KR100260963B1 - 탁산 링구조를 갖는 화합물의 검출, 검정 및 분리방법 - Google Patents
탁산 링구조를 갖는 화합물의 검출, 검정 및 분리방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 소의 혈청으로 컨쥬게이트된 숙시닐-데아세틸바카틴 III (DAB) 및 숙시닐-탁솔로 미리 면역화시킨 암탉의 계란으로부터 제조한 폴리클론 IgY 항체를 사용하여 탁솔 및 10-데아세틸바카틴 III (DAB) 및 이들의 유사물을 식물성이거나 또는 생물공학적인 혹종의 공급원으로 부터 분리시키고 측정하는 방법에 관한다. 이 항체는 식물성 추출물 또는 세포 또는 미생물 배지로부터 얻어진 상기 탁산의 선별 분리용 매트릭스상에 고정시킨다.
Description
[발명의 명칭]
탁산 링구조를 갖는 화합물의 검출, 검정 및 분리방법
[발명의 상세한 설명]
본 발명은 탁산 링구조를 갖는 화합물, 특히 탁사놀 및 10-데아세틸바카틴 III 의 검출, 검정 및 분리방법에 관한다.
[발명의 배경]
탁솔은 서부주목 탁수스 브레비폴리아(Taxus brevifolia)의 수피에서 추출가능한 복할 디터펜 슈도알카노이드이며 상위한 난치성의 단단한 종양에 대해서 항암 활성을 나타낸다고 보고되었다(Chabner, B. A. Principles and Practice of Oncology 5 (1991) 1). 탁솔에 대한 수요는 증대되고 있지만, 물질의 희귀함(수피내 농도는 약 0.01%에 불과하다)과 정제시에 따르는 많은 어려움 때문에 약품의 이용도는 불행히도 제한되어 있다. 현재 Taxus sp. 의 공급량은 전이난소암 및 유방암을 앓고 있는 환자들을 치료할 충분한 약품을 제공하기에는 불충분하다.
따라서, 약품내에 탁솔이 사용될 가능성은 재생가능한 공급원으로부터 이를 얻기 위하여 개발된 방법들에 달려있다(Appendino, G. Fitoterapia L (vol. XIV Suppl.) (1993) 5). 현재로서 수피수집외의 실제적 대안은 단지 탁솔을 반합성하는 방법이다. 어떤 절차는 주목의 침엽으로부터 10-데아세틸바카틴 III (DAB) (탁솔로 전환가능하며 단지 C-13 위치에 페닐이소세린 사슬과 C-10 위치에 아세틸 그룹을 갖지 않는다는 점에서 탁솔과 다른 화합물)를 분리시키는 방법에 근거하고 있다. 상위한 Taxus 종의 잎에 존재하는 DAB 함량은 매우 가변적이지만 일반적으로 태평양 연안의 주목 수피내의 탁솔함량보다는 훨씬 더 높다(최대 10 배) (Fitoterapia 상기 참조).
탁솔 및 10-데아세틸바카틴 III 는 다음과 같이 각각 구조식 (1) 및 (2) 를 갖는다.
집합적으로 탁산이라 공지된 이러한 화합물, 이의 유도체 및 관련 화합물은 Taxus속에 속하는 식물로부터 얻을 수 있으며 항암활성을 지닌 물질이다.
DAB를 탁솔로 전환시키는 몇몇 절차들이 보고되었었다(예를들면 Holton, R.A., Eur. Pat. Appl. EP 0 400,971 (1990) : Chem. Abstr. 114, 164568q (1990) 및 Ojima, 1. Habus, 1. Zhao, M., Zucco, M., Hook Park, Y., Ming Sun, C., Brigaud, T., Tetrahedron 48 (1992) 6985 를 참조하시오). 더우기 DAB 는 여러 아미노산 유도체로 C-13 위치의 하이드록실 그룹을 에스테르화시켜 개질시킬 수 있다. 이러한 형태의 접근 방법은 역시 강한 항암 활성을 나타내는 소위 “탁소테르(Taxoter)”, 즉 탁솔의 반합성 유사물의 제조를 유도해냈다(Gueritte-Voelgelein, F. Guenard, D. Lavelle, F. Le Gott, M-T. L. Potier, P. J. Med Chem 34(1991) 992). 유용한 탁솔 전구체(즉, 10-데아세틸바카틴 III, 및 바카틴 III)를 고함량 함유한 주목 변종들을 선별해낼 수만 있다면 반합성 방법은 상당히 개선되었을 것이다. 그러나, 탁솔 및 이의 잠재적 전구체의 복합체 화학 구조면으로 볼때 화학적 및 물리-화학적 분석 방법은 비능률적이기 쉽다.
식물자원으로부터 얻은 순수형태에서 탁산을 분리시키는 방법에는 최종수율은 그리 높지 않은 복합체 크로마토그래피 분리방법이 포함된다.
면역학적 절차는 조(crude) 식물 추출물내에 복합체 혼합물로서 존재하는 탁산에 대한 힘들고 어려운 크로마토그래피 분석을 가속화시키고 간이화시킬 수 있지만(Fitoterapia, 상기 참조), 탁솔을 함유한 생물학적 샘플의 정량화에 적당한 폴리클론 항체(pAb) 및 모노클론 항체(cAb)가 개발되었음에도 불구하고(Jaziri, M., Diallo, B.M., Vanhalelen, M. H., Vanhalelan-Fastre, R. J., Zhiri, A., Becu, A. C., Homes, J.J. Pharm. Belg. 46 (1991) 93, Grothaus, P.G., Raybould, T.J.G.. Bignami, G.S, ; Lazo, C.B. ; Byrnes, J.B.J. Immunol Methods 158(1993) 5 및 Leu, J-C., Chen, B-X., Schiff, P.B., Erlanger, B.F., Cancer Research, 53 (1993) 1388), 탁솔 전구체를 효과적으로 분석하려는 요구를 실제로 만족시켜주는 것은 없다.
또한, 식물 또는 세포 또는 미생물 배지내, 특히 비균질 복합체 혼합물내에 매우 소량 존재하는 물질을 추출하기 위하여 면역학적 절차를 산업적 규모로 적용할 수 있다면 어려운 크로마토그래피 분리방법을 가속화 및 간이화할 수 있는 이점이 생긴다.
포유류로부터 분리시킨 안티탁솔 및 안티바카틴 항체의 제조방법은 문헌에 보고되어 있다(Yanwen Guo등, Biol. Chem. Hoppe Seyler, 375, 281 : 1994). 그러나, 이러한 항체는 생산단가가 높아서 대체물, 즉 저렴한 항체 공급원을 발견해야할 필요가 있다. 대체물 및 적당한 특이항체의 우수한 공급원을 제공하면서 부가적으로 탁솔 및 이의 전구체 분리 절차에 유용한 결합제에 대한 필요성을 만족시켜야 할 것이다.
이제, 조류의 IgY 항체(예를들면 계란 노란자로 부터 얻은 닭의 항체)가 탁산 링구조를 갖는 화합물(예를들면 DAB 유사 탁산)의 링 시스템과 특별히 상호작용할 수 있음이 밝혀졌다. 이러한 항체는 태평양 연안 또는 유럽산 주목의 대체물로서 탁솔 전구체의 새로운 공급원의 조사 및 선별용 시약으로, 이러한 화합물의 분석 방법 및 분리 절차 개발에 유용하다.
따라서, 탁솔 및 10 -데아세틸바카틴 III의 적당한 면역성 컨쥬게이트로 조류 암컷(예를들면 암탉)을 면역시킴으로써, 혹종의 동물로부터 실질적으로 무제한적인 양으로 채혈할 필요없이 상기 물질에 특이한 폴리클론 항체를 간편하게 제조할 수 있다. 이러한 항체를 제조하여 이를 실제로 면역시킨 조류암컷 알의 노란자에 1년동안 계속 축적시키면 산업적 생산단가 면에서 상당한 이득을 얻게된다. 이러한 항체는 취급단계에서 또 매트릭스에 고정시킨 경우 비교적 고농도의 유기 용매를 사용해도 견딜 수 있기 때문에 (이는 항체 활성에 영향을 미칠 수 있는 방부제를 가하지 않고도 매질이 오랫동안 무균 상태를 유지할 수 있다는 의미임) 생물학적 물질로부터 용이하게 분리시킬 수 있음은 산업적 규모로볼때 또다른 장점이다. 이 특성은 또한 최종적으로 정제되기전 및/또는 여러용도로 사용되기전에 조 항체를 오랫동안 저장 및 안전하게 수집가능함을 의미한다.
면역에 필요한 항원의 양은 포유류에서 항체제조에 통용되는 양보다 굉장히 작다(때때로 단지 1/10).
본 발명에 따라 제조된 항체는 예를들면 10-데아세틸바카틴 III 의 탄소구조를 갖는 화합물과 특별히 상호작용할 수 있는 능력을 갖는다. 따라서 10-데아세틸바카틴 III과 탁솔을 구별할 수 있게 된다(특정 유도체로 조류암컷을 면역시킴으로써), 이러한 기술로 유리하게 분리가능한 화합물로는 10-데아세틸바카틴 III, 바카틴 III 및 14-하이드록시-10-데아세틸바카틴이 있다.
상기 기술은 통상 의도한 주생성물의 불순물을 구성하는 세팔로만닌 및 7-에피탁솔과 같이 상기와 다른 탁산특이 항체를 생성시킬 수 있다. 따라서, 본 발명은 두개의 주목적(즉, 상기 화합물의 면역 진단적 방법에 의한 분석학적 측정 및 여러 기질들로부터 이들의 정량적 분리)을 갖는다.
조류암컷(예를들어 암탉)으로부터 얻은 본 발명의 목적인 항체는 제조 및 추출공정시 사용된 통상의 용매에 대해 내성을 지님으로 특히 수성 및 비수성 식물성 추출물상에 사용할때 포유류로부터 얻어진 유사제품들과 비교하여 놀랍게도 유리한 안정특성을 가졌음이 입증되었다 ; 또한 이러한 항체는 항원 용해를 완료시킬 수 있을 정도까지의 농도를 갖는 유기용매(에탄올과 같이 물과 혼화가능한 알콜 및 아세톤)와 물의 혼합물내에 용해 가능하다는 이점을 갖는다.
따라서, 본 발명의 제1의 양상에 있어서 본 발명은 탁산링 구조로 구성되는 항원에 대한 항체 특이성을 갖는 IgY군의 항체를 제공한다.
본 발명은 조류암컷에 상기 항원을 대항(challenge)시키는 단계 및 후에 산출한 알에서 IgY 항체를 분리시키는 단계로 구성되는 상기에서 정의한 바와같은 항체 제조 방법을 제공한다.
탁산링 구조는 다음의 C-20 삼환식 구조에 근거한다(단지 탄소원자들만 나타냈고 입체화학적으로 표시하지는 않았음).
대표적인 화합물들의 구조식은 다음과 같다 :
본 발명에 따라 제조된 IgY 항체는 탁산링 구조를 포함하는 화합물의 검출 및/또는 분석용 분석시약으로, 또 탁산링 구조를 포함하는 화합물의 분리 또는 정제에 사용되는 제조시약으로 유용하다. 특히, DAB유사 탁산의 디터펜링에 대한 이들의 선별성 면에서 볼때 본 발명의 IgY는 탁솔전구체의 새로운 공급원이 발견될 수 있도록 다수 식물들의 면역학적 스크린용으로 사용할 수 있다.
따라서, 본 발명의 제2의 양상에 있어서, 본 발명은 상기 탁산을 함유하는 혼합물을 상기 탁산 특이 폴리클론 항체와 접촉시키는 단계, 연속적으로 탁산 항체 복합체를 분리시키는 단계 및 탁산을 회수하는 단계로 구성되고, 상기 폴리클론 항체가 IgY 항체, 특히 계란에서 얻어진 것을 특징으로하는 탁산의 정제방법을 제공한다.
폴리클론 항체 자체와 이들의 제조에 이용한 공정은 상술한 방법과 마찬가지로 본 발명의 영역에 속한다.
본 발명은 또한 혼합물 또는 생물학적 유체내의 탁산을 분석하는(즉 그 존재를 검출 또는 측정하는)분석학적 기준으로 이용할 수 있는 공정을 제공한다. 따라서, 본 발명의 제3의 양상에 있어서 본 발명은 상기한 바와같은 폴리클론 항체를 사용하는 것을 특징으로하는 혼합물 또는 생물학적 유체내 탁산 측정방법을 제공한다.
특히, 본 발명의 제4의 양상에 있어서, 본 발명은 상기한 폴리클론 항체로 생물학적 유체 또는 배지의 샘플(구체적으로 혈액)을 처리하는 단계 및 연속적으로 면역진단학적 방법으로 탁산을 측정하는 단계로 구성되는 상기 샘플내의 탁산 측정 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 IgY 항체 제조방법은 다음에서 보다 상세히 설명될 것이다.
실제적으로는, 탁솔, 10 -데아세틸바카틴 III 또는 이들의 유사물 중 하나와 같은 적당한 탁산 유도체는 4-디메틸아미노피리딘 존재하에 피리딘내 숙신산 무수물과 상기 화합물을 반응시킨 다음 실리카겔 칼럼상에서 숙시닐-탁산물 크로마토그래피 시키거나 이와 동등한 방법으로 분리시켜 제조한다. 따라서, 이렇게 얻어진 숙시닐-탁산은 이를 DMSO 내에 용해시킨다음 생리식염수내 N-(3- 디메틸아미노프로필)-N-에틸카보디이미드하이드로클로라이드 용액에 가함으로써 문헌에 공지된 방법에 의해 컨쥬게이트될 것이다(B.F. Erlanger, Methods in Enzymol. 70, Van Vdnakis (eds) Academic Press, 1980). 이렇게 형성된 유도체를 다시 생리식염수내에서 24시간 동안 소의 혈청 알부민과 반응시킨다음 증류수에 대하여 투석시킬 것이다.
Freund 보조제를 사용하여 신체의 여러부분에 피하주사시켜 소의 혈청 알부민과 함께 10-데아세틸바라틴 III 또는 탁솔 및/또는 탁산의 컨쥬게이트 총 0.5 mg을 선별한 조류 암컷(예를들면 알낳는 암탉)에 상기 컨쥬게이트를 투여하며 ; 효능 촉진제는 0.25 mg의 컨쥬게이트를 사용한 첫번째 달에 짧은 간격으로 사용한다. 알의 노른자를 흰자로부터 분리시켜 문헌에 공지된 절차에 따라 0.1M의 NaCl 을 함유한 pH 7.5의 포스페이트 버퍼내에서 파괴시킨다(Poison등, Immunol. Comm., 9, 475, 1980). 격렬하게 교반시킨 다음, 농도가 3% 될때까지 PEG(폴리에틸렌 글리콜)를 고체형태의 상기 현탁물에 가하고 전체를 원심분리시켜 얻어진 침전물을 페기시킨후 농도가 12% 될때까지 추가량의 PEG를 상징액에 가하고 원심분리시켜 침전물을 수거하고 EDTA를 함유한 pH 7.9 의 트리스 버퍼에 재용해시킨다. N-(3-디메틸아미노프로필)-N-에틸카보디이미드 하이드로클로라이드 존재하에 성분들의 반응이 일어나도록 정치시킨 다음 혈청 알부민 및 탁산 유도체와 결합하는 활성화된 세파토스 칼럼을 사용하여 상기 항체를 정제시킨다.
수지의 미반응 그룹은 아세트산으로 포화시킨다. 이렇게 얻어진 수지는 pH 4.5 의 아세데이트 버퍼(0.1 M), 0.5M의 Nacl 을 함유한 pH 8.3 의 비카보네이트(0.1M) 로 계속 세척한다. 이제, 일단 흡수되면 pH 2.5 의 글리신 하이드로클로라이드 용액(0.2M)으로 랄럼을 세척시켜 재용리시킬 수 있는 항체 정제용으로 상기 수지를 사용할 수 있다.
면역 친화성 크로마토그래피는 이제 수많은 항원 정제용으로 널리 공지된 기술이다. 이 기술은 면역글로블린과 특이항원(당해의 경우, 탁솔 또는 10-데아세틸바카틴 III 또는 이들의 유사물증 하나와 같은 탁산) 간 상호작용을 이용한다. 그러므로, 본 발명 영역을 제한하는 것은 아니지만, Affi-prep Hz 하이드라지드(Biorad)와 같은 파생된 매타크릴산 구조의 수지 또는 Avidchroms 과 같은 하이드라진 그룹을 또다시 함유하는 수지칼럼은 항체를 고정시키는 지지 매트리스로 사용된다. 이러한 수지는 면역글로블린의 산화된 카보하이드레이트와 함께 하이드라존과 같은 안정한 결정을 형성할 수 있는 능력을 갖는다. 이 면역 글로블린은 기타 공급원에서 얻은 항체와 비교할때 산화가능한 카보하이드레이트내에 특히 풍부하다.
대응하는 항원을 고착시킨다음 매트릭스상에 고정된 항체는 문헌에 기술된 통상의 절차로 처리하여 항원을 회수하고 칼럼을 재생시킨다. 예를들면 글리신/HCl 과 같은 pH 2.5 의 버퍼를 함유하는 수성 지방족 알콜 또는 수성 디옥산 용액은 항원 회수용으로 통용된다. 친화성 크로마토그래피용 매트리스 공급자에 의해 통상 추천되는 다른 기술들 또한 이용가능하다.
분석학적 양상에 관련되어 있기만 하다면, 상술한 방법은 1-100 mg의 상기한 생성물을 함유한 약물(바람직한 경우 탁솔)을 투여한 다음 식물성 추출물내의, 배지내의 및 플라스마내의 항원의 양을 측정하는데 이용할 수 있다.
다른 구체예에서, 본 발명에 따른 방법은 예를들면 경쟁적 억제 효소 면역 검정방법(CIEIA)과 같은 다른 면역진단 방법에 의해 수행될 수 있다.
산업적 제조라는 양상에 관련되어 있기만 하다면, 본 발명의 주제인 탁산은 예를들면 물로 최대 50%, 바람직하게는 약 40%까지 희석시킨 에탄올 또는 메탄올로 식물성 생물자원을 추출시켜 얻은 수성 알콜 추출물에 의해 바로 “포획” 될 수 있다. 이러한 용매는 Taxus 속 식물의 기부내에 특히 고농도로 존재하는 클로로필 및 기타 안료와 같은 목적하지 않는 물질들은 추출하지 않으면서 탁산은 전부 추출해내는 이점이 있다.
단지 간단히 여과시키는 것외에 더이상의 정제 공정을 수행할 필요없이 상기 추출물은 특히 면역친화성 칼럼을 통하여 크로마토그래피시킬 수 있다. 본 발명에 따라 제조한 항체는 용매 및 pH 작동 조건에 대한 내성이 매우 높기 때문에, 상기 칼럼은 최소한 100회 연속 순환용으로 사용할 수 있다. 유사절차로 의도한 항체를 얻게되는 상기 방법으로 탁솔 및 10-데아세틸바카틴 III 뿐 아니라 종양학적으로 주요한 기타의 탁산을 제조할 수 있다.
이러한 의미에서 본 방법은 또한 실리카겔 칼럼 또는 산업용 고압 역상 칼럼과 같은 통상의 크로마토그래피 절차에 의해 분리시키기 어려운 탁산 불순물을 제거하는데 특히 유용하며 ; 특이성이 높다는 관점에서 볼때 면역친화성 크로마토그래피는 7-에피-탁솔 또는 세팔로만닌과 같은 이성질체로부터 탁솔을 분리시킨 수 있게 하며 ; 또한 10-데아세틸바카틴 III 및 14-하이드록시바카틴을 분리시키는데 이용할 수 있다.
자연히 본 발명은 식물종내에 극히 소량 존재하는 상기 언급한 화합물을 순수 상태로 얻는데 사용할 수 있다.
산업용으로 통용되는 Taxus 속에 속하는 종으로는 탁수스 바카나(Taxus baccara), 탁수스 브레비폴리아(T. brevifolia), 탁수스 왈리치아나(T. wallichiana), 탁수스 히크시(T. hicksi), 탁수스 카나덴시스(T. canadensis), 탁수스 히아마넨시스(T. hiamanensis), 탁수스 피라미달리스 (T. piramidalis) 및 재배변종이 있다.
우리는 본 발명을 보다 상세히 예시해주는 여러 실시예들을 다음에 나타내었다.
실시예 1-Taxus baccata의 추출물로부터 탁솔을 분리시키는데 유용한 안티 탁솔 폴리클론 항체로 활성화시킨 매트릭스 제조.
[항원 제조]
0.067 mmol 의 4-디메틸아미노피리딘 존재하에 0.9 mmol 의 탁솔 및 벤질 알콜을 피리딘내 1.4 mmol 의 숙신산 무수물로 반응시켰다. 이 반응물 전체를 주위온도에서 7시간동안 정치시켰다. 이 반응 혼합물을 저온 진공하에 농축시켜 건조시키고 용리제로서 85 : 15 의 CHCl3및 메탄올 혼합물을 사용하여 실리카 겔상에서 크로마토그래피시켜 숙시닐 탁솔을 분리시켰다(수율 70 %). 분광분석 데이타에 따르면 상기 유도체는 2′-숙시닐-탁솔이었다.
[소의 혈청 알부민과 항원의 컨쥬게이션]
교반하면서 30 mg의 2′-숙시닐 탁솔을 0.9 % NaCl 내 1-에틸-3-(디메틸아미노프로피오닐) 카보디이미드 용액에 가하였다. 이 혼합물을 24시간 동안 주위 온도에서 반응이 일어나도록 정치시킨다음 추가로 24시간동안 생리식염수내에서 120 mg의 소의 혈청 알부민과 반응시켰다. 이 반응 혼합물을 증류수에 대하여 추가로 36시간동안 투석시켜 시약들을 제거시켰다.
[항체 정제용 기질 제조]
50 mg 의 소의 혈청 할부민을 CNBr로 활성화시킨 세파로스로 반응시킨 다음 이 반응물 전체를 pH 5-6, 100 mg 의 N′-(3-디메틸아미노프로필)-N-에틸카보디이미드하이드로클로라이드 존재하에 12시간 동안 상기에서 제조한 2′-숙시닐-탁솔로 반응시켰다.
수지상의 과량의 미반응 그룹을 아세트산으로 포화시키고 ; 이 수지를 0.1M의 아세테이트 버퍼(pH 4.5) 로, 그 다음에 0.5 M의 NaCl 을 함유하는 0.1M의 NaHCO3로 세척하였다. 이 수지를 면역 친화성 분리용으로 사용하는 경우 이를 0.2M 글리신/HCl 버퍼(pH 2.5) 세척시킨다.
[암탉 면역 및 항체 제조]
프로인트(Freund) 보조제를 사용하여 소의 혈청 알부민과 함께 총량이 0.5 mg인 각각의 탁솔 컨쥬게이트를 10마리의 산란기 암탉들의 몇몇 신체 부위에 피하주사 하였다 ; 이 절차를 5일 및 21일 후 반복하였다. 계란 수거는 30일 부터 시작하였다. 60개의 계란을 깨뜨려 흰자에서 노른자를 분리시키고 흰자는 폐기시켰다. 노른자는 0.1M 의 NaCl 을 함유하는 2부피의 0.01M포스페이트 버퍼(pH 7.5) 내에서 균질화시켰다. 격렬하게 교반시키면서, PEG 600 을 가하여 농도를 3%(w/v)로 만들었다 ; 이 현탁물을 13000 g 에서 20분 동안 원심분리시켰더니 상징액의 농도가 12% 였다. 이 현탁물을 원심분리시키고 항체를 함유한 고형분을 수거하였다. 이 침전물을 안정제로서 NaN3및 EDTA를 함유한 50 mM의 Tris 버퍼내에 재용해시켰다. 이 용액을 항원을 함유한 상기 수지상에 통과시켜 항체를 정제시켰다. 이 항체는 사용시에 0.2M의 글리신/HCl 버퍼(pH 2.5)로 재용리시킨다.
[매트릭스상에의 안티탁솔 폴리클론 항체의 고정화]
0.05M의 소듐 아세테이트(pH 5)로 평형에 도달된 하이드라지드 그룹과 함께 Avid-크롬 칼럼을 약 1시간 동안 항체 용액과 매트릭스가 반응하도록 정치시킴으로써 소듐 퍼아이오데이트로 미리 산화시킨 항체용액으로 처리시켰다(상기한 바와같이 정제시킨 30 mg 의 항체를 30 ml 의 0.05M소듐 아세테이트에 용해시키고 10 mM 의 소듐 퍼아이오데이트로 산화시킴). 상기 칼럼을 말기에 0.02 M 의 포스페이트 버퍼(pH 7.4)로 세척하여 과량의 미반응 항체를 제거시켰다.
[탁수스 바카타(Taxus baccata)의 추출물로 부터 탁솔 분리]
100 g 의 잘게 썬 탁수스 바카타(Taxus baccata) 잎을 35% 의 수성에탄올로 탁솔(대략 2ℓ의 용매) 내에서 철저히 추출시켰다. 이 추출물을 여과시킨다음 상기에서 제조한 20 ml 의 Avid-크롬 칼럼을 통과시켰다. 이 칼럼에서 12.6 mg 의 탁솔이 고정되었는데 이 양은 앞서 HPLC로 일에서 측정한 값이었다. 이 탁솔을 1 : 1 의 글리신/HCl 버퍼(pH 2.5) 를 함유하는 물 및 디옥산 혼합물로 세척시켜 칼럼에서 제거시켰다. 이 탁솔을 메틸렌 클로라이드를 사용하여 칼럼 용출액으로 부터 추출하고 알콜로부터 결정화시켰다. 얻어진 탁솔의 순도는 99% 이상이었다.
실시예 II-탁수스 바카타(Taxus baccata) 추출물로부터 10-데아세틸바카틴 분리에 유용한 안티-10-데아세틸바카틴 III 폴리클론 항체를 함유한 활성화된 매트릭스 제조
다음과 같은 상위 항원을 사용하는 것외엔 실시예 1 에서 기술한 것과 같은 도식 및 방법으로 특이 항체 및 면역친화성 칼럼을 제조하였다.
[10-숙시닐-10-데아세틸바카틴 III 제조]
0.067 mmol 의 4-디메틸아미노피리딘 존재하에 0.9 mmol 의 10-데아세틸바카틴 III 를 피리딘내 1.4 mmol 의 숙신산 무수물과 반응시켰다. 이 반응을 전체를 7시간동안 주위온도에서 정치시켰다. 이 반응 혼합물을 저온 진공하에 농축시켜 건조시킨 다음 용리제로서 7 : 3 의 CHCl3/이소프로판을 혼합물을 사용하여 실리카겔상에서 크로마토그래피시켜 10-데아세틸바카틴 III 의 숙시닐 유도체를 분리시켰다. 분광 분석 데이타에 따르면 그 유도체는 10-숙시닐-바카틴 III 이었다.
[탁수스 왈리치아나(Taxus wallichiana) 추출물로부터 10-데아세틸바카틴 III 분리]
100 g 의 잘게썬 탁수스 왈리치아나(Taxus wallichiana) 잎을 45% 의 수성 에탄올로 탁산(대략 2.8ℓ의 용매)내에서 철저히 추출시켰다. 초기 부피의 2/3 까지 농축시켜 여과시킨다음, 이 추출물을 탁솔용으로 상기와 같이 제조한 60 ml의 Avid-크롬 칼럼을 통과시켰다. 이 칼럼에서 30.5 mg의 10-데아세틸바카틴 III 가 고정되었는데 이양은 앞서 HPLC로 잎에서 측정한 값이었다. 이 10-데아세틸바카틴 III 를 2 : 1 의 디옥산 : 글리신/MCl 버퍼(pH 2.5) 를 함유하는 물 혼합물로 세척하여 칼럼에서 제거시켰다. 이 디터펜을 물로 희석시킨다음 메틸렌 클로라이드를 사용하여 칼럼 용출액으로부터 추출시키고 메탄올로부터 결정화시켰다.
이렇게 얻어진 10-데아세틸바카틴 III 의 순도는 99% 이상이었다.
[실시예 III-경쟁적 억제효소 면역검정 방법(CIEIA)에 의한 사람 혈청의 10-데아세틸바카틴 III 함량 측정]
30 mg 의 10-데아세틸바카틴 III-BSA 컨쥬게이트를 제조하여 마이크로타이트레이션 플레이트 벽에 고착시켰다. CIEIA 테스트용으로 일련의 10-데아세틸바카틴 III 항원의 희석물(0.1 mg/ml -10㎍/ml)을 동일한 버퍼로 1 : 50 희석시킨 혈청 및 PBS-T 양쪽 모두에 함유된 항체인 α-10- 데아세틸바카틴 III IgY(2.3 ㎍/ml) 와 혼합시켰다. 예온시킨다음, 100㎕의 상기 용액을 벽에 고착시킨 항원과 경쟁하도록 37℃ 에서 1 시간 동안 보온시켰다. 이러한 조건하에서 PBS-T 내에서 0.7 mg 의 IC50 을 만드는 경쟁 항원의 양은 1 : 50 으로 희석시킨 혈청의 존재하에서 동일하였다.
Claims (23)
- 탁산링 구조를 포함하는 항원에 대한 항체 특이성을 갖는 IgY군 항체.
- 제1항에 있어서, 항원이 하나의 다음과 같은 구조식을 갖는 항체.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 항원이 탁솔 또는 탁솔 전구체인 항체.
- 제3항에 있어서, 항원이 10 -데아세틸바카틴 III 인 항체.
- 제1항에 있어서, 항체가 집에서 기르는 암탉의 IgY인 항체.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 항원으로 조류암컷을 자극시키는 단계 및 이후에 산출된 알로부터 IgY 항체를 분리시키는 단계로 구성되는, 제1 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 항체의 제조방법.
- 제1항 내지 제5항중 어느 한 항에 따른 항체로 이루어진, 탁산링 구조를 포함하는 화합물의 검출 및/또는 검정용 분석 시약.
- 제1항 내지 제5항중 어느 한 항에 따른 항체로 이루어진, 탁산링 구조를 포함하는 화합물의 분리 또는 정제용 분리 시약.
- 탁산에 대한 폴리클론 항체로 상기 탁산을 함유한 혼합물을 처리하는 단계, 연속적으로 탁산-항체 복합체를 분리시키는 단계 및 탁산을 회수하는 단계로 구성되며, 상기 폴리클론 항체가 조류 암컷, 특히 암탉에서 얻어진 것을 특징으로하는 탁산 정제방법.
- 제9항에 있어서, 상기 폴리클론 항체를 면역친화성 크로마토그래피용 크로마토그래피 지지체상에 고정시키는 방법.
- 제9항에 있어서, 상기 크로마토그래피 지지체가 하이드라진 그룹으로 유도체 합성된 메타크릴산 구조를 갖는 수지인 것을 특징으로하는 방법.
- 제11항에 있어서, 디옥산의 수성 혼합물 또는 pH 2.5까지 완충시킨 지방족 알콜로 상기 지지체를 용리시키는 것을 특징으로하는 방법.
- 제12항에 있어서, 용리제가 글리신/HCl로 완충시킨 물 및 디옥산의 혼합물인 것을 특징으로하는 방법.
- 제9항에 있어서, 상기 혼합물이 탁수스 바카타(Taxus baccata), 탁수스 브레비폴리아(T. brevifolia), 탁수스 왈리치아나(T. wallichiana), 탁수스 히크시(T. hicksi), 탁수스 카나덴시스(T. canadensis), 탁수스 히아마넨시스(T. hiamanensis), 탁수스 피라미달리스(T. piramidalis)로 구성되는 그룹에서 선택된 Taxus 속에 속하는 종으로 부터 얻어진 추출물인 것을 특징으로하는 방법.
- 제9항에 있어서, 분리된 탁산이 탁솔, 10 -데아세틸바카틴 III, 14 -하이드록시-10 -데아세틸바카틴 III, 바카틴 III, 세팔로만닌, 19 -하이드록시-10-데아세틸바카틴 III 및 7-에피탁솔로 이루어지는 그룹에서 선택되는 것을 특징으로하는 방법.
- 제9항에 있어서, 분리된 탁산이 탁솔이고 용리제가 pH 2.5까지 글리신으로 완충시킨 물 및 디옥산의 1 : 1 혼합물인 것을 특징으로하는 방법.
- 제9항에 있어서, 분리된 탁산이 10-데아세틸바카틴 III 이고 용리제가 2 : 1 의 디옥산 : pH 2.5 까지 글리신/HCl 로 완충시킨 물 혼합물인 것을 특징으로하는 방법.
- (a) 암탉을 숙시닐-탁산-알부민 컨쥬게이트로 면역화시키는 단계 ; (b) 상기 암탉이 낳은 계란 노란자로부터 안티탁산 폴리클론 항체를 분리시키는 단계로 구성되는 계란노란자로 부터의 안티탁산폴리클론 항체의 제조방법.
- 제18항에 있어서, 상기 숙시닐 -탁산이 숙시닐 탁솔이고 상기 알부민이 소의 혈청 알부민인 것을 특징으로하는 방법.
- 제18항에 있어서, 상기 숙시닐 -탁산이 숙시닐-10 -데아세틸바카틴 III 이고 상기 알부민이 소의 혈청 알부민인 것을 특징으로하는 방법.
- 제18항 내지 제20항의 방법으로 얻을 수 있는 폴리클론 항체.
- 제21항에 따른 항체로 구성된, 혼합물 및 생물학적 유체내의 탁산의 분리 및 측정시약.
- 제22항에 있어서, 상기의 측정이 면역친화성 크로마토그래피 또는 경쟁적 억제효소 면역검정 방법(CIEIA)을 사용하여 수행되는 것을 특징으로하는 시약.
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