CN115772209A - 一种纽莫康定杂质 - Google Patents

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CN115772209A
CN115772209A CN202111042403.9A CN202111042403A CN115772209A CN 115772209 A CN115772209 A CN 115772209A CN 202111042403 A CN202111042403 A CN 202111042403A CN 115772209 A CN115772209 A CN 115772209A
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曾凡洲
朱兵峰
刘志钰
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Abstract

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种纽莫康定杂质h及其制备方法，制备方法包括以下步骤：将含有纽莫康定杂质h的粗品用醇溶剂溶解，反相制备柱上样，以水为流动相A、以极性溶剂为流动相B进行梯度洗脱，收集目标成分流出液，收集液经减压浓缩、冻干得纽莫康定杂质h，本发明丰富了纽莫康定杂质谱，对其质量研究、合成卡泊芬净中有关杂质传递研究、用药安全性等提供了重要依据，具有指导意义。

Description

一种纽莫康定杂质
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种纽莫康定杂质、其制备方法和其用于纽莫康定质量控制中的用途。
背景技术
纽莫康定(pneumocandins)是由真菌Glarea lozoyensis产生的次级代谢产物，是合成抗真菌药物卡泊芬净(Caspofungin)的前体化合物，具有环状六肽母核和脂肪酸侧链结构。按照不同脯氨酸在母核上取代的位置差异主要可以分成三大类分别是纽莫康定A0(32羟基42甲基脯氨酸)、B0(32羟基脯氨酸)、和C0(42羟基脯氨酸)。
专利CN201710575306.3公开了肺念菌素B0(即纽莫康定B0)及类似物的结构，纽莫康定各组分结构如下式I所示：
Figure BDA0003249821770000011
Figure BDA0003249821770000012
Figure BDA0003249821770000021
药物杂质没有治疗作用，并且影响药物的稳定性以及疗效。杂质检测和含量控制对药品质量控制以及安全用药密切相关。国家药品监督管理局(NMPA)对药物临床前研究中的杂质分析也越来越重视。在已经实施的2020年版《中国药典》中对于药品安全性的监管也更加严格。因此，制备出文献中尚未报道的杂质对于丰富纽莫康定杂质谱、质量研究、后期合成卡泊芬净杂质传递研究、用药安全性等，均具有重大的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种纽莫康定杂质，以解决现有技术中未能全面监控纽莫康定中存在的未知杂质问题。
本发明第一方面提供一种纽莫康定杂质，为方便叙述说明，命名为纽莫康定杂质h：
一种纽莫康定杂质，具有如下式所示结构：
Figure BDA0003249821770000022
本发明第二方面提供一种纽莫康定杂质h的制备方法：
一种纽莫康定杂质h的制备方法包括以下步骤：将含有纽莫康定杂质h的粗品用醇溶剂溶解，反相制备柱上样，以纯化水为流动相A、以极性溶剂为流动相B进行梯度洗脱，收集目标成分流出液，收集液经减压浓缩、冻干得纽莫康定杂质h。
优选地，所述醇溶剂选自甲醇或乙醇。
优选地，所述极性溶剂选自乙腈、丙酮、甲醇中的一种，进一步优选为乙腈。
优选地，所述的含有纽莫康定杂质h的粗品与醇溶剂的质量体积比为1:2.0～4.0，其中质量以g计，体积以mL计。
进一步优选地，所述的含有纽莫康定杂质h的粗品与醇溶剂的质量体积比为1:2.0～3.0，其中质量以g计，体积以mL计。
优选地，所述的制备柱为装有反相填料的制备柱，所述反相填料选自Sepax GP-C18(5um，120A)，Unisil 8-120 C18，Unisil 5-120 C18，Unisil 10-100 C18，KROMASIL10-100 C18，FUJI C18 SPS100-9中的一种；进一步优选为Sepax GP-C18(5um，120A)。
优选地，以装柱填料的重量计，所述的制备柱上样量为0.0033-0.0075g/g。
优选地，所述的梯度洗脱包含三个阶段，依次为：纽莫康定杂质h洗脱阶段；纽莫康定B0及纽莫康定C0洗脱阶段、平衡阶段，其中所述的纽莫康定杂质h洗脱阶段梯度洗脱的流速为35ml/min～45ml/min，进一步优选为40ml/min。
优选地，所述的洗脱梯度为：
时间min 流速ml/min A％ B％
0 40 55.0-65.0 35.0-45.0
5 40 55.0-65.0 35.0-45.0
6 40 35.0-45.0 55.0-65.0
7 40 35.0-45.0 55.0-65.0
8 40 55.0-65.0 35.0-45.0
65 40 55.0-65.0 35.0-45.0
70 70 7.0-15.0 85.0-93.0
100 70 7.0-15.0 85.0-93.0
101 40 55.0-65.0 35.0-45.0
130 40 55.0-65.0 35.0-45.0
其中，流动相A为纯化水，流动相B选自乙腈、丙酮、甲醇中的一种。
进一步优选地，所述的梯度洗脱的梯度条件为：
Figure BDA0003249821770000031
Figure BDA0003249821770000041
其中，流动相A为纯化水，流动相B选自乙腈、丙酮、甲醇中的一种。
优选地，所述梯度洗脱测定波长范围是270～280nm，进一步优选为278nm。
优选地，所述的减压浓缩条件为：水浴温度35～45℃、真空度-0.090MPa～-0.100MPa。
优选地，所述的冻干的冻干参数设置为：
Figure BDA0003249821770000042
进一步优选地，所述冻干曲线参数为：
Figure BDA0003249821770000043
优选地，所述纽莫康定杂质h的制备方法在制备得到纽莫康定杂质h的同时，可以制备获得纽莫康定B0及其同分异构体纽莫康定C0的混合物。
本发明中用于制备纽莫康定杂质h的粗品来源于纽莫康定的粗品溶液，所述的纽莫康定的粗品可采用专利CN201610740366.1中公开的方法获得：
将含有纽莫康定B0的中试发酵液在搅拌的状态下，用磷酸调节pH值4.2，加入2％的助滤剂硅藻土，混匀，静置0.5小时，过滤，得到固体菌渣。菌渣用2倍95％乙醇浸提，过滤去除菌丝，得浸提液；调整浸提液的乙醇浓度至20％(V/V)。将其以0.5-1.0BV/h的速度流经D101柱，依次用纯化水、30％(V/V)乙醇-水溶液冲洗树脂柱，然后用80％(V/V)乙醇-水溶液洗脱树脂柱，收集富含纽莫康定B0的洗脱液。在洗脱液中加入0.5％活性炭，在20℃条件下搅拌30分钟，过滤脱色。脱色液经过超滤过滤后，加水稀释至30％(V/V)。以0.5-1.0BV/h的速度流经KB-SPE-HLB柱，用含乙醇30％(V/V)溶液冲洗树脂柱，再用乙醇80％(V/V)溶液洗脱，收集富含纽莫康定B0的洗脱液。将收集到的纽莫康定B0洗脱液，在30℃条件下真空浓缩，得到纽莫康定粗品。经HPLC检测，粗品中纽莫康定杂质h的色谱纯度约为0.10％。
化合物结构鉴定：
对本发明得到的冻干粉经过液质分析，得纽莫康定杂质分子量：1062.5，将所得产物进行液相检测，在原研HPLC检测方法中RRT约0.66，其中，纽莫康定杂质h结构鉴定结果如下：
Figure BDA0003249821770000051
其分子式为：C50H78N8O17。
纽莫康定杂质h样品在CD3OD中的1H-NMR数据见表1。
表1
Figure BDA0003249821770000052
Figure BDA0003249821770000061
纽莫康定杂质h样品的13C-NMR谱的检测数据见表2。
Figure BDA0003249821770000071
表2 纽莫康定杂质h在CD3OD中的13C-NMR数据(ppm)
Figure BDA0003249821770000072
Figure BDA0003249821770000081
使用美国Thermo SCIENTIFIC Nicolet is 10红外光谱仪，以KBr压片，纽莫康定杂质h样品的IR谱图见图5，纽莫康定杂质h样品的IR谱各吸收峰归属见表3。
表3
Figure BDA0003249821770000082
(1)1632cm-1为酰胺的C＝O伸缩振动吸收，1236cm-1为酰胺中的C-N伸缩振动吸收，说明化合物中含有酰胺结构。
(2)2956cm-1、2872cm-1为甲基的C-H伸缩振动吸收，2927cm-1、2855cm-1为亚甲基的C-H伸缩振动吸收，1443cm-1、1379cm-1为亚甲基和甲基的C-H弯曲振动吸收，说明化合物中含有甲基和亚甲基结构。
(3)1536cm-1、1518cm-1为苯环的骨架伸缩振动吸收，840cm-1为苯环的＝C-H弯曲振动吸收，说明化合物中含有苯环结构。
解析结果表明：该样品的红外光谱图特征与目标化合物的化学结构基本相符合。
纽莫康定杂质h样品在甲醇中的紫外吸收光谱图见图6，纽莫康定杂质h样品在氢氧化钠溶液中的紫外吸收光谱图见图7，纽莫康定杂质h样品的UV谱测定数据见表4。
表4
Figure BDA0003249821770000091
在0.1mol/L NaOH溶液中，λmax＝243nm的吸收峰为纽莫康定杂质h样品中取代苯环K带跃迁吸收峰，λmax＝290nm的吸收峰为纽莫康定杂质h样品中取代苯环B带跃迁吸收峰。
在甲醇溶液中，λmax＝223nm的吸收峰为纽莫康定杂质h样品中取代苯环K带跃迁吸收峰，λmax＝277nm的吸收峰为纽莫康定杂质h样品中取代苯环B带跃迁吸收峰。以上紫外吸收光谱表明：本品中可能含有苯环等官能团。
本发明第三方面提供一种纽莫康定杂质用于控制纽莫康定质量中的用途，该用途的实现具体包括一下过程：1)提供一种纽莫康定杂质h化合物作为参照样品；
(2)提供一种纽莫康定B0样品；
(3)提供一种含纽莫康定B0和纽莫康定杂质h化合物的样品；
(4)用HPLC分析检测法测定(1)中纽莫康定杂质h化合物参照样品、(2)中纽莫康定B0样品、(3)中含纽莫康定B0和纽莫康定杂质h化合物的样品。
本发明相对于现有技术取得的有益效果：
通过本发明技术方案，制备得到一种纽莫康定的杂质，该杂质在现有文献中未见报道。本发明丰富了纽莫康定杂质谱，对其质量研究、合成卡泊芬净中有关杂质传递研究、用药安全性等提供了重要依据，具有指导意义。
附图说明
图1实施例1纽莫康定杂质h在线制备图谱；
图2纽莫康定杂质h纯品的HPLC分析图谱；
图3纽莫康定B0纯品的HPLC分析图谱；
图4纽莫康定杂质h纯品与纽莫康定B0纯品同时进样的HPLC分析图谱；
图5纽莫康定杂质h样品的IR谱图；
图6纽莫康定杂质h在甲醇中的紫外吸收光谱图；
图7纽莫康定杂质h在氢氧化钠溶液中的紫外吸收光谱图。
具体实施方式
本发明中纽莫康定杂质h的分析检测方法为：
色谱柱：Ymc J’sphere ODS-M80，4.6×250mm，4um；
流动相A：0.1％磷酸水溶液；
流动相B：乙腈；
检测波长：210nm；
流速：1.5mL/min；
柱温：30.0℃；
进样量：10μl
梯度洗脱：
Time/min A％ B％
0 60 40
20 60 40
35 50 50
45 1 99
46 60 40
52 60 40
HPLC检测相对保留时间RRT为0.66目标峰对应纽莫康定杂质h。
参考实施例1
纽莫康定杂质h粗品的制备：以专利CN201610740366.1公开的方法制得。具体如下：将经真菌Glarea lozoyensis发酵得到的含有纽莫康定B0的中试发酵液3000L(发酵效价为708mg/L)在搅拌的状态下，用磷酸调节pH值4.2，加入2％的助滤剂硅藻土，混匀，静置0.5小时，过滤，得到固体菌渣。菌渣用2倍体积的95％乙醇浸提，过滤去除菌丝，得浸提液；调整浸提液的乙醇浓度至20％(V/V)。将其以0.5-1.0BV/h的速度流经D101柱，依次用纯化水、30％(V/V)乙醇-水溶液冲洗树脂柱，然后用80％(V/V)乙醇-水溶液洗脱树脂柱，收集富含纽莫康定B0的洗脱液。在洗脱液中加入0.5％活性炭，在20℃条件下搅拌30分钟，过滤脱色。脱色液经过超滤过滤后，加水稀释至30％(V/V)。以0.5-1.0BV/h的速度流经KB-SPE-HLB柱，用含乙醇30％(V/V)溶液冲洗树脂柱，再用乙醇80％(V/V)溶液洗脱，收集富含纽莫康定B0的洗脱液。将收集到的纽莫康定B0洗脱液，在30℃条件下真空浓缩，得到纽莫康定B0粗品1.38kg。该粗品中含有杂质h，色谱纯度为0.1％，亦为含有纽莫康定杂质h的粗品。
实施例1
将含有纽莫康定杂质h的粗品1.50g用4.5mL甲醇溶解，制备柱(装有Sepax GP-C18(5um，120A)填料300g)上样，以纯化水为流动相A、以乙腈为流动相B进行梯度洗脱，测定波278nm，收集在线制备谱图保留时间为44.23min目标成分(纽莫康定杂质h)流出液，收集在线制备谱图保留时间为72.13min～89.07min目标成分(纽莫康定B0及其同分异构体纽莫康定C0的混合物)，连续进样60针。分别合并收集纽莫康定杂质h流出液、纽莫康定B0及纽莫康定C0流出液，经减压浓缩、冻干得纽莫康定杂质h、纽莫康定B0及纽莫康定C0混合物。
制备洗脱梯度为：
时间min 流速ml/min A％ B％
0 40 60 40
5 40 60 40
6 40 40 60
7 40 40 60
8 40 60 40
65 40 60 40
70 70 10 90
100 70 10 90
101 40 60 40
130 40 60 40
纽莫康定杂质h在线制备图谱见图1，图1中标号1为纽莫康定杂质h，标号2为纽莫康定B0及其同分异构体纽莫康定C0的混合物；纽莫康定杂质h纯品的HPLC分析图谱见图2，图2中标号1为纽莫康定杂质h；纽莫康定B0纯品的HPLC分析图谱见图3，图3中标号1为纽莫康定B0。
冻干参数设置为：
Figure BDA0003249821770000111
Figure BDA0003249821770000121
其中，得到0.0910g纽莫康定杂质h的冻干粉，纽莫康定杂质h纯品的HPLC色谱纯度为99.32％，经过液质分析，分子量为1062.5，为纽莫康定杂质h，结果如下：
Figure BDA0003249821770000122
实施例2
将含有纽莫康定杂质h的粗品1.25g用4.5mL甲醇溶解，制备柱(装有Sepax GP-C18(5um，120A)填料300g)上样，以纯化水为流动相A、以乙腈为流动相B进行梯度洗脱，测定波278nm，收集在线制备谱图保留时间为51.76min目标成分(纽莫康定杂质h)流出液、收集在线制备谱图保留时间为73.87min～92.19min目标成分(纽莫康定B0及其同分异构体纽莫康定C0的混合物)。连续进样70针，分别合并收集纽莫康定杂质h流出液、纽莫康定B0及纽莫康定C0流出液，经减压浓缩、冻干得纽莫康定杂质h、纽莫康定B0及纽莫康定C0混合物。
制备洗脱梯度为：
时间min 流速ml/min A％ B％
0 40 65 35
5 40 65 35
6 40 45 55
7 40 45 55
8 40 65 35
65 40 65 35
70 70 15 85
100 70 15 85
101 40 65 35
130 40 65 35
冻干参数设置为：
Figure BDA0003249821770000123
Figure BDA0003249821770000131
其中，得到0.0879g纽莫康定杂质h冻干粉，纽莫康定杂质h纯品的HPLC色谱纯度为99.29％，经过液质分析，分子量为1062.5，为纽莫康定h，结果如下：
Figure BDA0003249821770000132
实施例3
将含有纽莫康定杂质h的粗品2.25g用4.5mL甲醇溶解，制备柱(装有Sepax GP-C18(5um，120A)填料300g)上样，以纯化水为流动相A、以乙腈为流动相B进行梯度洗脱，测定波278nm，收集在线制备谱图保留时间为39.42min目标成分(纽莫康定杂质h)流出液、收集在线制备谱图保留时间为71.62min～86.76min目标成分(纽莫康定B0及其同分异构体纽莫康定C0的混合物)。连续进样40针，分别合并收集纽莫康定杂质h流出液、纽莫康定B0及纽莫康定C0的流出液，经减压浓缩、冻干得纽莫康定杂质h、纽莫康定B0及纽莫康定C0混合物。
制备洗脱梯度为：
时间min 流速ml/min A％ B％
0 40 55 35
5 40 55 45
6 40 35 65
7 40 35 65
8 40 55 45
65 40 55 45
70 70 7 93
100 70 7 93
101 40 55 45
130 40 55 45
冻干参数设置为：
Figure BDA0003249821770000133
Figure BDA0003249821770000141
其中，得到0.0917g纽莫康定杂质h冻干粉，纽莫康定杂质h纯品的HPLC色谱纯度为97.12％，经过液质分析，分子量为1062.5，为纽莫康定h，结果如下：
Figure BDA0003249821770000142
实施例4
将含有纽莫康定杂质h的粗品1.00g用4.0mL甲醇溶解，制备柱(装有Sepax GP-C18(5um，120A)填料300g)上样，以纯化水为流动相A、以甲醇为流动相B进行梯度洗脱，测定波278nm，收集在线制备谱图保留时间为38.64min目标成分(纽莫康定杂质h)流出液、收集在线制备谱图保留时间为73.35min～89.43min目标成分(纽莫康定B0及其同分异构体纽莫康定C0的混合物)，连续进样80针，分别合并收集纽莫康定杂质h流出液、纽莫康定B0及纽莫康定C0的流出液，经减压浓缩、冻干得纽莫康定杂质h、纽莫康定B0及纽莫康定C0混合物。
制备洗脱梯度为：
时间min 流速ml/min A％ B％
0 40 65 35
5 40 65 35
6 40 45 55
7 40 45 55
8 40 65 35
65 40 65 35
70 70 15 85
100 70 15 85
101 40 65 35
130 40 65 35
冻干参数设置为：
Figure BDA0003249821770000143
Figure BDA0003249821770000151
其中，得到纽莫康定杂质h的0.0725g冻干粉，纽莫康定杂质h纯品的HPLC色谱纯度为96.37％，经过液质分析，分子量为1062.5，为纽莫康定h，结果如下：
Figure BDA0003249821770000152
实施例5
将含有纽莫康定杂质h的粗品1.33g用2.0mL乙醇溶解，制备柱(装有Unisil 8-120C18填料300g)上样，以纯化水为流动相A、以丙酮为流动相B进行梯度洗脱，测定波278nm，收集在线制备谱图保留时间为57.57min目标成分(纽莫康定杂质h)流出液、收集在线制备谱图保留时间为73.65min～92.68min目标成分(纽莫康定B0及其同分异构体纽莫康定C0的混合物)，连续进样60针，分别合并纽莫康定杂质h收集液、纽莫康定B0及纽莫康定C0的收集液，经减压浓缩、冻干得纽莫康定杂质h、纽莫康定B0及纽莫康定C0混合物。
制备洗脱梯度为：
时间min 流速ml/min A％ B％
0 40 65 35
5 40 65 35
6 40 45 55
7 40 45 55
8 40 65 35
65 40 65 35
70 70 15 85
100 70 15 85
101 40 65 35
130 40 65 35
冻干参数设置为：
Figure BDA0003249821770000153
其中，得到0.0677g纽莫康定杂质h的冻干粉，纽莫康定杂质h纯品的HPLC色谱纯度为96.48％，经过液质分析，分子量为1062.5，为纽莫康定h，结果如下：
Figure BDA0003249821770000161
实施例6
将含有纽莫康定杂质h的粗品1.25g用4.0mL乙醇溶解，制备柱(装有KROMASIL 10-100C18填料300g)上样，以纯化水为流动相A、以乙腈为流动相B进行梯度洗脱，测定波278nm，收集在线制备谱图保留时间为34.16min目标成分(纽莫康定杂质h)流出液、收集在线制备谱图保留时间为72.46min～86.97min目标成分(纽莫康定B0及其同分异构体纽莫康定C0的混合物)，连续进样70针，分别合并收集纽莫康定杂质h流出液、纽莫康定B0及纽莫康定C0的流出液，经减压浓缩、冻干得纽莫康定杂质h、纽莫康定B0及纽莫康定C0混合物。
制备洗脱梯度为：
时间min 流速ml/min A％ B％
0 40 50 50
5 40 50 50
6 40 30 70
7 40 30 70
8 40 50 50
65 40 50 50
70 70 5 95
100 70 5 95
101 40 50 50
130 40 50 50
冻干参数设置为：
Figure BDA0003249821770000162
其中，得到0.0648g纽莫康定杂质h的冻干粉，纽莫康定杂质h纯品的HPLC色谱纯度为95.10％，经过液质分析，分子量为1062.5，为纽莫康定h，结果如下：
Figure BDA0003249821770000171
实施例7
将含有纽莫康定杂质h的粗品1.25g用2.5mL甲醇溶解，制备柱(装有Unisil 5-120C18填料300g)上样，以纯化水为流动相A、以乙腈为流动相B进行梯度洗脱，测定波278nm，收集在线制备谱图保留时间为40.07min目标成分(纽莫康定杂质h)流出液、收集在线制备谱图保留时间为71.71min～87.05min目标成分(纽莫康定B0及其同分异构体纽莫康定C0的混合物)，连续进样70针，分别合并纽莫康定杂质h收集液、纽莫康定B0及纽莫康定C0的收集液，经减压浓缩、冻干得纽莫康定杂质h、纽莫康定B0及纽莫康定C0混合物。
制备洗脱梯度为：
时间min 流速ml/min A％ B％
0 40 55 35
5 40 55 45
6 40 35 65
7 40 35 65
8 40 55 45
65 40 55 45
70 70 7 93
100 70 7 93
101 40 55 45
130 40 55 45
冻干参数设置为：
Figure BDA0003249821770000172
其中，得到0.0901g纽莫康定杂质的冻干粉，纽莫康定杂质h纯品的HPLC色谱纯度为98.63％，经过液质分析，分子量为1062.5，为纽莫康定h，结果如下：
Figure BDA0003249821770000173
Figure BDA0003249821770000181
实施例8纽莫康定B0有关物质的分析检测
纽莫康定杂质h纯品溶液的配置：称取实施例1中得到的纽莫康定杂质h冻干粉10mg，加甲醇5ml超声溶解，稀释至刻度，摇匀，用0.22μm有机滤膜过滤，即得1.0g/L的纽莫康定杂质h溶液。
纽莫康定B0纯品溶液的配置：称取纽莫康定B0纯品4mg，置于10ml容量瓶中，加甲醇5ml超声溶解，稀释至刻度，摇匀，用0.22μm有机滤膜过滤，即得0.4g/L的纽莫康定B0纯品溶液。
纽莫康定杂质h纯品与纽莫康定B0纯品混合溶液的配置：各取适量上述配置的纽莫康定杂质h纯品溶液、纽莫康定B0纯品溶液，混匀。
将上述3种样品分别进行HPLC检测，即得图2纽莫康定杂质h纯品的HPLC分析图谱、图3纽莫康定B0纯品的HPLC分析图谱、图4纽莫康定杂质h纯品与纽莫康定B0纯品同时进样的HPLC分析图谱，图4中标号1为纽莫康定杂质h，标号2为纽莫康定。

Claims (9)

1.一种纽莫康定杂质，其特征在于，具有如式h所示结构：
Figure FDA0003249821760000011
2.一种制备如权利要求1所述的纽莫康定杂质的方法，其特征在于，包括以下步骤：将含有纽莫康定杂质h的粗品用醇溶剂溶解，反相制备柱上样，以纯化水为流动相A、以极性溶剂为流动相B进行梯度洗脱，收集目标成分流出液，收集液经减压浓缩、冻干得纽莫康定杂质h。
3.如权利要求2所述制备方法，其特征在于，所述的醇溶剂选自甲醇或乙醇。
4.如权利要求2所述制备方法，其特征在于，所述的极性溶剂选自乙腈、丙酮、甲醇中的一种，优选为乙腈。
5.如权利要求2所述制备方法，其特征在于，所述的含有纽莫康定杂质h的粗品与醇溶剂的质量体积比为1:2.0～4.0，其中质量以g计，体积以mL计。
6.如权利要求2所述制备方法，其特征在于，所述的洗脱梯度为：
时间min 流速ml/min A％ B％ 0 40 55.0-65.0 35.0-45.0 5 40 55.0-65.0 35.0-45.0 6 40 35.0-45.0 55.0-65.0 7 40 35.0-45.0 55.0-65.0 8 40 55.0-65.0 35.0-45.0 65 40 55.0-65.0 35.0-45.0 70 70 7.0-15.0 85.0-93.0 100 70 7.0-15.0 85.0-93.0 101 40 55.0-65.0 35.0-45.0 130 40 55.0-65.0 35.0-45.0
其中，流动相A为纯化水，流动相B选自乙腈、丙酮、甲醇中的一种。
7.如权利要求2所述制备方法，其特征在于，所述的洗脱梯度为：
时间min 流速ml/min A％ B％ 0 40 55.0-65.0 35.0-45.0 5 40 55.0-65.0 35.0-45.0 6 40 35.0-45.0 55.0-65.0 7 40 35.0-45.0 55.0-65.0 8 40 55.0-65.0 35.0-45.0 65 40 55.0-65.0 35.0-45.0 70 70 7.0-15.0 85.0-93.0 100 70 7.0-15.0 85.0-93.0 101 40 55.0-65.0 35.0-45.0 130 40 55.0-65.0 35.0-45.0
其中，流动相A为纯化水，流动相B为乙腈。
8.一种权利要求1所述纽莫康定杂质用于控制纽莫康定质量中的用途。
9.如权利要求8中所述的用途，其特征在于，包括以下过程：
(1)提供一种纽莫康定杂质h化合物作为参照样品；
(2)提供一种纽莫康定B0样品；
(3)提供一种含纽莫康定B0和纽莫康定杂质h化合物的样品；
(4)用HPLC分析检测法测定(1)中纽莫康定杂质h化合物参照样品、(2)中纽莫康定B0样品、(3)中含纽莫康定B0和纽莫康定杂质h化合物的样品。
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