚硝基二甲胺推荐检测方法2中，选择1N盐酸溶解样品，二氯甲烷萃取后直接进样，选择GC-MSMS，进样体积2μl，脉冲不分流进样，线性范围可以做到0.25ng/mL～50ng/mL。但是奥泽沙星1moL/L盐酸溶液中溶解度小于10mg/mL，该较低的溶解度无法满足N-亚硝基二甲胺检测的灵敏度。此外，奥泽沙星在7％磷酸溶液中略溶，在1moL/L氢氧化钠溶液中溶解度小于30mg/mL，在水中几乎不溶。

综上，目前公开的NDMA分析方法无法准确检测奥泽沙星中NDMA的含量，故寻找一种操作简单、准确度和灵敏度高、适合工业生产的N-亚硝基二甲胺含量的测定方法。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种操作简单，检测准确度和灵敏度高，适合工业生产的奥泽沙星中N-亚硝基二甲胺含量的测定方法。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

一种奥泽沙星中N-亚硝基二甲胺含量的测定方法，其中包括：将奥泽沙星样品溶解于强碱溶液与甲醇的混合溶剂中，加入无机盐和二氯甲烷，充分振荡，静置分层，取下层二氯甲烷相作为供试品溶液，采用气相-质谱法检测样品中N-亚硝基二甲胺的含量。

作为优选，奥泽沙星中N-亚硝基二甲胺含量的测定方法，包括如下步骤：

(a)供试品溶液制备：称取奥泽沙星样品溶解于强碱溶液与甲醇的混合溶剂中，加入无机盐和二氯甲烷，充分振荡，静置分层，取下层二氯甲烷相，作为供试品溶液；

(b)对照品溶液制备：取N-亚硝基二甲胺适量，溶解于二氯甲烷，定量制备成梯度浓度的溶液，作为对照品溶液；

(c)气相-质谱法检测：取供试品溶液和对照品溶液适量，分别注入气相-质谱仪，按标准曲线法计算N-亚硝基二甲胺的含量。

作为优选，所述的强碱溶液选自氢氧化钠或氢氧化钾的水溶液。

作为优选，所述的强碱溶液的浓度为0.1mol/L～5mol/L，更优选为0.5mol/L～2mol/L。

作为优选，所述的强碱溶液与甲醇的体积比为1：0.25～5，更优选为1：0.5～2。

作为优选，所述的奥泽沙星样品与混合溶剂的质量体积比为1：2～20，更优选为1：5～10g/mL。

作为优选，所述的混合溶剂与二氯甲烷的体积比为1：0.5～5，更优选为1：1～2。

作为优选，所述的强碱、甲醇、二氯甲烷各为分析纯或色谱纯。

作为优选，所述的无机盐选自氯化钠、氯化钾、无水硫酸钠中的任一种或多种，更优选为无水硫酸钠。

作为优选，所述的对照品溶液的浓度梯度分别为每1mL含3.84、7.68、19.2、30.72、38.4和46.08ng的N-亚硝基二甲胺。

本发明取得以下技术效果：

(1)选择强碱溶液与甲醇的混合溶剂制备供试品溶液，大大提高了样品的溶解性，解决了奥泽沙星在众多溶剂中溶解度低，无法满足检测灵敏度要求的难题。

(2)本申请人意外地发现，在本发明的萃取体系中，采用二氯甲烷可以对混合溶剂中的N-亚硝基二甲胺进行有效萃取，且不存在甲醇与二氯甲烷互溶的难题。

(3)萃取体系中加入无机盐，消除了萃取体系的乳化现象，去除了样品及强碱等对含量测定的干扰。

(4)优化的萃取比例显著地提高了回收率，满足N-亚硝基二甲胺的回收率在75％～120％之间的要求，故能准确定量检出奥泽沙星中可能残留的N-亚硝基二甲胺。

(5)采用气相-质谱法，即二氯甲烷溶液层直接进样，从而避免了强碱进入色谱系统损坏系统。本发明无需衍生化学反应，也无需顶空进样，方法操作简单，适合工业生产应用。

本发明提供的奥泽沙星中N-亚硝基二甲胺含量的测定方法，检测准确度和灵敏度高、专属性强，操作简单方便；精密度试验验证良好、线性关系良好、回收率在75％-120％之间，相对标准偏差小于10％，方法回收率良好。

附图说明

图1为实施例1中奥泽沙星样品N-亚硝基二甲胺检测质谱图。

图2为实施例1中N-亚硝基二甲胺对照品溶液质谱图。

图3为实施例4中空白溶剂质谱图。

图4为实施例4中N-亚硝基二甲胺线性图。

具体实施方式

1、仪器：

分析天平，型号：METTLER TOLEDO XS105；

气相-质谱仪型号为Agilent 7890B-5977A MSD；

色谱柱：100％聚乙二醇作固定相的石英毛细管柱(型号为Zebron ZB-WAX plus，该石英毛细管柱的柱长30m、内径0.25mm、液膜厚度0.25μm)。

2、试剂：

甲醇：色谱纯；

二氯甲烷：分析纯；

氢氧化钠：分析纯；

无水硫酸钠：分析纯；

N-亚硝基二甲胺(NDMA)：CATO。

3、样品：

奥泽沙星，为杭州华东医药集团新药研究院有限公司自制，批号：C057-52104001、C057-52104002、C057-52104003。

4、气相-质谱条件为：

柱温：程序升温；起始温度为40℃，维持0.5min，以每分钟20℃的速率升温至200℃，维持1min，再以每分钟60℃的速率升温至240℃，维持5分钟；

进样口温度：230～270℃；

载气：氦气；

载气流速：1～2mL/min；

进样：脉冲不分流进样，脉冲压力为12.285spi，保持时间0.5min；

注入气相-质谱仪的直接进样体积为1～3μl。

离子源：EI；

离子源温度：220～240℃；

四级杆温度：140～160℃；

监测离子m/z 74。

下面结合实施例对本发明作进一步阐述，但这些实施例不对本发明构成任何限制。

实施例1

A、供试品溶液：取本品约0.4g，精密称定，置具塞试管中，加入3mL1mol/L氢氧化钠溶液与甲醇的混合溶剂(氢氧化钠溶液与甲醇的体积比为1：

1)，振摇溶解，加入无水硫酸钠约0.2g，加入3mL二氯甲烷，充分振荡提取，静置分层，取下层二氯甲烷相，备用；

B、对照品溶液制备：取N-亚硝基二甲胺(NDMA)适量，加二氯甲烷定量稀释成每1mL分别约含3.84、7.68、19.2、30.72、38.4和46.08ng的溶液，作为对照品溶液(1)～(6)。

C、气相-质谱法检测：取供试品溶液和对照品溶液(1)～(6)各2μL，参照《中国药典》(2020年版)四部通则0521气相色谱法和通则0431质谱法测定，采用直接进样法分别注入气相-质谱仪，依次获得奥泽沙星样品质谱图，如图1所示。N-亚硝基二甲胺(NDMA)对照品溶液质谱图如图2所示。

D、含量计算：按标准曲线法以峰面积计算残留N-亚硝基二甲胺(NDMA)的含量。

按照上述测定方法对三批供试品进行检测，结果见表1。

表1：

实施例2

取本品约0.3g，精密称定，置10mL置具塞试管中，加入3mL 0.5mol/L氢氧化钠溶液与甲醇的混合溶剂(氢氧化钠溶液与甲醇的体积比为2：1)，振摇溶解，加入无水硫酸钠约0.2g，加入3mL二氯甲烷，充分振荡提取，静置分层，取下层二氯甲烷相，备用；

其他步骤参照实施例1

按照上述条件，检测三批供试品溶液，结果见表2。

表2：

实施例3

取本品约0.5g，精密称定，置10mL具塞试管中，加入2mL 3mol/L氢氧化和钠溶液与甲醇的混合溶剂(氢氧化钠溶液与甲醇的体积比为1：2)，振摇溶解，加入无水硫酸钠约0.2g，加入4mL二氯甲烷，充分振荡提取，静置分层，取下层二氯甲烷相，备用；

其他步骤参照实施例1

按照上述条件，检测三批供试品溶液，结果见表3。

表3：

实施例4：方法验证

1、专属性

1.1空白试验

取二氯甲烷置进样瓶中，按上述气相-质谱条件下量取2μL进样，空白溶液质谱图如图3所示，结果表明二氯甲烷对N-亚硝基二甲胺检测无干扰。

1.2系统适用性试验

取N-亚硝基二甲胺对照品溶液2μL，参照《中国药典》(2020年版)四部通则0521气相色谱法和通则0431质谱法测定，采用直接进样法分别注入气相-质谱仪进行检测。结果甲醇、二氯甲烷峰对N-亚硝基二甲胺检测均无干扰。

表7分离度情况

组分	保留时间(min)	分离度
			甲醇	<4.0	/
二氯甲烷	<4.0	/
			N-亚硝基二甲胺	4.896	6.5

2、精密度试验

2.1样品重复性

取本品约0.4g，精密称定，置10mL具塞试管中，加入3mL 1mol/L氢氧化钠溶液与甲醇的混合溶剂(氢氧化钠溶液与甲醇的体积比为1：1)，振摇溶解，加入无水硫酸钠约0.2g，加入3mL二氯甲烷，充分振荡提取，静置分层，按上述气相-质谱条件量取下层清液2μL进样，记录质谱图，连续测定6份，精密度良好。样品精密度结果见表5。

表5

2.2加样精密度

分别配制含N-亚硝基二甲胺的浓度为0.15μg/mL的二氯甲烷溶液为对照品溶液。精密称取奥泽沙星约0.4g于具塞试管中，加入3mL 1mol/L氢氧化钠溶液与甲醇的混合溶剂(氢氧化钠溶液与甲醇的体积比为1：1)，振摇溶解，加入无水硫酸钠约0.2g，加对照品溶液5mL，振摇充分混合，静置分层，按上述气相-质谱条件量取下层二氯甲烷层清液2μL进样，记录质谱图。连续测定6份，按标准曲线法计算N-亚硝基二甲胺含量。结果相对标准偏差(RSD)为6％，加样精密度良好。加样精密度结果见表6。

2.3中间精密度

在不同时间，不同人员，重复进行加样精密度试验。分别配制含N-亚硝基二甲胺的浓度为0.15μg/mL的二氯甲烷溶液为对照品溶液。精密称取奥泽沙星约0.4g于具塞试管中，加入3mL 1mol/L氢氧化钠溶液与甲醇的混合溶剂(氢氧化钠溶液与甲醇的体积比为1：1)，加入无水硫酸钠约0.2g，加对照品溶液5mL，振摇充分混合，静置分层，按上述气相-质谱条件量取下层二氯甲烷层清液2μL进样，记录质谱图。连续测定6份，按标准曲线法计算N-亚硝基二甲胺含量。计算共12份加样精密度试验总的相对标准差，结果RSD为11％，小于15％，中间精密度良好。中间精密度结果见表6。

表6

3、检出限与定量限

3.1检出限

根据上述1.1空白试验，测得三份空白响应值，参考中国药典2020年版四部9101《分析方法验证指导原则》基于响应值标准偏差和标准曲线斜率法，按照LOD＝3.3σ/S公式计算。式中LOD：检出限；σ：响应值的偏差；S：标准曲线的斜率；σ为响应值的标准偏差。三份空白响应值分别为125，124、144，平均值为131，因此σ为11.27，检出限度结果如表7所示。

表7

3.2定量限

参考中国药典2020年版四部9101《分析方法验证指导原则》基于响应值标准偏差和标准曲线斜率法，按照LOQ＝10σ/S公式计算。式中LOQ：定量限；σ：响应值的标准偏差；S：标准曲线的斜率。σ的计算方式同3.1检出限，定量限结果如表8所示。

表8

4、线性试验

精密称取N-亚硝基二甲胺(NDMA)对照品38.4mg，置于20mL容量瓶中，用二氯甲烷定容至刻度。精密量取0.1mL置于100mL容量瓶中，用二氯甲烷稀释定容至刻度，作为对照品母液。分别精密量取对照品母液各0.01、0.02、0.05、0.08、0.1和0.12mL置5mL容量瓶中，用二氯甲烷稀释定容至刻度，摇匀，制成含N-亚硝基二甲胺(NDMA)为3.84ng/mL、7.68ng/mL、19.2ng/mL、30.72ng/mL、38.4ng/mL、46.08ngng/mL的溶液，作为不同浓度标准溶液。按上述气相-质谱条件分别精密量取各标准溶液2μL进样，记录质谱图，以浓度为x轴，峰面积为y轴，作线性回归，结果见表9。线性图如图4所示。

表9

5、准确度

分别配制含N-亚硝基二甲胺的浓度为0.15μg/mL的二氯甲烷溶液以及其相应80％、100％和120％浓度溶液为对照品溶液。精密称取奥泽沙星约0.4g于具塞试管中，加入3mL 1mol/L NaOH：甲醇(体积比1:1)振摇溶解，加入无水硫酸钠约0.2g，加对照品溶液5mL，振摇充分混合，静置分层，按上述气相-质谱条件量取下层二氯甲烷层清液2μL进样，记录质谱图。另取未加入样品的对照品溶液，同法测定，记录质谱图，按标准曲线法计算回收率。N-亚硝基二甲胺平均回收率达102％，在80％～120％之间，RSD小于10％，方法回收率良好。见表10。

表10

结果：N-亚硝基二甲胺平均回收率达102％，在80％～120％之间，RSD小于10％，方法回收率良好。

以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (12)

1.奥泽沙星中N-亚硝基二甲胺含量的测定方法，其中包括供试品溶液制备：将奥泽沙星样品溶解于强碱溶液与甲醇的混合溶剂中，加入无机盐和二氯甲烷，充分振荡，静置分层，取下层二氯甲烷相作为供试品溶液，采用气相-质谱法检测样品中N-亚硝基二甲胺的含量；所述的强碱溶液选自氢氧化钠或氢氧化钾的水溶液；所述的无机盐选自氯化钠、氯化钾、无水硫酸钠中的任意一种或多种；色谱柱：100％聚乙二醇作固定相的石英毛细管柱；

气相-质谱条件为：

柱温：程序升温；起始温度为40℃，维持0.5min，以每分钟20℃的速率升温至200℃，维持1min，再以每分钟60℃的速率升温至240℃，维持5分钟；

离子源：EI；

离子源温度：220～240℃；

四级杆温度：140～160℃；

监测离子m/z 74。

2.如权利要求1所述的测定方法，其特征在于，包括如下步骤：

(a)供试品溶液制备：称取奥泽沙星样品溶解于强碱溶液与甲醇的混合溶剂中，加入无机盐和二氯甲烷，充分振荡，静置分层，取下层二氯甲烷相作为供试品溶液；

(b)对照品溶液制备：取N-亚硝基二甲胺适量，溶解于二氯甲烷，定量制备成梯度浓度的溶液，作为对照品溶液；

(c)气相-质谱法检测：取供试品溶液和对照品溶液适量，分别注入气相-质谱仪，按标准曲线法计算N-亚硝基二甲胺的含量。

3.如权利要求1或2所述的测定方法，其特征在于，所述的强碱溶液的浓度为0.1mol/L～5mol/L。

4.如权利要求3所述的测定方法，其特征在于，所述的强碱溶液的浓度为0.5mol/L～2mol/L。

5.如权利要求1或2所述的测定方法，其特征在于，所述的强碱溶液与甲醇的体积比为1：0.25～5。

6.如权利要求5所述的测定方法，其特征在于，所述的强碱溶液与甲醇的体积比为1：0.5～2。

7.如权利要求1或2所述的测定方法，其特征在于，所述的奥泽沙星样品与混合溶剂的质量体积比为1：2～20g/mL。

8.如权利要求7所述的测定方法，其特征在于，所述的奥泽沙星样品与混合溶剂的质量体积比为1：5～10g/mL。

9.如权利要求1或2所述的测定方法，其特征在于，所述的混合溶剂与二氯甲烷的体积比为1：0.5～5。

10.如权利要求9所述的测定方法，其特征在于，所述的混合溶剂与二氯甲烷的体积比为1：1～2。

11.如权利要求1或2所述的测定方法，其特征在于，所述的无机盐选自为无水硫酸钠。

12.如权利要求2所述的测定方法，其特征在于，所述的对照品溶液的浓度梯度分别为每1mL含3.84、7.68、19.2、30.72、38.4和46.08ng的N-亚硝基二甲胺。

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