CN112834637A - 反相高效液相色谱检测帕拉米韦中间体i的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种反相高效液相色谱检测帕拉米韦中间体I的方法，步骤包括制备供试品溶液，采用反相高效液相色谱对供试品进行检测，按面积归一化法计算供试品中单个杂质和总杂质的含量；通过本方法，改变流动相及配比，紫外吸收检测器的波长等，将中间体I与各杂质色谱峰完全分离；本发明检测时间短，检测的特异性、准确度和灵敏度高，对帕拉米韦中间体I能进行更精准的检测和质量控制。

Description

反相高效液相色谱检测帕拉米韦中间体I的方法
技术领域
本发明涉及一种帕拉米韦中间体的检测方法，尤其涉及一种帕拉米韦三水合物中间体I的反相高效液相色谱检测方法。
背景技术
帕拉米韦合成主要中间体I为叔丁基(3aR，4R，6R，6aS)-6-(羟甲基)-3-(戊-3-基)-3a，5，6，6a-四氢-4H-环戊烷[d]异恶唑-4-基)氨基甲酸酯，分子式为C18H34N2O5，分子量为358.5，结构式如下所示，
Figure BDA0002871209020000011
目前市场供应帕拉米韦中间体的厂商较多，质量差异较大，存在一些杂质化合物，一些杂质的存在会严重影响帕拉米韦的质量和用药安全，因此需要对其进行检测和质量控制。帕拉米韦中间体存在多个pKa，对于流动相pH的筛选存在较大困难。
发明内容
发明目的：本发明的目的是提供一种具有高特异性、准确度和灵敏度的反相高效液相色谱检测帕拉米韦中间体I的方法。
一种反相高效液相色谱检测帕拉米韦中间体I的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)制备供试品溶液，称取中间体I用甲醇溶解并稀释，得到浓度为3～5mg/ml的供试品溶液；
(2)色谱柱固定相采用嵌入极性酰胺基团的长烷基硅胶为填充剂，流动相A为高氯酸磷酸盐水溶液，流动相B为乙腈-水-高氯酸混合溶液，检测器为紫外吸收检测器；
(3)采用反相高效液相色谱对供试品溶液进行检测，进样，梯度洗脱；
(4)按面积归一化法计算供试品中单个杂质和总杂质的含量。
在一些实施方案中，步骤(2)所述流动相A中磷酸盐为磷酸二氢钾。
在一些实施方案中，步骤(2)所述流动相A中磷酸盐摩尔浓度为5-15mmol/l。
在一些实施方案中，步骤(2)所述流动相A中高氯酸浓度为0.05％-0.5％。
在一些实施方案中，步骤(2)所述流动相B中乙腈-水的比例为93：7～97：3。
在一些实施方案中，步骤(2)所述流动相B中高氯酸的浓度为0.05％～0.5％。
在一些实施方案中，步骤(2)所述色谱柱柱温为20-50℃。
在一些实施方案中，步骤(2)所述紫外吸收检测器的波长采用195～210nm。
在一些实施方案中，步骤(3)所述进样，其进样量为5～100μl。
在一些实施方案中，步骤(3)所述梯度洗脱流动相的浓度配比为：
Figure BDA0002871209020000021
优选的，步骤(2)中，色谱柱的规格：内径为3.0～5.0mm，长度为100～250mm，填料粒径为3～5μm。进一步地，色谱柱的规格：内径为4.6mm，长度为250mm，填料粒径为3.5μm。
进一步的，色谱柱为Agilent Bonus RP。
优选的，色谱柱柱温为30℃。
优选的，步骤(2)中，流动相A中的磷酸盐浓度为5～15mmol/l，进一步优选为10mmol。进一步地，流动相A中高氯酸的浓度为0.05％～0.5％，优选为0.2％。
优选的，步骤(2)中，流动相B中乙腈-水(93：7～97：3)。进一步的，流动相B中高氯酸的浓度为0.05％～0.5％，优选为0.1％。
进一步的，进样量为5～100μl，优选为5μl。流速为0.9～1.1ml/min，优选为1.0ml/min。
进一步的，紫外吸收检测器的波长为195～210nm，优选为200nm。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：本发明能有效分离粗品样品中7个杂质峰；检测时间短，同时保证检测的特异性、准确度和灵敏度，对帕拉米韦中间体I能进行更精准的检测和质量控制。
附图说明
图1为空白溶剂谱图；
图2为分离度溶液谱图；
图3为帕拉米韦中间体供试品溶液谱图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的技术方案作进一步说明。
如表2、表3所示为本检测实施例及对比例所使用的仪器、试剂及杂质对照品的型号批号及来源。
表2本检测方法所使用的仪器与试剂
名称 型号/规格 生产厂家
高效液相色谱仪 U3000-DAD Thermo
电子天平 MSA125P-1CE-DU 赛多利斯
磷酸二氢钾 GR级/500mL/瓶 国药集团化学试剂有限公司
高氯酸 RG级/500mL瓶 Adamas
磷酸 HPLC级/1L/瓶 TEDIA
表3本检测方法所采用的对照品
名称 批号 含量/％ 来源
杂质1 S0405-191016-0101 93.2％ 南京正济医药研究有限公司
杂质2 S0404-191012-0101 93.9％ 南京正济医药研究有限公司
杂质3 S0414-200604-0101 87.8％ 南京正济医药研究有限公司
杂种4 S0408-191202-0401 97.8％ 南京正济医药研究有限公司
杂质5 S0405-190920-0101 97.6％ 苏州天马药业有限公司
杂质6 S0414-200410-0101 78.6％ 南京正济医药研究有限公司
杂质7 b1955R 91.9％ 苏州天马药业有限公司
帕拉米韦中间体 2A0912004051 / 苏州天马药业有限公司
实施例1：专属性试验
稀释剂：甲醇
杂质1定位溶液：取杂质1对照品约5mg，精密称定，置10ml量瓶，加稀释剂溶解并稀释至刻度线摇匀，制备成杂质1对照品浓度约为0.5mg/ml的溶液。
杂质2定位溶液：取杂质2对照品约5mg，精密称定，置10ml量瓶，加稀释剂溶解并稀释至刻度线摇匀，制备成杂质2对照品浓度约为0.5mg/ml的溶液。
杂质3定位溶液：取杂质3对照品约5mg，精密称定，置10ml量瓶，加稀释剂溶解并稀释至刻度线摇匀，制备成杂质3对照品浓度约为0.5mg/ml的溶液。
杂质4定位溶液：取杂质4对照品约5mg，精密称定，置10ml量瓶，加稀释剂溶解并稀释至刻度线摇匀，制备成杂质4对照品浓度约为0.5mg/ml的溶液。
杂质5定位溶液：取杂质5对照品约5mg，精密称定，置10ml量瓶，加稀释剂溶解并稀释至刻度线摇匀，制备成杂质5对照品浓度约为0.5mg/ml的溶液。
杂质6定位溶液：取杂质6对照品约5mg，精密称定，置10ml量瓶，加稀释剂溶解并稀释至刻度线摇匀，制备成杂质6对照品浓度约为0.5mg/ml的溶液。
杂质7定位溶液：取杂质7对照品约5mg，精密称定，置10ml量瓶，加稀释剂溶解并稀释至刻度线摇匀，制备成杂质7对照品浓度约为0.5mg/ml的溶液。
系统适用性溶液：取帕拉米韦中间体对照品约50mg，置10ml量瓶，加适量稀释剂溶解后，再精密移取各杂质定位溶液1.0ml，再加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，制备成帕拉米韦中间体浓度约5mg/ml，杂质浓度约50μg/ml的溶液。供试品溶液：取帕拉米韦中间体约50mg，精密称定，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，制备成帕拉米韦中间体浓度约为0.5mg/ml的溶液。
表4各供试品溶液和空白溶液采用反相高效液相色谱进行检测
Figure BDA0002871209020000041
Figure BDA0002871209020000051
记录色谱图，结果见表5和图1～3。
表5专属性试验结果
Figure BDA0002871209020000052
由表5和图1～图3可见，空白溶液在供试品与对照品溶液中主峰保留时间处无干扰；杂质与主成分之间的分离度≥1.5，说明采用本申请的检测方法专属性符合质控要求。
实施例2：灵敏度试验
取实施例1制备的系统适用性溶液，逐级稀释至合适倍数，以信噪比≥10∶1时的溶液作为定量限溶液；以信噪比≥3∶1时的溶液作为检测限溶液。
分别精密量取上述溶液各5μl，注入液相色谱仪，定量限溶液连续进样6针，检测限溶液进样1针，记录色谱图，结果见表2。
表6定量限、检测限结果
Figure BDA0002871209020000053
Figure BDA0002871209020000061
实施例3：线性试验
取帕拉米韦中间体对照品溶液用稀释剂稀释制成一系列浓度的对照溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图，结果见表7。
表7线性实验结果
Figure BDA0002871209020000062
由表7可见，在3.11～15.54μg/ml范围内，本发明检测方法具有良好的线性关系。
实施例4：重复性试验
称取帕拉米韦中间体用稀释剂溶解并稀释，得到浓度为1.0mg/ml的供试品溶液；平行制备6份供试品溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图，计算供试品中各杂质和总杂质的含量，结果见表8。
表8重复性实验结果
Figure BDA0002871209020000071
由表8可见，平行配制的6份溶液，供试品溶液中杂质检出量RSD均在10％以内，说明本申请的检测方法重复性良好。

Claims (10)

1.一种反相高效液相色谱检测帕拉米韦中间体I的方法，所述中间体I的化学名称为：叔丁基(3aR，4R，6R，6aS)-6-(羟甲基)-3-(戊-3-基)-3a，5，6，6a-四氢-4H-环戊烷[d]异恶唑-4-基)氨基甲酸酯，其特征在于，包括以下步骤：
(1)制备供试品溶液，称取中间体I用甲醇溶解并稀释，得到浓度为3～5mg/ml的供试品溶液；
(2)色谱柱固定相采用嵌入极性酰胺基团的长烷基硅胶为填充剂，流动相A为高氯酸磷酸盐水溶液，流动相B为乙腈-水-高氯酸混合溶液，检测器为紫外吸收检测器；
(3)采用反相高效液相色谱对供试品溶液进行检测，进样，梯度洗脱；
(4)按面积归一化法计算供试品中单个杂质和总杂质的含量。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)所述流动相A中磷酸盐为磷酸二氢钾。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)所述流动相A中磷酸盐摩尔浓度为5-15mmol/l。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)所述流动相A中高氯酸浓度为0.05％-0.5％。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)所述流动相B中乙腈-水的比例为93：7～97：3。
6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)所述流动相B中高氯酸的浓度为0.05％～0.5％。
7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)所述色谱柱柱温为20-50℃。
8.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)所述紫外吸收检测器的波长采用195～210nm。
9.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(3)所述进样，其进样量为5～100μl。
10.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(3)所述梯度洗脱流动相的浓度配比为：
Figure FDA0002871209010000011
Figure FDA0002871209010000021
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