CN107686489B - 一种高纯度莫西菌素的分离纯化法 - Google Patents
一种高纯度莫西菌素的分离纯化法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种高纯度莫西菌素的分离纯化法，将链霉素发酵产生的发酵液经固液分离，浸取后得到尼莫克汀浓缩液，经上保护、氧化、脱保护和胺化反应得到莫西菌素甲醇溶液（MX‑4），再经过制备型HPLC层析后，洗脱液经过浓缩、萃取分层、结晶、抽滤干燥得到的莫西菌素成品纯度在98%以上。该方法分离纯度高，使用溶剂量小，操作步骤少，产品收率高，适宜商业化大生产。
Description
技术领域
本发明属于抗生素分离纯化技术领域，尤其是一种高纯度莫西菌素分离纯化方法。
背景技术
莫西菌素(Moxidectin)是一种新型抗寄生虫药，是由链霉菌发酵的单一成分的大环内酯类抗生素，莫西菌素可增大虫体神经突触后膜对Cl-的通透性，从而阻断神经信号的传递，最终使神经麻痹而导致虫体死亡。莫西菌素是通过两种不同的途径来增强神经膜对Cl-通透性的，其一是通过增强虫体外周神经抑制递质r-氨基丁酸(GABA)的释放；另一途径是引起由谷氨酸控制的Cl-通道开放。与其他大环内酯类抗寄生虫药的不同之处在于其成分单一，它在动物表皮和真皮中的药物浓度是皮下组织中的6倍，在动物胃肠道组织内的药物浓度明显高于肠腔中的浓度，因此有着更高的驱虫活性和长效、安全等特性，尤其对线虫(成虫和幼虫)和节肢动物，在极低的剂量下就有很好的抗虫活性。
莫西菌素是通过链霉素发酵产生产生的尼莫克汀(Nemadectin),再通过化学合成得到。美国专利US4916154A提供了一种制备莫西菌素的方法，即将发酵液经过固液分离，浸取后得到尼莫克汀溶液通过萃取，硅胶柱层析，凝胶层析得到纯度90％以上(HPLC)的尼莫克汀，然后通过上保护、氧化、脱保护、肟化反应得到莫西菌素，再经硅胶层析得到高纯度的莫西菌素。该方法能得到纯度为90％以上的莫西菌素，但工艺异常复杂，需要多次层析操作，溶剂用量很大，收率低，成本高。中国专利CN 101372492A提供一种制备高纯度莫西克汀的方法，即将预提纯的尼莫克汀溶液经过大孔吸附树脂层析，洗脱液通过二氯甲烷萃取浓缩，通过上保护反应，将上保护液通过大孔吸附树脂层析，洗脱液经过氧化、脱保护和肟化反应得到莫西克汀反应液，再经过大孔吸附树脂层析，得到纯度为93％以上的莫西克汀溶液。该方法同样需要多步层析，溶剂使用量大，操作繁琐，收率较低。
随着现代社会的进步以及人们对药品纯度要求越来越高，更高纯度的水平能够将药物制剂制成适当的剂型从而用于动物和人类。而具有更高纯度的莫西菌素可安全的用于多种多样的药物应用。因此，通过合适的方法制备出更高纯度的莫西菌素原料具有重要的现实意义。
发明内容
本发明提供了一种高纯度莫西菌素的分离纯化法，解决背景技术中提出的分离莫西菌素工艺复杂，需要多次层析操作，溶剂用量大，收率低，成本高等问题。
本发明的技术方案如下：
一种高纯度莫西菌素的分离纯化法，包括以下步骤：
(1)将链霉素发酵产生的发酵液经固液分离，浸取后得到尼莫克汀浓缩液，经上保护、氧化、脱保护和胺化反应得到待处理莫西菌素甲醇溶液(MX-4)，将莫西菌素甲醇溶液(MX-4)抽至反应釜内，加入流动相配成上注液，将上注液加入到制备柱中；
(2)向莫西菌素甲醇溶液中加入甲基丙烯酸甲酯，加热一定时间；
(3)进样：打开系统设备监视器，选择合适的在线过滤器，进行进料，根据单针进样量设定进料时间，并将冲洗出来的溶液排至废液接收罐，其中单针进量为200-250g；
(4)打开系统设备监视器，选择合适的在线过滤器，按吸附量进行上样，用有机溶剂水溶液进行洗脱，检测波长为240nm，当洗脱液主峰上升至平头拐点时，将组分收集阀切至洗脱液主流接收罐内，继续洗脱直至图谱下降至最低呈直线，用流动相平衡树脂后重复进样洗脱，如此重复多次，每罐收集2针主流液，混合均匀后取样检测，将检测合格洗脱液合并在一起；
(5)对检测合格洗脱液进行真空浓缩；
(6)对浓缩液进行丁基磷酸二丁酯萃取，搅拌静止分层；
(7)将步骤(6)分层得到的有机相收集，进行浓缩；
(8)浓缩结束后，往浓缩罐中加入一定量的正庚烷或正己烷结晶；
(9)抽滤干燥得到成品。
优选的，所述步骤(1)中待处理的莫西菌素甲醇溶液含量为10％-20％，纯度≥80.0％；所述流动相溶液为68％-72％甲醇、乙腈、乙醇水溶液中的一种；所述制备柱的色谱填料为ODS-C18，制备柱型号为DAC-100，色谱柱直径为100mm。
优选的，所述步骤(4)中有机溶剂水溶液为90％-95％的甲醇、乙腈、乙醇中的一种或多种。
优选的，所述步骤(5)中洗脱液浓缩罐温度30-60℃，真空度≤-0.09MPa。
优选的，所述步骤(6)中丁基磷酸二丁酯萃取时加入量为20-30kg，搅拌0.5-1.5小时，静置1-2小时。
优选的，所述步骤(7)中有机相收集后，置于超滤膜分离器中进行浓缩。
优选的，所述步骤(8)中往浓缩罐中加入是产品量3～4倍重量的正庚烷或正己烷，搅拌升温至60～65℃溶解至澄清，降温至5～10℃保温结晶2小时以上。
优选的，所述步骤(9)中干燥温度55～65℃，真空≤-0.085MPa，干燥8～12小时。
有益效果：
1.莫西菌素甲醇溶液进行预处理，加入了一定量的甲基丙烯酸甲酯，对莫西菌素形成保护作用，使其在后续的纯化过程中保持良好的生物活性，相比于现有技术最后分离纯化所得的产物，溶解度明显增大，稳定性明显增加，同时去除大部分不溶性颗粒，降低了后续工艺的处理难度。
2.在对有机相进行浓缩时，采用超膜过滤设备，避免了有机相的大分子物质溶出，在保持莫西菌素的活性及构象等方面有明显的技术优势，而且体系黏度低、分相时间短，提高了莫西菌素的提纯效果。
3.萃取时采用了丁基磷酸二丁酯，避免了现有技术中使用二氯甲烷会造成的污染以及会对浓缩液造成的酸化，绿色环保，同时由于P＝O键的偶极矩较大，其萃取能力更好。
4.与现有技术中的方法相比，本方法使用一次层析代替现有技术中的多步层析，大大减少了层析液的使用量，简化了工艺步骤，且获得了纯度更高的莫西菌素成品，成品纯度在98％以上。
5.洗脱莫西菌素甲醇溶液时，可以直观的看到图谱位置，能够精准把握洗脱时间，并且在平衡树脂后重复进行了洗脱，可以将莫西菌素甲醇溶液中的杂质更好的去除掉。
6.本发明的方法稳定可靠，易于适宜商业化大生产，提高经济效益。
附图说明
图1是实施例1层析前的莫西菌素甲醇溶液(MX-4)的液相色谱图及峰表。
图2是实施例1所分离的莫西菌素成品的液相色谱图及峰表。
具体实施方式
以下将结合具体实施例对本发明的技术方案进行详细叙述。
实施例1
将链霉素发酵产生的发酵液经固液分离，浸取后得到尼莫克汀浓缩液，经上保护、氧化、脱保护和胺化反应得到莫西菌素甲醇溶液(MX-4)34.5kg,含量12.3％，纯度80.6％，将上述溶液抽至不锈钢反应釜内，加入MX-4甲醇溶解液折纯量的40±1倍体积的68-72％甲醇/乙腈/乙醇水溶液流动相配成上柱液，取样检测效价21527μg/mL。
取用流动相平衡制备柱(型号为DAC-100色谱填料为ODS-C18)20-25分钟，流速为2L/min。
向莫西菌素甲醇溶液中加入甲基丙烯酸甲酯20kg，加热1h。
进样：打开系统设备监视器，选择合适的在线过滤器，进样方式设定为自动，将进料流速为1.5L/min，根据单针进样量设定进料时间，并将冲洗出来的溶液排至废液接收罐；其中单针进量为200-250g。
洗脱：进样完毕后，改用90-95％的甲醇/乙腈/乙醇水溶液进行洗脱，检测波长240nm。当洗脱液MX主峰上升至平头拐点时，开始收集，继续洗脱至图谱下降至最低呈直线时，停止收集。用流动相平衡树脂后重复进样洗脱，如此重复多次，每罐收集2针主流液，混合均匀后取样检测。将检测合格洗脱液合并在一起进行洗脱液后处理。
洗脱液浓缩：对洗脱合格液进行真空减压浓缩，温度30-60℃，真空度≤-0.09MPa，直至所有洗脱液浓缩至冷凝器下视镜无甲醇流出。
萃取：浓缩结束后往浓缩罐中加入25kg丁基磷酸二丁酯，搅拌0.5小时后静置1小时；分层后收集有机相，将其泵入到超膜过滤器中进行浓缩。
浓缩结束后，往浓缩罐中加入产品量3～4倍重量的正庚烷/正己烷，搅拌升温至60℃溶解至澄清，降温至7℃保温结晶2小时以上。
将结晶液用过滤器过滤，将湿品放入双锥干燥机减压干燥，控制温度55～65℃，真空≤-0.085MPa，8～12小时后出粉。
实施例2
将链霉素发酵产生的发酵液经固液分离，浸取后得到尼莫克汀浓缩液，经上保护、氧化、脱保护和胺化反应(常规反应)得到莫西菌素甲醇溶液(MX-4)31.3kg，含量15.7％，纯度84.7％,将上述溶液抽至不锈钢反应釜内，加入MX-4甲醇溶解液折纯量的40±1倍体积的68-72％甲醇/乙腈/乙醇水溶液流动相配成上柱液，取样检测效价18828μg/mL。
取用流动相平衡制备柱(型号为DAC-100色谱填料为ODS-C18)20-25分钟，流速为2L/min。
向莫西菌素甲醇溶液中加入甲基丙烯酸甲酯21kg，加热1.5h。
进样：打开系统设备监视器，选择合适的在线过滤器，进样方式设定为自动，将进料流速为1.5L/min，根据单针进样量设定进料时间，并将冲洗出来的溶液排至废液接收罐；其中单针进量为200-250g。
洗脱：进样完毕后，改用90-95％的甲醇/乙腈/乙醇水溶液进行洗脱，检测波长240nm。当洗脱液MX主峰上升至平头拐点时，开始收集，继续洗脱至图谱下降至最低呈直线时，停止收集。用流动相平衡树脂后重复进样洗脱，如此重复多次，每罐收集2针主流液，混合均匀后取样检测。将检测合格洗脱液合并在一起进行洗脱液后处理。
洗脱液浓缩：对洗脱合格液进行真空减压浓缩，温度30-60℃，真空度≤-0.09MPa，直至所有洗脱液浓缩至冷凝器下视镜无甲醇流出。
萃取：浓缩结束后往浓缩罐中加入20kg丁基磷酸二丁酯，搅拌0.5小时后静置1小时。分层后收集有机相，将其泵入到超膜过滤器中进行浓缩。
浓缩结束后，往浓缩罐中加入产品量3～4倍重量的正庚烷/正己烷，搅拌升温至65℃溶解至澄清，降温至5℃保温结晶2小时以上。
将结晶液用过滤器过滤，将湿品放入双锥干燥机减压干燥，控制温度55～65℃，真空≤-0.085MPa，8～12小时后出粉。
实施例3
将链霉素发酵产生的发酵液经固液分离，浸取后得到尼莫克汀浓缩液，经上保护、氧化、脱保护和胺化反应(常规反应)得到莫西菌素甲醇溶液(MX-4)28.5kg,含量15.8％，纯度80.8％，将上述溶液抽至不锈钢反应釜内，加入MX-4甲醇溶解液折纯量的40±1倍体积的68-72％甲醇/乙腈/乙醇水溶液流动相配成上柱液，取样检测效价22214μg/mL。
取用流动相平衡制备柱(型号为DAC-100色谱填料为ODS-C18)20-25分钟，流速为2L/min。
向莫西菌素甲醇溶液中加入甲基丙烯酸甲酯22kg，加热2h。
进样：打开系统设备监视器，选择合适的在线过滤器，进样方式设定为自动，将进料流速为1.5L/min，根据单针进样量设定进料时间，并将冲洗出来的溶液排至废液接收罐；其中单针进量为200-250g。
洗脱：进样完毕后，改用90-95％的甲醇/乙腈/乙醇水溶液进行洗脱，检测波长240nm。当洗脱液MX主峰上升至平头拐点时，开始收集，继续洗脱至图谱下降至最低呈直线时，停止收集。用流动相平衡树脂后重复进样洗脱，如此重复多次，每罐收集2针主流液，混合均匀后取样检测。将检测合格洗脱液合并在一起进行洗脱液后处理。
洗脱液浓缩：对洗脱合格液进行真空减压浓缩，温度30-60℃，真空度≤-0.09MPa，直至所有洗脱液浓缩至冷凝器下视镜无甲醇流出。
萃取：浓缩结束后往浓缩罐中加入30kg丁基磷酸二丁酯，搅拌0.5小时后静置1小时。分层后收集有机相，将其泵入到超膜过滤器中进行浓缩。
浓缩结束后，往浓缩罐中加入产品量3～4倍重量的正庚烷或正己烷，搅拌升温至63℃溶解至澄清，降温至10℃保温结晶2小时以上。
将结晶液用过滤器过滤，将湿品放入双锥干燥机减压干燥，控制温度55～65℃，真空≤-0.085MPa，8～12小时后出粉。
成品结果：
| 组别 | 莫西菌素成品 | 纯度 | 收率 |
| 实施例1 | 3.5kg | 98.4％ | 82.1％ |
| 实施例2 | 3.6kg | 98.2％ | 74.3％ |
| 实施例3 | 3.8kg | 98.2％ | 83.2％ |
萃取率实验：
根据实施例1-3，分别测定加入不同质量的丁基磷酸二丁酯对莫西菌素的萃取程度，实验结果以萃取率表示。同时，改变萃取过程中的搅拌时间以及静置时间，检测萃取率的大小。
表1：实施例1-3莫西菌素萃取率
| 组别 | 丁基磷酸二丁酯质量/kg | 萃取率 |
| 实施例1 | 25 | 95.4％ |
| 实施例2 | 20 | 94.3％ |
| 实施例3 | 30 | 93.1％ |
表2：不同搅拌、静置时间下莫西菌素萃取率
由上述实验结果可以看出，在加入的萃取剂丁基磷酸二丁酯质量为20kg时，当搅拌时间为0.5h、静置时间为1h时，萃取率最低，仅为94.3％；随着搅拌时间和静置时间的增长，萃取率在上升，当搅拌时间为1h,静置时间为1.5h时，萃取率最高，再随着时间的增长，萃取率不再上升。在加入的萃取剂丁基磷酸二丁酯质量为25kg时，当搅拌时间为0.5h、静置时间为2h时，萃取率为96.4％，在此条件下，莫西菌素的萃取率最高。
抗寄生虫效果实验：
取自然感染有寄生虫的小鼠60只，随机分成5组，每组12只，第一组为对照组，正常喂养；第二组为不经过甲基丙烯酸甲酯处理组，即本组进行实验时给小鼠灌胃时的莫西菌素，其制备方法与实施例1相同，不同之处在于没有进行“加入甲基丙烯酸甲酯加热”过程；第三组为实施例1实验组，灌胃给药；第四组为实施例2是实验组，灌胃给药；第五组为实施例3实验组，灌胃给药；每组灌胃给药的质量相同，每天两次，7天后捕杀小鼠，按寄生虫学实验方法检查小鼠消化道内的虫体，实验结果如下表所示。
表3：小鼠内寄生虫检测结果：
| 组别 | 动物数 | 线虫数 | 鞭毛虫数 |
| 1 | 12 | 148.3±68.47 | 197.36±39.15 |
| 2 | 12 | 65.42±39.36 | 96.42±40.15 |
| 3 | 12 | 27.29±38.11 | 43.17±28.96 |
| 4 | 12 | 25.84±34.84 | 40.33±54.95 |
| 5 | 12 | 26.71±35.22 | 45.36±30.84 |
由上表可以看出，正常喂养的小鼠体内含有大量的寄生虫，第二组为不经过甲基丙烯酸甲酯处理组，即没有进行“加入甲基丙烯酸甲酯加热”过程，该组小鼠体内的线虫数以及鞭毛虫数与第一组正常喂养的小鼠相比，数量下降，说明按照本发明的步骤提纯得到的莫西菌素对于消除体内寄生虫具有一定的效果；同时，实验三、四、五组中，小鼠体内寄生虫明显减少，说明本发明的制作切实可行，加入甲基丙烯酸甲酯加热，对莫西菌素形成保护作用，使其在后续的纯化过程中保持良好的生物活性，具有更好的抗寄生虫效果。
Claims (8)
1.一种高纯度莫西菌素的分离纯化法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将链霉素发酵产生的发酵液经固液分离，浸取后得到尼莫克汀浓缩液，经上保护、氧化、脱保护和胺化反应得到待处理莫西菌素甲醇溶液（MX-4），将莫西菌素甲醇溶液（MX-4）抽至反应釜内，加入流动相配成上注液，将上注液加入到制备柱中；
（2）向莫西菌素甲醇溶液中加入甲基丙烯酸甲酯，加热一定时间；
（3）进样：打开系统设备监视器，选择合适的在线过滤器，进行进料，根据单针进样量设定进料时间，并将冲洗出来的溶液排至废液接收罐，其中单针进量为200-250g；
（4）打开系统设备监视器，选择合适的在线过滤器，按吸附量进行上样，用有机溶剂水溶液进行洗脱，检测波长为240nm，当洗脱液主峰上升至平头拐点时，将组分收集阀切至洗脱液主流接收罐内，继续洗脱直至图谱下降至最低呈直线，用流动相平衡树脂后重复进样洗脱，如此重复多次，每罐收集2针主流液，混合均匀后取样检测，将检测合格洗脱液合并在一起；
（5）对检测合格洗脱液进行真空浓缩；
（6）对浓缩液进行丁基磷酸二丁酯萃取，搅拌静止分层；
（7）将步骤（6）分层得到的有机相收集，进行浓缩；
（8）浓缩结束后，往浓缩罐中加入一定量的正庚烷或正己烷结晶；
（9）抽滤干燥得到成品。
2.如权利要求1所述的高纯度莫西菌素的分离纯化法，其特征在于：所述步骤（1）中待处理的莫西菌素甲醇溶液含量为10%-20%，纯度≥80.0%；所述流动相溶液为68%-72%甲醇、乙腈、乙醇水溶液中的一种；所述制备柱的色谱填料为ODS -C18，制备柱型号为DAC-100，色谱柱直径为100mm。
3.如权利要求1所述的高纯度莫西菌素的分离纯化法，其特征在于：所述步骤（4）中有机溶剂水溶液为90%-95%的甲醇、乙腈、乙醇中的一种或多种。
4.如权利要求1所述的高纯度莫西菌素的分离纯化法，其特征在于：所述步骤（5）中洗脱液浓缩罐温度30-60℃，真空度≤-0.09MPa。
5.如权利要求1所述的高纯度莫西菌素的分离纯化法，其特征在于：所述步骤（6）中丁基磷酸二丁酯萃取时加入量为20-30kg，搅拌0.5-1.5小时，静置1-2小时。
6.如权利要求1所述的高纯度莫西菌素的分离纯化法，其特征在于：所述步骤（7）中有机相收集后，置于超滤膜分离器中进行浓缩。
7.如权利要求1所述的高纯度莫西菌素的分离纯化法，其特征在于：所述步骤（8）中往浓缩罐中加入是产品量3～4倍重量的正庚烷或正己烷，搅拌升温至60～65℃溶解至澄清，降温至5～10℃保温结晶2小时以上。
8.如权利要求1所述的高纯度莫西菌素的分离纯化法，其特征在于：所述步骤（9）中干燥温度55～65℃，真空≤-0.085MPa，干燥8～12小时。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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