CN113358768B - 一种hplc-ms/ms联用同时检测人血浆中左旋兰索拉唑和右旋兰索拉唑的方法 - Google Patents
一种hplc-ms/ms联用同时检测人血浆中左旋兰索拉唑和右旋兰索拉唑的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN113358768B CN113358768B CN202110498547.9A CN202110498547A CN113358768B CN 113358768 B CN113358768 B CN 113358768B CN 202110498547 A CN202110498547 A CN 202110498547A CN 113358768 B CN113358768 B CN 113358768B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- lansoprazole
- mobile phase
- sample
- levorotatory
- acetonitrile
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
- G01N30/06—Preparation
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/86—Signal analysis
- G01N30/8675—Evaluation, i.e. decoding of the signal into analytical information
- G01N30/8679—Target compound analysis, i.e. whereby a limited number of peaks is analysed
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
- G01N2030/042—Standards
- G01N2030/045—Standards internal
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
- G01N30/06—Preparation
- G01N2030/065—Preparation using different phases to separate parts of sample
Landscapes
- Physics & Mathematics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Library & Information Science (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
Abstract
Description
技术领域
本发明属于生物分析领域,具体涉及一种HPLC-MS/MS联用同时检测人血浆中左旋兰索拉唑和右旋兰索拉唑的方法。
背景技术
兰索拉唑为质子泵抑制剂。质子泵抑制剂为苯并咪唑类衍生物,特异性和非竞争性的作用于H+/K+-ATP酶,治疗消化性溃疡。质子泵抑制剂多为脂溶性弱碱性,吸收入血后进入壁细胞分泌小管、小管泡腔中酸性环境后,活化产物一般为活性次磺酸和次磺酰胺,与H+-K+-ATP酶巯基偶联形成一个不可逆的共价二硫键,阻断H+-K+转运机制,从而抑制胃酸分泌,主要用于胃溃疡、十二指肠溃疡、反流性食管炎、胃泌素瘤等消化性疾病的治疗,兰索拉唑不对称亚硫酰基中有一个手性中心,因此,有两个对映体:R-和S-兰索拉唑,R-兰索拉唑称为右旋兰索拉唑,与相同剂量的S-兰索拉唑相比较,右旋兰索拉唑表现出更高的体内药理学反应,因为,S-兰索拉唑体内清除比右旋兰索拉唑迅速。口服兰索拉唑后,右旋兰索拉唑是主要的循环对映体,约占血浆浓度-时间曲线下面积(AUC)的85%。因为,口服右旋兰索拉唑后,血浆中未检测到S-兰索拉唑,所以人体内不会出现右旋兰索拉唑消旋转化为S-兰索拉唑。国外的体内药效学试验结果也表明,兰索拉唑的药理作用主要来自于它的R-(+)-对映异构体,即右旋兰索拉唑。
中国专利CN 111337615A公开液质联用技术同时检测人血浆中奥美拉唑、雷贝拉唑、兰索拉唑和泮托拉唑对映体的浓度,在该专利中披露采用等度洗脱同时测定人血浆中左旋兰索拉唑和右旋兰索拉唑浓度,分析时间为10min,分析时间较长,对检测设备的要求高,不适用于大批量生物样本的检测要求;在配制工作液时,采用的溶剂为含0.1%氨水的乙腈,由于氨水有刺激性的气味也易挥发,在检测的过程中给实验操作人员带来了危害,也干扰测定结果的准确性。
鉴于上述的缺陷,需开发更简单、可靠的样品预处理方法以及血浆药物浓度检测的方法,用于人血浆中左旋兰索拉唑和右旋兰索拉唑的同时测定。
发明内容
本发明的目的是在现有技术的基础上,提供一种HPLC-MS/MS联用同时检测人血浆中左旋兰索拉唑和右旋兰索拉唑的方法,具有前处理所需血浆量少、操作简单、重现性好、灵敏度高、分析速度快、基质效应影响小,提取回收率高等优点。
本发明的技术方案如下:
一种HPLC-MS/MS联用同时检测人血浆中左旋兰索拉唑和右旋兰索拉唑的方法,它包括以下步骤:(1)人血浆样品前处理;(2)液相色谱-质谱联用检测,采用流动相A和流动相B为混合流动相进行梯度洗脱,其中,流动相A为乙腈-水;流动相B为包含0.01~0.1%乙酸的3~7mM乙酸铵水溶液-乙腈;(3)人血浆中左旋兰索拉唑和右旋兰索拉唑的测定;梯度洗脱过程如下:在0-0.5分钟内,流动相A和流动相B的体积比为55:45;在0.5-4.5分钟内,流动相A和流动相B的体积比由55:45匀速渐变至60:40;在4.5-4.6分钟内,流动相A和流动相B的体积比由60:40匀速渐变至90:10;在4.6-5.0分钟内,流动相A和流动相B的体积比为90:10;在5.0-5.1分钟内,流动相A和流动相B的体积比由90:10匀速渐变至55:45;在5.1-6.5分钟内,流动相A和流动相B的体积比为45:55;具体的梯度洗脱过程如表1:
表1左旋兰索拉唑和右旋兰索拉唑液相色谱梯度
本发明在测定人血浆中左旋兰索拉唑和右旋兰索拉唑时,采用梯度洗脱的方式进行分析,分析时间仅为6.5min,分析的时间短,大大缩短了分析时间;采用API 3000的质谱可以达到5.00ng/mL的定量下限,降低了对仪器的要求,使大批量生物样本分析更加方便、可行。
理想的内标物应当能以准确、已知的量加到样品中去,和被分析的样品有基本相同或尽可能一致的物理化学性质、色谱行为和响应特征。在采用内标法时,内标物的选择是一项十分重要的工作。本发明采用HPLC/MS-MS联用同时检测人血浆中左旋兰索拉唑和右旋兰索拉唑时,采用埃索美拉唑作为内标,内标与右旋兰索拉唑/左旋兰索拉唑有相似的化学结构,使得三者在溶解性及色谱保留行为较相似,在色谱分析条件下,内标物能与样品中各组分充分分离,重现性、准确度均较好。
在步骤(1)中,本发明对人血浆样品采用蛋白沉淀法进行前处理,采用乙腈作为沉淀剂。采用蛋白沉淀法进行前处理人血浆样品,可以简化样品前处理步骤,节省时间,且使用的试剂危害更小,可以避免血浆中基质杂峰对化合物峰形的影响,使检测方法选择性更高,定量下限更低,同时获得令人惊讶的高回收率。
本发明的检测方法还包括配制内标工作液:称取埃索美拉唑对照品,采用乙腈溶解并稀释得到浓度为0.5mg/ml埃索美拉唑的储备液,再用体积比为50:50的乙腈与水混合溶液稀释得到浓度为500ng/mL的内标工作液。
在一种优选方案中,在步骤(1)中,人血浆样品前处理包括:人血浆样品加入内标工作液和沉淀剂,震荡及离心后取上清液,经氮气流吹干后与复溶液混合,即得待测样品;其中,复溶液为乙腈和水的混合溶液,乙腈和水的体积比为40~60:60~40。
在一种更优选方案中,在步骤(1)中,人血浆样品前处理包括:取50μL人血浆样品,向其中加入25μL内标工作液和200μL乙腈,震荡及离心后取上清液,经氮气流吹干后加入200μL复溶液混合后,即得待测样品;其中,复溶液为乙腈和水的混合溶液,乙腈和水的体积比为50:50。
进一步地,本发明对人血浆样品采用蛋白沉淀法进行前处理,其中,震荡及离心的条件为:以2000rpm/min涡旋震荡10min后,在4℃的条件下以4000rpm/min速度离心5min。
本发明在色谱检测时,将待测样品置于自动进样器,进行LC-MS/MS分析,进样体积为5μL,进样器温度5℃。
采用本发明的前处理方法处理待测样品并进行液相色谱-质谱联用检测时,提取回收率接近于100%,左/右兰索拉唑的总体提取回收率分别为100.13%和98.26%。
本发明采用HPLC/MS-MS联用同时检测人血浆中左旋兰索拉唑和右旋兰索拉唑时,流动相A为乙腈-水,在一种优选方案中,在梯度洗脱过程中,流动相A中乙腈-水的体积比90~98:2~10,可以但不局限于90:10、91:9、92:8、93:7、94:6、95:5、96:4、97:3或98:2,为了取得更好的分离效果,流动相A中乙腈-水的体积比为95:5。
为了改善色谱分离选择性,本发明选择在乙酸铵水溶液中添加少量乙酸。例如,流动相B为包含0.01~0.1%乙酸的3~7mM乙酸铵水溶液-乙腈,其中,0.01~0.1%乙酸的3~7mM乙酸铵水溶液是指以浓度为3~7mM乙酸铵水溶液的总体积为100%为基准,含有体积比为0.01~0.1%乙酸。对于本发明而言,在流动相B中,乙酸铵水溶液中乙酸铵的浓度可以但不局限于3mM、3.5mM、4.0mM、4.5mM、5.0mM、5.5mM、6.0mM或7.0mM,优选地,乙酸铵水溶液中乙酸铵的浓度为5.0mM。在乙酸铵水溶液中乙酸的含量为0.01~0.1%,可以但不局限于0.01%、0.03%、0.05%、0.07%或0.1%,优选地,在乙酸铵水溶液中乙酸的含量为0.05%。在梯度洗脱过程中,流动相B中乙酸铵水溶液-乙腈的体积比为50~80:50~20,可以但不局限于50:50、55:45、60:40、65:35、70:30或80:20,为了取得更好的分离效果,流动相B中乙酸铵水溶液-乙腈的体积比为60:40。
在一种更优选方案中,流动相B为包含0.05%乙酸的5mM乙酸铵水溶液-乙腈,其中,乙酸铵水溶液-乙腈的体积比为60:40。
进一步的,柱温为20~30℃,优选为25℃。
进一步的,流速为0.5~1.0mL/min,优选为0.8mL/min。
在色谱法中,色谱柱的选择十分重要,对色谱柱的要求:柱效高、选择性好,分析速度快等。本发明采用乙腈-水溶液和0.01~0.1%乙酸的3~7mM乙酸铵水溶液-乙腈的混合溶液作为流动相,以IC作为色谱柱,在其他条件的配合下,内源性物质不干扰样品的测定,且血浆样品用量少、样品前处理简单、分析时间短、线性范围宽、重现性好、灵敏度高、基质效应影响小。
本发明的检测方法,步骤(2)采用液相色谱-质谱联用检测的步骤包括:
本发明详细的色谱条件为:色谱柱采用IC(4.6×150mm,5μm),按照上述提到的洗脱过程进行梯度洗脱,柱温为20~30℃,优选为25℃;流速为0.5~1.0mL/min,优选为0.8mL/min;进样量为1~20μL,例如5μL。
本发明的质谱条件包括:采用电喷雾离子源,正离子多反应监测扫描,喷雾电压3000V,离子源温度550℃;左旋兰索拉唑,[M+H]+,m/z 370.201→252.0,DP值30V,CE值16V;右旋兰索拉唑,[M+H]+,m/z 370.2→252.0,DP值30V,CE值16V;埃索美拉唑ISTD,[M+H]+,m/z346.2→198.2,DP值24V,CE值15V。
采用本发明的前处理方法处理人血浆样品,可以针对血浆中左旋兰索拉唑和右旋兰索拉唑的浓度进行测定,测定的浓度范围宽,其中,血浆中左旋兰索拉唑和右旋兰索拉唑的检测范围为5.00~5000ng/mL。
本发明的检测方法,步骤(3)人血浆中左旋兰索拉唑和右旋兰索拉唑的测定步骤包括:将待测血浆按步骤(1)样品前处理方法制备,按步骤(2)液相色谱-质谱联用检测,分别记录左旋兰索拉唑/右旋兰索拉唑浓度对应的峰面积,分别将左旋兰索拉唑/右旋兰索拉唑和内标的峰面积比值以权重系数w=1/x2进行线性回归,方程表达式,y=ax+b,计算得到所述待测血浆中左旋/右旋兰索拉唑的浓度。
本发明的检测方法能够用于临床药代动力学样本监测。临床药物代谢动力学参数的计算的步骤包括:用DAS3.2.8计算药动学参数。用非房室模型(Non-compartmentalanalysis,NCA)分析,计算各受试者的药代动力学参数,包括:Cmax、Tmax、t1/2、AUC0-t,同时计算各参数的均数和标准差。
采用本发明的技术方案,优势如下:
(2)本发明采用埃索美拉唑作为内标,内标物能与样品中各组分充分分离,样品配制简单,分析时间短,对检测设备要求低,重现性、准确度好。
(3)本方法使用样本量仅为50μL,所用样本量较少适用于大批量血浆样品检测。本发明的检测方法线性范围为5.00~5000ng/mL,该线性范围较宽,定量下限低,可以分析不同剂量给药后的血浆样品,应用范围较广且可以避免做多次方法学验证。
(4)本发明的方法进行了包括特异性、准确度、精密度、基质效应、提取回收率、稳定性的全部方法验证,能用于评价各种剂量的注射用右兰索拉唑在人体内的药代动力学评价及药物安全性评价。
附图说明
图1是右旋兰索拉唑和左旋兰索拉唑子离子扫描图;
图2是内标埃索美拉唑子离子扫描图;
图3是LC-MS/MS法分别测定血浆中右旋兰索拉唑和左旋兰索拉唑的特异性色谱图;其中:
图3-1-1、3-2-1、3-3-1、3-4-1、3-5-1和3-6-1为6批不同个体空白血浆色谱图;在每一张附图中,左边色谱图为右旋兰索拉唑,右边为埃索美拉唑;
图3-1-2、3-2-2、3-3-2、3-4-2、3-5-2和3-6-2为6批不同个体空白血浆色谱图;在每一张附图中,左边色谱图为左旋兰索拉唑,右边为埃索美拉唑;
图4是混合空白血浆色谱图;其中:
图4-1是右旋兰索拉唑混合空白血浆色谱图,左边色谱图为右旋兰索拉唑,右边为埃索美拉唑;
图4-2是左旋兰索拉唑混合空白血浆色谱图;左边色谱图为左旋兰索拉唑,右边为埃索美拉唑;
图5是定量下限样品色谱图;其中:
图5-1是右旋兰索拉唑定量下限样品色谱图,左边色谱图为右旋兰索拉唑,右边为埃索美拉唑;
图5-2是左旋兰索拉唑定量下限样品色谱图,左边色谱图为左旋兰索拉唑,右边为埃索美拉唑;
图6是健康受试者静脉输注右兰索拉唑后收集的血浆样品色谱图;其中:
图6-1是第24号受试者静脉输注右兰索拉唑后第二个点的血浆样品右旋兰索拉唑色谱图;
图6-2是第24号受试者静脉输注右兰索拉唑后第五个点的血浆样品左旋兰索拉唑色谱图。
具体实施方式
通过以下实施例对本发明的检测方法作进一步的说明,但这些实施例不对本发明构成任何限制。
材料与方法
1.仪器与试剂
高相液相色谱(Shimadzu LC-20AD系列);质谱(API 3000,Applied Biosystems/Sciex);纯水仪(MilliDirectQ,Millipore);微量天平(XP6,METTLER TOLEDO);离心机(HeraeusMuitifuge X1R,ThermoFisher);振荡器(LPD2500,LE PARD);氮吹仪(OrganomationMicrovap 11803;NG150-1A,莱普特科学仪器有限公司)。
乙腈(Merck,HPLC级别),水(超纯水,实验室自制),乙酸(Aladdin,HPLC级别),乙酸铵(Aladdin,HPLC级别)。空白血浆(抗凝剂:肝素钠)来源于健康受试者。左旋兰索拉唑(Molcan Corp,批号:150228)、右旋兰索拉唑(Molcan Corp,批号:180413),埃索美拉唑(Molcan Corp,批号:180603)。
2.液质条件
液相条件:色谱柱:IC手性柱,4.60mm×150mm,5.0μm;柱温:25℃;进样器温度:5℃;流动相A为乙腈-水(95:5,v/v);流动相B为0.05%乙酸-5mM乙酸铵溶液(以5mM乙酸铵水溶液的总体积为100%为基准,含有体积比为0.05%乙酸)-乙腈(60:40,v/v);梯度洗脱过程如下:在0-0.5分钟内,流动相A和流动相B的体积比为55:45;在0.5-4.5分钟内,流动相A和流动相B的体积比由55:45匀速渐变至60:40;在4.5-4.6分钟内,流动相A和流动相B的体积比由60:40匀速渐变至90:10;在4.6-5.0分钟内,流动相A和流动相B的体积比为90:10;在5.0-5.1分钟内,流动相A和流动相B的体积比由90:10匀速渐变至55:45;在5.1-6.5分钟内,流动相A和流动相B的体积比为45:55;具体如表1所示。流速为0.8mL/min;洗针模式:Before and after aspiration;弱洗:乙腈:水(50:50,v/v);清洗体积:500μL;强洗:乙腈,清洗体积:500μL。
质谱条件:离子检测方式:多反应监测(MRM);离子化方式:气动辅助电喷雾离子化(ESI);离子极性:正离子(Positive);检测对象:左旋兰索拉唑SLSP,[M+H]+,m/z 370.201→252.0,DP值30V,CE值16V;右旋兰索拉唑RLSP,[M+H]+,m/z 370.2→252.0,DP值30V,CE值16V;埃索美拉唑ISTD,[M+H]+,m/z 346.2→198.2,DP值24V,CE值15V。质谱参数:IonSprayVoltage:3000V;TEM:550℃。
3.标准品溶液的配制
左旋兰索拉唑工作溶液的配制:精密称取两份左旋兰索拉唑固体对照品适量,经质量校正系数校正后,用乙腈溶解并稀释后得到两份最终浓度为1.00mg/mL左旋兰索拉唑的储备液,储备液保存于4℃冰箱。右旋兰索拉唑工作溶液的配制:精密称取两份右旋兰索拉唑固体对照品适量,经质量校正系数校正后,用乙腈溶解并稀释后得到两份最终浓度为1.00mg/mL右旋兰索拉唑的储备液,储备液保存于4℃冰箱。经储备液检查合格后,各精密量取一份左旋兰索拉唑储备液和右旋兰索拉唑储备液,用乙腈:水(50:50,v/v)稀释,配制一系列浓度为5.00/5.00,10.0/10.0,50.0/50.0,150/150,500/500,1500/1500,4500/4500,5000/5000ng/mL(左旋兰索拉唑/右旋兰索拉唑)的标准曲线样品工作溶液,再各精密量取另一份左旋兰索拉唑储备液和右旋兰索拉唑储备液用乙腈:水(50:50,v/v)稀释,配制浓度为15.0/15.0,160/160,4000/4000ng/mL的QC工作溶液。
埃索美拉唑工作溶液的配制:精密称取埃索美拉唑固体对照品适量,经质量校正系数校正后,用乙腈溶解并稀释后得到最终浓度为0.500mg/mL埃索美拉唑的储备液,储备液保存于4℃冰箱。精密量取一定量的埃索美拉唑储备液用乙腈:水(50:50,v/v)稀释,配制成浓度为500ng/mL的内标工作液。
4.标准曲线样品及质控样品的配制
对于每个浓度水平的标准曲线样品和质控样品,其配制过程举例如下:在475μL的空白血浆中加入25.0μL相应的工作溶液,混合均匀。配制体积可据实际情况适当调整,配成含左旋兰索拉唑/右旋兰索拉唑浓度分别为5.00/5.00、10.0/10.0、50.0/50.0、150/150、500/500、1500/1500、4500/4500、5000/5000ng/mL的标准曲线样品和浓度分别为5.00/5.00ng/mL(LLOQ QC)、15.0/15.0ng/mL(LQC)、160/160ng/mL(MQC)、4000/4000ng/mL(HQC)的质控样品。
5.样品前处理
向1.0mL 96孔板中加入50μL的样品(待测生物样品,标准曲线样品、质控样品);对于双空白样品和空白样品,加入50μL的空白基质。在双空白样品中加入25μL溶剂乙腈:水(50:50,v/v),除双空白样品在外,在所有孔中加入25μL的内标工作液,后加入250μL乙腈。将96孔板以2000rpm/min涡旋震荡10min。将96孔板在4℃的条件下以4000rpm/min速度离心5min。取200μL上清液加入至干净的96孔板中,经氮气流在40℃下吹干后加入200μL复溶液乙腈:水(50:50,v/v)混匀置于进样室或者相同温度冰箱中待测。
6.方法学考察内容
根据2015年新版《中国药典》中《生物样品定量分析方法验证指导原则》对检测方法进行方法学验证,以确保检测的准确性、可重复性和稳定性。验证包括以下内容:特异性、标准曲线、精密度和准确度、基质效应、提取回收率、稳定性。
7.药代动力学研究
选取112名受试者,给药剂量从低到高分为10mg、20mg、30mg、60mg以及90mg共5个剂量组,单次给药:受试者给药前(0h)及静脉开始滴注后10min、20min、40min、60min(给药结束时)、75min、1.5h、2h、2.5h、3h、4h、6h、9h、12h、16h、24h和36h,6h,采集静脉血4mL置于肝素钠抗凝管中,翻转数次后暂存于冰盒中。多次给药:于试验第1天给药前(0h)及静脉开始滴注后10min、20min、40min、60min(给药结束时)、75min、1.5h、2h、2.5h、3h、4h、6h、9h、12h、16h、24h、36h,于试验第5、6天早晨给药前(0h)及给药结束时(1h),于第7天(末剂)给药前(0h)及静脉开始滴注后10min、20min、40min、60min(给药结束时)、75min、1.5h、2h、2.5h、3h、4h、6h、9h、12h、16h、24h、36h,采集静脉血4mL置于肝素钠抗凝管中,翻转数次后暂存于冰盒中,待血液凝集后离心(4℃,3500rpm离心10min,需在采集完成后30min内开始进行离心),分离出上层血浆分装3份(每份约600μL)作为检测、备份及留样样本。分装完成后立即放入≤-20℃冰箱暂存,随后在10h内转移至≤-60℃冰箱保存。血样的处理及转移操作于避光条件下进行,使用遮光窗帘和黄光灯。
结果与讨论
1.专属性
本试验所采用的色谱条件下,右旋兰索拉唑的保留时间为3.70min左右,如图4-1;左旋兰索拉唑的保留时间为3.65min左右,如图4-2;内标(埃索美拉唑)的保留时间为3.80min左右,如图4-1、图4-2所示;分别取6种不同来源的空白血浆各50μL,除不加内标外,按样品预处理操作,获得空白血浆样品色谱图,如图3-1-1~图3-6-2;定量下限样品色谱图见图5。取健康受试者静脉输注右兰索拉唑后收集的血浆样品按样品预处理操作,得健康受试者血浆样品色谱图,如图6。
2.准确度、精密度试验
由6批来自不同供体的空白基质混合成的基质配制含右旋兰索拉唑和左旋兰索拉唑浓度分别为5.00/5.00ng/mL(LLOQ QC)、15.0/15.0ng/mL(LQC)、160/160ng/mL(MQC)、4000/4000ng/mL
(HQC)的质控样品,每个浓度各配制6份样品,并配制两条标准曲线(由两条标准曲线样品回归得到),分别计算右旋兰索拉唑/左旋兰索拉唑的峰面积As-1和As-2和内标峰面积Ai的比值f1和f2,以f1和f2代入当天的标准曲线求得实测浓度及实测浓度平均值和准确度,计算批内精密度及准确度,结果见表2-1和表2-2。结果表明:除最低定量限(LLOQ)外,右旋兰索拉唑和左旋兰索拉唑的批内质控样品的精密度RSD均小于15%,批内准确度RE至少有三分之二不超过±15%,且每个浓度水平至少二分之一数量的质控样品与其理论值的偏差不超过±15%。最低定量限咪达那新样品的批内质控样品的精密度RSD均小于20%,批内准确度RE至少有三分之二不超过±20%,且每个浓度水平至少有二分之一数量的质控样品与其理论值的偏差不超过±20%,综上,精密度及准确度均符合要求。
表2-1批内、批间样品检测的精密度和准确度(RLSP)
表2-2批内、批间样品检测的精密度和准确度(SLSP)
3.基质效应考察
基质样品配制:取6份不同来源个体的空白血浆,每个不同来源的空白血浆制备九个重复的双空白样品,按样品预处理操作,得到空白基质提取液,提取之后加入一定的分析物和内标,以使其最终浓度分别与低、中、高浓度质控样品的进样浓度一致(每个浓度水平,三个重复)。
溶液样品的配制:以纯水代替空白血浆进行前处理步骤,后将工作溶液进行稀释配制成相应浓度使加入200μL空白基质提取液或200μL纯水提取液后浓度与低、中、高浓度质控样品前处理后进样浓度一致,且每一浓度3个重复样本。
结果显示,左旋兰索拉唑基质效应(以峰面积比值计算)总基质效应因子为0.987~0.997,偏差小于1.6%,右旋兰索拉唑基质效应(以峰面积比值计算)总基质效应因子为0.941~0.994,偏差小于6.7%,血浆基质不影响左旋兰索拉唑/右旋兰索拉唑准确定量。右旋兰索拉唑和左旋兰索拉唑的基质效应数据结果见表3-1和3-2。
表3-1基质效应(SLSP)
表3-2基质效应(RLSP)
计算方式:基质效应因子:对照溶液峰面积比/样品峰面积比
在高脂(300mg/dL甘油三酯)和溶血(2%溶血)基质中加入待测物使成LQC、HQC浓度水平,经标样校准后,每个浓度水平上述样品的平均测定值与其理论值的偏差≤±15.0%,精密度≤15.0%。该方法条件下,溶血基质(≤2%溶血)和高脂基质(≤300mg/dL甘油三酯)均不影响右旋兰索拉唑和左旋兰索拉唑测定准确度和精密度,具体数据结果见表3-3和3-4。
表3-3溶血评价
表3-4高脂评价
4.提取回收率考察
基质样品配制:取6份不同来源个体的空白血浆,每个不同来源的空白血浆制备九个重复的双空白样品,按样品预处理操作,得到空白血浆提取液,提取之后加入一定的分析物和内标,以使其最终浓度分别与低、中、高浓度质控样品的进样浓度一致(每个浓度水平,三个重复)。
质控样品配制:取低、中、高三种浓度的质控样品按照样品处理方法处理,每一浓度水平配制6份。
通过基质样品与质控样品待测物与内标峰面积比值响应的比较评价待测物的回收率;通过质控样品与基质样品内标物峰面积响应的比较评价内标物的回收率。
回收率的接受标准为:每个浓度水平和所有浓度水平的回收率的精密度应在15%之内。右旋兰索拉唑的总提取回收率(以峰面积比值计算)为100.13%,其中在低、中、高三个浓度水平的回收率分别为102.89%、98.31%和99.19%,左旋兰索拉唑的总提取回收率为98.26%,其中在低、中、高三个浓度水平的回收率分别为99.95%、97.49%和97.34%,右旋兰索拉唑和左旋兰索拉唑的具体数据分别见表4-1、表4-2。
表4-1待测物提取回收率(RLSP)
表4-2待测物提取回收率(SLSP)
5.稳定性考察
进样器稳定性:考察精密度、准确度的分析批首次进样分析后,放置于自动进样器(5℃)146h后,再次进样分析,记录色谱图。结果见表5-1和表5-2,右旋兰索拉唑和左旋兰索拉唑的血浆样品处理后的进样溶液在进样器中放置146h稳定性良好,符合生物样品分析的要求。
室温稳定性:将配置好的低、高两个浓度水平的质控样品,含左旋兰索拉唑/右旋兰索拉唑浓度分别为15.0/15.0ng/mL,160/160ng/mL,每个浓度水平的样品混合均匀后,于室温放置24h后进行样品预处理,进行LC-MS/MS分析,记录色谱图。结果如表6所示,血浆样品在室温条件下放置24h稳定性良好。
冻融稳定性:新鲜配制含左旋兰索拉唑/右旋兰索拉唑浓度分别为15.0/15.0ng/mL,160/160ng/mL的样品,分别放入-20℃冰箱和-80℃冰箱中进行5次冻融循环。接受标准为:稳定性样品的平均测定值与其理论值的%RE不应超过±l5.0%,各浓度水平下稳定性样品测定值的%RSD应≤15.0%。结果见表7-1和表7-2,样品在-20℃冰箱和-80℃冰箱经过5次冻融循环后,稳定性良好。
长期稳定性:新鲜配制含左旋兰索拉唑/右旋兰索拉唑浓度分别为15.0/15.0ng/mL,160/160ng/mL的样品,分别放入-20℃冰箱和-80℃冰箱中冻存91天后检测。接受标准为:稳定性样品的平均测定值与其理论值的%RE不应超过±l5.0%,各浓度水平下稳定性样品测定值的%RSD应≤15.0%。结果见表8-1和表8-2,样品在-20℃冰箱和-80℃冰箱冻存91天,稳定性良好。
表5-1制备后样品的稳定性(RLSP)
表5-2制备后样品的稳定性(SLSP)
表6室温稳定性
表7-1 -20℃冻融稳定性
表7-1 -80℃冻融稳定性
表8-1长期稳定性(RLSP)
表8-2长期稳定性(SLSP)
本发明提供的检测方法,在配制样品时以乙腈:水(50:50,v/v)作为溶剂,右旋兰索拉唑的总提取回收率(以峰面积比值计算)为100.13%,左旋兰索拉唑的总提取回收率为98.26%;而在中国专利CN 111337615A中,采用含0.1%氨水的乙腈作为溶剂,右旋拉唑的总提取回收率(以峰面积比值计算)106.6%,左旋兰索拉唑的总提取回收率为105.3%。
本发明在色谱分析时进行梯度洗脱,左旋兰索拉唑基质效应(以峰面积比值计算)总基质效应因子为0.987~0.997,总体精密度小于0.5%;右旋兰索拉唑基质效应(以峰面积比值计算)总基质效应因子为0.941~0.994,总体精密度小于2.9%;而在中国专利CN111337615A在色谱分析时进行等度洗脱,分析时间长,左旋兰索拉唑基质效应(以峰面积比值计算)总基质效应因子为0.909~0.958,右旋兰索拉唑基质效应(以峰面积比值计算)总基质效应因子为0.914~0.982。
在本发明的基础上,保留本发明的其他条件而仅改变本发明的液相方法采用中国专利CN 111337615A中的液相方法,结果显示当其他条件均未改变仅改变本发明的液相方法为中国专利CN 111337615A中的液相方法时,左旋和右旋兰索拉唑的保留时间分别为6.39min和6.51min,且响应仅为本发明中响应的一半;保留本发明的其他条件,而将前处理中的沉淀剂从乙腈换为中国专利CN 111337615A中的含0.1%氨水的乙腈的内标沉淀剂,进行提取回收率的考察,结果显示提取回收率的精密度相差较大,右旋兰索拉唑的总提取回收率(以峰面积比值计算)为92.35%,总体精密度大于11.4%,左旋兰索拉唑的总提取回收率(以峰面积比值计算)为95.62%,总体精密度大于9.6%。
综上所述,采用本发明的方法,相对于中国专利CN 111337615A中公开的检测方法,除了分析时间短、仪器选择范围广等优势外,在方法验证方面也取得了更好的效果。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案,而非对其限制;尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明,本领域的普通技术人员应当理解:其依然可能对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分技术特征进行等同替换;而这些修改或者替换,并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (2)
1.一种HPLC-MS/MS联用同时检测人血浆中左旋兰索拉唑和右旋兰索拉唑的方法,其特征在于,它包括以下步骤:(1)人血浆样品前处理;(2)液相色谱-质谱联用检测;(3)人血浆中左旋兰索拉唑和右旋兰索拉唑的测定;
液相色谱条件包括:采用流动相A和流动相B为混合流动相进行梯度洗脱,高相液相色谱仪器为Shimadzu LC-20AD系列;色谱柱为DaicelCHIRALPAK® IC 手性柱,4.60 mm×150mm,5.0 μm;所述流动相A为体积比为95:5的乙腈-水;所述流动相B为包含0.05%乙酸的5mM乙酸铵水溶液-乙腈,其中,乙酸铵水溶液-乙腈的体积比为60:40;柱温为25℃;流速为0.8mL/min;所述梯度洗脱过程如下:在0-0.5分钟内,流动相A和流动相B的体积比为55:45;在0.5-4.5分钟内,流动相A和流动相B的体积比由55:45匀速渐变至60:40;在4.5-4.6分钟内,流动相A和流动相B的体积比由60:40匀速渐变至90:10;在4.6-5.0分钟内,流动相A和流动相B的体积比为90:10;在5.0-5.1分钟内,流动相A和流动相B的体积比由90:10匀速渐变至55:45;在5.1-6.5分钟内,流动相A和流动相B的体积比为45:55;
质谱条件包括:质谱仪器为API 3000;采用电喷雾离子源,正离子多反应监测扫描,喷雾电压3000 V,离子源温度 550℃;左旋兰索拉唑,[M+H]+,m/z 370.201→252.0,DP值30V,CE值16 V;右旋兰索拉唑,[M+H]+,m/z 370.2→252.0,DP值30 V,CE值16 V;埃索美拉唑,[M+H]+,m/z 346.2→198.2,DP值24 V,CE值 15 V;
人血浆样品前处理包括:取50μL人血浆样品加入1.0 mL 96孔板中,向所有孔中加入25μL内标工作液和200µL乙腈,将96孔板以2000 rpm/min涡旋震荡10 min,将96孔板在4℃的条件下以4000 rpm/min速度离心5 min,取200 µL上清液加入至干净的96孔板中,经氮气流在40℃下吹干后加入200 µL体积比为50:50的乙腈-水混合后,即得待测样品;将待测样品置于自动进样器,进行LC-MS/MS分析,进样量为5μL,进样器温度5℃;
所述内标工作液的配制:称取埃索美拉唑对照品,采用乙腈溶解并稀释得到浓度为0.5mg/ml埃索美拉唑的储备液,再用体积比为50:50的乙腈与水混合溶液稀释得到浓度为500ng/mL的内标工作液。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,该方法用于临床药代动力学样本检测。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202110498547.9A CN113358768B (zh) | 2021-05-08 | 2021-05-08 | 一种hplc-ms/ms联用同时检测人血浆中左旋兰索拉唑和右旋兰索拉唑的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202110498547.9A CN113358768B (zh) | 2021-05-08 | 2021-05-08 | 一种hplc-ms/ms联用同时检测人血浆中左旋兰索拉唑和右旋兰索拉唑的方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN113358768A CN113358768A (zh) | 2021-09-07 |
CN113358768B true CN113358768B (zh) | 2022-12-23 |
Family
ID=77525882
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202110498547.9A Active CN113358768B (zh) | 2021-05-08 | 2021-05-08 | 一种hplc-ms/ms联用同时检测人血浆中左旋兰索拉唑和右旋兰索拉唑的方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN113358768B (zh) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN115236171A (zh) * | 2022-06-06 | 2022-10-25 | 南京海纳医药科技股份有限公司 | 一种icp-ms联用检测人血浆中铋浓度的方法 |
Family Cites Families (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN104330488B (zh) * | 2014-10-24 | 2016-11-02 | 中美华世通生物医药科技(武汉)有限公司 | 测定右旋兰索拉唑中疑似基因毒性杂质的方法 |
CN104483403B (zh) * | 2014-12-05 | 2016-06-01 | 广东东阳光药业有限公司 | 一种检测右兰索拉唑原料药有关物质的方法 |
CN105467048B (zh) * | 2015-11-25 | 2017-06-16 | 宜昌东阳光长江药业股份有限公司 | 一种含兰索拉唑原料药的杂质检测方法 |
CN108205020A (zh) * | 2016-12-16 | 2018-06-26 | 天津药物研究院有限公司 | 一种兰索拉唑左旋异构体的测定方法 |
CN110873767B (zh) * | 2018-09-04 | 2022-03-11 | 天津药物研究院有限公司 | 一种右兰索拉唑合成中间体及其有关物质的快速检测方法 |
CN109298106A (zh) * | 2018-12-06 | 2019-02-01 | 广东省生物资源应用研究所 | 一种超高效合相色谱-质谱联用定量检测生物样本中左旋兰索拉唑和右旋兰索拉唑的方法 |
CN111337615A (zh) * | 2020-04-22 | 2020-06-26 | 江苏省人民医院(南京医科大学第一附属医院) | 液质联用技术同时检测人血浆中奥美拉唑、雷贝拉唑、兰索拉唑和泮托拉唑对映体的浓度 |
-
2021
- 2021-05-08 CN CN202110498547.9A patent/CN113358768B/zh active Active
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN113358768A (zh) | 2021-09-07 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN109239224B (zh) | 酸枣仁水提物中9种入血成分的同时定量测定方法 | |
CN113358768B (zh) | 一种hplc-ms/ms联用同时检测人血浆中左旋兰索拉唑和右旋兰索拉唑的方法 | |
CN111272902A (zh) | 一种艾地骨化醇血药浓度的检测方法 | |
Xu et al. | Fingerprint and multi-ingredient quantitative analyses for quality evaluation of hawthorn leaves and Guang hawthorn leaves by UPLC-MS | |
CN111337615A (zh) | 液质联用技术同时检测人血浆中奥美拉唑、雷贝拉唑、兰索拉唑和泮托拉唑对映体的浓度 | |
CN110554104B (zh) | 一种hplc-ms/ms联用检测人血浆中咪达那新的方法 | |
Guo et al. | Measurement of fexofenadine concentration in micro‐sample human plasma by a rapid and sensitive LC‐MS/MS employing protein precipitation: application to a clinical pharmacokinetic study | |
CN112415114A (zh) | 人血浆中缬沙坦和沙库巴曲的浓度的测定方法及其用途 | |
CN117092228A (zh) | 一种基于hplc-ms/ms联用检测生物样品中水黄皮素的方法 | |
CN103487539B (zh) | 利用超快速液相色谱-串联三重四级杆质谱测定家蚕血淋巴中阿苯达唑及代谢物含量的方法 | |
CN113325100B (zh) | 一种同时测定多种脂肪酸在血液中含量的方法及其应用 | |
CN112198251B (zh) | 含蟾皮类药材制剂中六种蟾蜍甾烯内酯成分在血浆或组织中浓度的检测方法 | |
CN111175395B (zh) | 一种卡芬太尼和卡芬太尼代谢物的检测方法 | |
CN113533584A (zh) | 瓜蒌薤白半夏剂中2种入血成分的同时定量检测方法及应用 | |
Auriola et al. | Determination of Catharanthus roseus alkaloids by high-performance liquid chromatography-isotope dilution thermospray-mass spectrometry | |
Yadav et al. | Development and validation of a sensitive and rapid method to determine naratriptan in human plasma by LC-ESI-MS-MS: application to a bioequivalence study | |
CN113588855A (zh) | 野马追的质量检测方法 | |
Zhang | Dynamic Biodistribution of Icaritin and Its Phase-II Metabolite in Rat Tissues by Ultra-High Performance Liquid Chromatography–Tandem Mass Spectrometry | |
CN112198269A (zh) | 一种测定Beagle犬血浆中羟基酪醇的方法 | |
CN112834680A (zh) | 一种测定肿瘤患者血浆中替加氟、吉美嘧啶和5-氟尿嘧啶浓度的方法 | |
CN115343386A (zh) | 一种hplc-ms/ms联用检测人血浆中吡仑帕奈的方法 | |
CN113720930A (zh) | 一种hplc-ms/ms联用检测人血浆中奥美拉唑的方法 | |
CN113671055A (zh) | 一种检测中药材银杏叶中咖啡因含量的方法 | |
Sioufi et al. | Simultaneous determination of clomipramine and its N-desmethyl metabolite in human whole blood by capillary gas chromatography with mass-selective detection | |
CN112730682B (zh) | 一种抗病毒药物临床研究血浆样本中奥司他韦及代谢物奥司他韦酸浓度的生物分析方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |