CN116735774B - 检测富马酸丙酚替诺福韦原料药中基因毒性杂质含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测富马酸丙酚替诺福韦原料药中基因毒性杂质含量的方法，所述基因毒性杂质包括（R）‑9‑（2‑氯丙基）腺嘌呤和苯醌，所述基因毒性杂质的检测方法包括如下步骤：S1、配置对照品溶液和供试品溶液；S2、用液相色谱法进行检测；S3、按照外标法以峰面积计算供试品溶液中（R）‑9‑（2‑氯丙基）腺嘌呤和苯醌的含量。本发明通过液相色谱法实现了对富马酸丙酚替诺福韦原料药中基因毒性杂质（R）‑9‑（2‑氯丙基）腺嘌呤和苯醌的检测，该检测方法系统适用性好、专属性好、检测限度低、灵敏度高、线性关系好、准确度高、重复性好及稳定性好。
Description
技术领域
本发明涉及药物分析技术领域，特别地，涉及一种检测富马酸丙酚替诺福韦原料药中基因毒性杂质含量的方法。
背景技术
乙型肝炎病毒感染为世界性传染病，富马酸丙酚替诺福韦的开发为临床治疗乙型肝炎病毒感染提供了强有力的疗效，也被称为“历史上最强的乙型肝炎药物。
富马酸丙酚替诺福韦原料药在生产过程中可能引入原料、副产物等有机杂质，在生产、贮藏或运输中也会产生降解杂质，且由于其自身含有嘌呤结构、苯酚结构，亦会产生基因毒性杂质，因此对原料药的质量把控极其重要，其分子式为C21H29N6O5P•（C4H4O4），分子量为534.50，结构式如下：
药物中的基因毒性杂质由于直接或间接损伤细胞DNA，产生基因突变，存在潜在的致癌性，近年来受到广泛的关注。越来越多的药企把基因毒性杂质研究作为药品研究中的关键核心任务。人用药品注册技术要求国际协调会规定，具备潜在基因毒性的结构物质需要对其基因毒性进行评估并制定合理限度。本品制剂为富马酸丙酚替诺福韦片，最大日服剂量为25mg（以丙酚替诺福韦计），故致突变杂质限度均按照指导原则ICH M7依据TTC（1.5μg/最大日服剂量/天）计算，得出富马酸丙酚替诺福韦原料药中含（R） -9-（2-氯丙基）腺嘌呤和苯醌均不得过60ppm。
苯酚是富马酸丙酚替诺福韦的降解杂质，且在稳定性期间苯酚是其主要降解产物之一，苯酚被氧化可产生苯醌，因此原料药中存在生成苯醌的风险，苯醌是一种警示结构，存在潜在的致癌性，其分子式为，结构式如下：
（R）-9-[2-（苯氧基磷酰甲氧基）-丙基]腺嘌呤是合成富马酸丙酚替诺福韦的中间体，也是其降解杂质，在合成中与氯化亚砜试剂反应生成（R）-9-（2-氯丙基）腺嘌呤，因该结构中含有卤代烃警示结构，存在潜在的致癌性，其结构式如下：
现有技术中并未对富马酸丙酚替诺福韦原料药中的上述基因毒性杂质的检测进行研究，因此开发一种检测简单、灵敏度高、准确度高的富马酸丙酚替诺福韦原料药中基因毒性杂质含量的方法，具有非常重要的社会意义和经济效益。
发明内容
本发明提供了一种检测富马酸丙酚替诺福韦原料药中基因毒性杂质含量的方法，以解决现有技术无法对（R）-9-（2-氯丙基）腺嘌呤和苯醌的含量进行准确的定量检测的技术问题。
本发明提供一种检测富马酸丙酚替诺福韦原料药中基因毒性杂质含量的方法，所述基因毒性杂质包括（R）-9-（2-氯丙基）腺嘌呤和苯醌，所述基因毒性杂质的检测方法包括如下步骤：
S1、配置溶液：将（R）-9-（2-氯丙基）腺嘌呤和苯醌用第一稀释剂配置成（R）-9-（2-氯丙基）腺嘌呤和苯醌的浓度均为0.12µg/mL～0.18µg/mL的混合溶液，所述混合溶液为对照品溶液；取富马酸丙酚替诺福韦原料药，用第二稀释剂配置成浓度为2mg/mL～3mg/mL的供试品溶液，其中，所述第一稀释剂为乙腈水溶液；所述第二稀释剂为醋酸铵溶液；
S2、用液相色谱法对对照品溶液和供试品溶液进行检测，记录色谱图，检测条件如下：
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；
流动相A：浓度为0.018~0.022mol/L的醋酸铵溶液；
流动相B：乙腈；
洗脱方式：梯度洗脱；
S3、按照外标法以峰面积计算供试品溶液中（R）-9-（2-氯丙基）腺嘌呤和苯醌的含量。
进一步地，步骤S2所述液相色谱中的检测波长为260nm。
进一步地，步骤S2流动相A和流动相B的流速均为0.9~1.1ml/min。
进一步地，步骤S2所述液相色谱中的柱温为25~30℃。
进一步地，步骤S2进样室温度为2~8℃。
进一步地，步骤S2中所述醋酸铵溶液的pH值范围为5.5~6.8。
进一步地，步骤S1中还包括空白溶液的配置，所述空白溶液包括第一稀释剂和第二稀释剂。
进一步地，S1中所述混合溶液的制备方法包括：
取苯醌，用第一稀释剂将其配置成浓度为0.6 mg/mL～0.9mg/mL的苯醌杂质储备液；
称取（R）-9-（2-氯丙基）腺嘌呤，用第一稀释剂将其配置成浓度为0.6 mg/mL～0.9mg/mL的（R）-9-（2-氯丙基）腺嘌呤杂质储备液；
称取所述苯醌杂质储备液和所述（R）-9-（2-氯丙基）腺嘌呤杂质储备液，用第一稀释剂将两者配置成杂质混合储备液，再用第一稀释剂将所述杂质混合储备液稀释至（R）-9-（2-氯丙基）腺嘌呤和苯醌的浓度均为0.12µg/mL～0.18mg/mL的混合溶液。
进一步地，所述计算供试品溶液中（R）-9-（2-氯丙基）腺嘌呤和苯醌的含量的计算公式为：
；
其中，杂质含量（%）：（R）-9-（2-氯丙基）腺嘌呤或苯醌的质量百分含量；A供试：供试品溶液中杂质的峰面积，单位为；A对照：对照品溶液中杂质的峰面积，单位为；W供试：供试品称样量，单位为mg；W对照：对照品称样量，单位为mg。
进一步地，所述梯度洗脱包括：
在开始洗脱的0~15min，所述流动相A在所述流动相A与所述流动相B总体积中的百分含量由95%降至80%；
在洗脱进行中的第15~35min，所述流动相A在所述流动相A与所述流动相B总体积中的百分含量由80%降至60%；
在洗脱进行中的第35~50 min，所述流动相A在所述流动相A与所述流动相B总体积中的百分含量由60%降至30%；
在洗脱进行中的第50~55 min，所述流动相A在所述流动相A与所述流动相B总体积中的百分含量维持30%；
在洗脱进行中的第55~56min，所述流动相A在所述流动相A与所述流动相B总体积中的百分含量由30%上升至95%。
本发明具有以下有益效果：
（1）本申请提供的检测方法系统适用性良好：对照品溶液中苯醌和（R）-9-（2-氯丙基）腺嘌呤的理论塔板数分别为21154和87786（均大于3000）， 拖尾因子分别为1.328和1.389（均小于2.0），信噪比均远大于10，均符合要求，对照品溶液连续进样6次，苯醌的保留时间RSD为0.22，峰面积RSD为0.87，（R） -9-（2-氯丙基）腺嘌呤的保留时间RSD为0.22，峰面积RSD为2.87，保留时间RSD均小于2.0%，峰面积RSD均小于10.0%，符合要求，说明本法系统适用性良好。
（2）本申请提供的检测方法专属性良好：空白溶液无干扰；供试品溶液中其它杂质对其均无干扰，说明本法专属性良好。
（3）本申请提供的检测方法的灵敏度高：一方面，苯醌的定量限浓度为0.0087µg/ml（相当于供试品溶液浓度的0.00044%），定量限浓度均小于限度的30%（0.0018%），定量限溶液色谱图中信噪比为16.54，大于10，检测限浓度为0.0026µg/ml（相当于供试品溶液浓度的0.00013%），检测限溶液色谱图中信噪比为3.06，大于3，说明该方法能满足苯醌的定量检出；
另一方面，（R）-9-（2-氯丙基）腺嘌呤的定量限浓度为0.0060µg/ml（相当于供试品溶液浓度的0.00030%），定量限浓度均小于限度的30%（0.0018%），定量限溶液色谱图中信噪比为13.83，大于10，检测限浓度为0.0018 µg/ml（相当于供试品溶液浓度的0.000090%），检测限溶液色谱图中信噪比为3.08，大于3，说明该方法能满足（R）-9-（2-氯丙基）腺嘌呤的定量检出。
（4）本申请提供的检测方法的重复性好：6份重复性溶液中，苯醌和（R）-9-（2-氯丙基）腺嘌呤的含量测定结果均为0.0060%-0.0061%，在0.0050%-0.0070%范围内，说明该方法重复性较好。
（5）本申请提供的检测方法的有良好的线性关系：一方面，苯醌在0.0087µg/ml～0.35µg/m范围内，线性方程为y = 34,877.8261 x - 188.1917，回归曲线的回归系数R为0.9999，不低于0.990，Y轴截距占100%响应值的4.86%，说明苯醌在0.0087µg/ml～0.35µg/ml范围内具有良好的线性关系；
另一方面，（R）-9-（2-氯丙基）腺嘌呤在0.0060µg/ml～0.36µg/ml范围内，线性方程为y = 76455.5614 x - 42.2941，回归曲线的回归系数R为1.0000，不低于0.990，Y轴截距占100%响应值的4.83%，说明（R） -9-（2-氯丙基）腺嘌呤在0.0060µg/ml～0.36µg/ml范围内具有良好的线性关系。
（6）本申请提供的检测方法准确度好：一方面，供试品溶液中未检出苯醌，往供试品溶液中加入0.058ng/ml～0.174 ng/ml浓度范围内的苯醌，回收率在89.58%～105.55%，平均回收率为101.1%，回收率均在85%~110%范围内，回收率的RSD为5.97%，小于8%，说明该方法检测苯醌准确度好；
另一方面，供试品溶液中未检出（R）-9-（2-氯丙基）腺嘌呤，往供试品溶液中加入0.060ng/ml～0.180 ng/ml浓度范围内的苯醌，回收率在97.66%～98.69%，平均回收率为98.1%，回收率均在85%~110%范围内，回收率的RSD为0.40%，小于8%，说明该方法检测（R）-9-（2-氯丙基）腺嘌呤准确度好。
（7）本申请提供的检测方法制得的对照品溶液和供试品溶液在室温下稳定性好：对照品溶液在室温下放置17h，苯醌的峰面积RSD为6.70%，（R）-9-（2-氯丙基）腺嘌呤的峰面积RSD为2.21 %，均小于10.0%，说明对照品溶液在室温放置17h是稳定的。供试品溶液在室温放置11h，均未检出苯醌和（R）-9-（2-氯丙基）腺嘌呤，说明供试品溶液在室温放置11h是稳定的。
除了上面所描述的目的、特征和优点之外，本发明还有其它的目的、特征和优点。下面将参照图，对本发明作进一步详细的说明。
附图说明
构成本申请的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1是本发明优选实施例中空白溶液的液相色谱图；
图2是本发明优选实施例中苯醌和（R）-9-（2-氯丙基）腺嘌呤混合对照品溶液的液相色谱图；
图3是本发明优选实施例中供试品溶液的液相色谱图；
图4是本发明优选实施例中加标供试品溶液的液相色谱图；
图5是本发明优选实施例中苯醌的紫外吸收光谱图；
图6是本发明优选实施例中（R）-9-（2-氯丙基）腺嘌的紫外吸收光谱图；
图7是本发明优选实施例中苯醌和（R）-9-（2-氯丙基）腺嘌的定量限液相色谱图；
图8是本发明优选实施例中苯醌和（R）-9-（2-氯丙基）腺嘌的检测限液相色谱图；
图9是本发明优选实施例中苯醌的线性曲线图；
图10是本发明优选实施例中（R）-9-（2-氯丙基）腺嘌的线性曲线图。
具体实施方式
为了使本发明的发明目的、技术方案和有益技术效果更加清晰，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的实施例仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明。
为了简便，本文仅明确地公开了一些数值范围。然而，任意下限可以与任何上限组合形成未明确记载的范围；以及任意下限可以与其它下限组合形成未明确记载的范围，同样任意上限可以与任意其它上限组合形成未明确记载的范围。此外，尽管未明确记载，但是范围端点间的每个点或单个数值都包含在该范围内。因而，每个点或单个数值可以作为自身的下限或上限与任意其它点或单个数值组合或与其它下限或上限组合形成未明确记载的范围。
在本文的描述中，需要说明的是，除非另有说明，“以上”、“以下”为包含本数，“一种或多种”中的“多种”的含义是两种及以上，“一个或多个”中的“多个”的含义是两个及以上。
本申请的实施例提供一种检测富马酸丙酚替诺福韦原料药中基因毒性杂质含量的方法，所述基因毒性杂质包括（R）-9-（2-氯丙基）腺嘌呤和苯醌，所述基因毒性杂质的检测方法包括如下步骤：
S1、配置溶液：将（R）-9-（2-氯丙基）腺嘌呤和苯醌用第一稀释剂配置成（R）-9-（2-氯丙基）腺嘌呤和苯醌的浓度均为0.12µg/mL～0.18µg/mL的混合溶液，所述混合溶液为对照品溶液；取富马酸丙酚替诺福韦原料药，用第二稀释剂配置成浓度为2 mg/mL～3µg/mL的供试品溶液，其中，所述第一稀释剂为乙腈水溶液；所述第二稀释剂为醋酸铵溶液；
S2、用液相色谱法对对照品溶液和供试品溶液进行检测，记录色谱图，检测条件如下：
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；
流动相A：浓度为0.018~0.022mol/L的醋酸铵溶液；
流动相B：乙腈；
洗脱方式：梯度洗脱；
S3、按照外标法以峰面积计算供试品溶液中（R）-9-（2-氯丙基）腺嘌呤和苯醌的含量。
在本申请的实施例中，步骤S2所述液相色谱中的检测波长为260nm。
根据本申请的实施例，（R）-9-（2-氯丙基）腺嘌呤和苯醌的最大吸收波长均是260nm，检测波长为260nm响应最高。
在本申请的实施例中，步骤S2流动相A和流动相B的流速均为0.9~1.1ml/min。
根据本申请的实施例，对于选择的色谱柱，选在流速为0.9~1.1ml/min，压力合适。如果流速太小，出峰时间太慢，采集时间较长；如果流速太快，与相邻杂质分离度较差。
在本申请的实施例中，步骤S2所述液相色谱中的柱温为25~30℃。
在本申请的实施例中，步骤S2进样室温度为2~8℃。
在本申请的实施例中，由于（R）-9-（2-氯丙基）腺嘌呤和苯醌在供试品溶液中温度高于8℃相对不稳定，所以为了保证上述基因毒性杂质的稳定性，需将进样温度控制在2~8℃。
在本申请的实施例中，步骤S2中所述醋酸铵溶液的pH值范围为5.5~6.8。
根据本申请的实施例，由于（R）-9-（2-氯丙基）腺嘌呤和苯醌在偏酸或偏碱性环境中均不稳定，因此将pH值范围控制在5.5~6.8。
在本申请的实施例中，步骤S1中还包括空白溶液的配置，所述空白溶液包括第一稀释剂和第二稀释剂。
在本申请的实施例中，S1中所述混合溶液的制备方法包括：
称取苯醌，用第一稀释剂将其配置成浓度为0.6 mg/mL的苯醌杂质储备液；
称取（R）-9-（2-氯丙基）腺嘌呤，用第一稀释剂将其配置成浓度为0.6 mg/mL的（R）-9-（2-氯丙基）腺嘌呤杂质储备液；
取所述苯醌杂质储备液和所述（R）-9-（2-氯丙基）腺嘌呤杂质储备液，用第一稀释剂将两者配置成杂质混合储备液，再用第一稀释剂将所述杂质混合储备液稀释至（R）-9-（2-氯丙基）腺嘌呤和苯醌的浓度均为0.12µg/mL的混合溶液。
在本申请的实施例中，所述计算供试品溶液中（R）-9-（2-氯丙基）腺嘌呤和苯醌的含量的计算公式为：
；
其中，杂质含量（%）：（R） -9-（2-氯丙基）腺嘌呤或苯醌的质量百分含量；A供试：供试品溶液中杂质的峰面积，单位为；A对照：对照品溶液中杂质的峰面积，单位为；W供试：供试品称样量，单位为mg；W对照：对照品称样量，单位为mg。
在本申请的实施例中，所述梯度洗脱包括：
在开始洗脱的0~15min，所述流动相A在所述流动相A与所述流动相B总体积中的百分含量由95%降至80%；
在洗脱进行中的第15~35min，所述流动相A在所述流动相A与所述流动相B总体积中的百分含量由80%降至60%；
在洗脱进行中的第35~50 min，所述流动相A在所述流动相A与所述流动相B总体积中的百分含量由60%降至30%；
在洗脱进行中的第50~55 min，所述流动相A在所述流动相A与所述流动相B总体积中的百分含量维持30%；
在洗脱进行中的第55~56min，所述流动相A在所述流动相A与所述流动相B总体积中的百分含量由30%上升至95%。
根据本申请的实施例，选择上述梯度洗脱可保证杂质能洗脱，并能与其它杂质分离开来。
下述实施例更具体地描述了本申请公开的内容，这些实施例仅仅用于阐述性说明，因为在本申请公开内容的范围内进行各种修改和变化对本领域技术人员来说是明显的。除非另有声明，以下实施例中所报道的所有份、百分比、和比值都是基于重量计，而且实施例中使用的所有试剂都可商购获得或是按照常规方法进行合成获得，并且可直接使用而无需进一步处理，以及实施例中使用的仪器均可商购获得。
本文实施例为一种测定富马酸丙酚替诺福韦原料药中基因毒性杂质含量的方法，包括以下步骤：
S1、配置溶液：
第一稀释剂：将乙腈和水按照体积比50：50混合即得。
第二稀释剂：0.02mol/L醋酸铵溶液（用冰醋酸调pH值至6.0）。
苯醌杂质储备液（0.6mg/ml）的配置：取苯醌约6mg，精密称定，置10ml量瓶，用第一稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
（R）-9-（2-氯丙基）腺嘌呤杂质储备液（0.6mg/ml）的配置：取（R）-9-（2-氯丙基）腺嘌呤约6mg，精密称定，置10ml量瓶，用第一稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
杂质混合储备液的配置：精密量取（R）-9-（2-氯丙基）腺嘌呤杂质储备液、苯醌储备液各1ml，置20ml量瓶，用第一稀释剂稀释至刻度，摇匀，精密量取1ml，置25ml量瓶，用溶剂稀释至刻度，摇匀，即得。
对照品溶液（0.12µg/ml）的配置：精密量取杂质混合储备液2ml，置20ml量瓶中，用第一稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。
供试品溶液（2mg/ml）的配置：取富马酸丙酚替诺福韦原料药约44mg，置20ml量瓶中，加第二稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。说明：富马酸丙酚替诺福韦中含有1/2的富马酸，富马酸丙酚替诺福韦的分子量为534.5，富马酸的分子量为116.0，因此1份富马酸丙酚替诺福韦中含丙酚替诺福韦：（534.5-116/2）/534.5=0.89份，由于供试品浓度是以丙酚替诺福韦计算，故需要称量44mg富马酸丙酚替诺福韦原料药（约相当于丙酚替诺福韦40mg）。
加标供试品溶液的配置：取富马酸丙酚替诺福韦原料药约44mg，置20ml量瓶中，精密量取杂质混合储备液2ml，加入上述量瓶中，用第二稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
S2、液相色谱法检测：
精密量取对照品溶液和供试品溶液各20µl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。对照品溶液中的出峰顺序为（R）-9-（2-氯丙基）腺嘌呤、苯醌，供试品溶液色谱图中如有与对照品溶液中杂质峰出峰位置一致的峰，按照外标法以峰面积计算，计算公式如下：
；
式中：杂质含量（%）：（R）-9-（2-氯丙基）腺嘌呤或苯醌的质量百分含量；A供试：供试品溶液中杂质的峰面积，单位为；A对照：对照品溶液中杂质的峰面积，单位为；W供试：供试品称样量，mg；W对照：对照品称样量，mg；所述对照品的稀释倍数由所述混合溶液的浓度换算而来。
上述液相色谱条件如下：
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（推荐：InertSustain C18，4.6mm×250mm，5µm或效能相当的色谱柱）
检测波长：260nm；
流速：0.9~1.1ml/min；
柱温：25~30℃；
进样室内温度：2~8℃；
进样量：20µl；
流动相A：0.018~0.022mol/L醋酸铵溶液（用冰醋酸调pH值至5.5~6.8）；
流动相B：乙腈。
梯度洗脱方式如下表1所示：
表1 梯度洗脱方式
所述杂质为苯醌和（R）-9-（2-氯丙基）腺嘌呤，它们的结构式如表2所示：
表2 杂质结构式
本发明实施例中检测方法的系统适用性和专属性结果分析：
本发明中的空白溶液、对照品溶液、供试品溶液、加标供试品溶液检测图谱如图1～图4，结果见表3～表4。
表3系统适用性和专属性测试结果
从表3中可知：对照品溶液中苯醌和（R）-9-（2-氯丙基）腺嘌呤的理论塔板数分别为21154和87786（均大于3000）， 拖尾因子分别为1.328和1.389（均小于2.0），信噪比均远大于10，均符合要求，说明本方法系统适用性好；空白溶液无干扰；供试品溶液中其它杂质对其均无干扰，说明本法专属性良好。
表4 系统适用性-进样精密度结果
使用waters液相色谱仪将对照品溶液连续进样6次，测试结果如表4所示，表4中（R） -9-（2-氯丙基）腺嘌呤的保留时间在12.7min附近；苯醌的保留时间在19.5min附近。图2为苯醌和（R）-9-（2-氯丙基）腺嘌呤混合对照品溶液的液相色谱图，使用仪器为岛津液相色谱仪，图中（R）-9-（2-氯丙基）腺嘌呤和苯醌的保留时间漂移至13.7min附近和21.7min附近，分离度均满足要求，说明方法耐受性良好。以上在同一工作站使用不同品牌的液相色谱仪进行检测时，保留时间均会稍有差异，属于正常且可接受的实验现象。
从表4中可知：对照品溶液连续进样6次，苯醌的保留时间RSD为0.22，峰面积RSD为0.87，（R）-9-（2-氯丙基）腺嘌呤的保留时间RSD为0.22，峰面积RSD为2.87，保留时间RSD均小于2.0%，峰面积RSD均小于10.0%，符合要求，说明本法系统适用性良好。
图5~图6为本实施例中苯醌和（R） -9-（2-氯丙基）腺嘌的紫外吸收光谱图。
表5为本实施例中（R）9-（2-氯丙基）腺嘌呤定量限和检测限的结果，定量限和检测限图谱如图7～图8。
表5本发明实施例9-（2-氯丙基）腺嘌呤定量限和检测限的结果
从表5可知 ，苯醌的定量限浓度为0.0087µg/ml，相当于供试品溶液浓度的0.00044%，信噪比为16.54，大于10，检测限浓度为0.0026µg/ml，相当于供试品溶液浓度的0.00013%，检测限溶液色谱图中信噪比为3.06，大于3。（R）-9-（2-氯丙基）腺嘌呤的定量限浓度为0.0060µg/ml，相当于供试品溶液浓度的0.00030%，信噪比为13.83，大于10，检测限浓度为0.0018µg/ml，相当于供试品溶液浓度的0.000090%，信噪比为3.08，大于3，说明该方法对苯醌和（R）-9-（2-氯丙基）腺嘌呤的灵敏度较好。
表6 本发明实施例苯醌和（R）-9-（2-氯丙基）腺嘌呤重复性试验结果
从表6可知，6份供试品溶液中测定结果均在可接受范围内，故该方法重复性好。
本发明实施例线性与范围：
线性溶液：分别取苯醌对照品和（R）-9-（2-氯丙基）腺嘌呤对照品适量，分别配置一系列不同浓度的溶液，依照实施例的检测方法测定，测定结果见表7～表8和图9～图10。
表7不同浓度的苯醌对照品峰面积测试结果与标准曲线
从表7可知，苯醌在0.0087µg/ml～0.35µg/ml范围内，线性方程为y = 34,877.8261 x - 188.1917，回归曲线的回归系数R为0.9999，不低于0.990，Y轴截距占100%响应值的4.86%，说明苯醌在0.0087µg/ml～0.35µg/ml范围内具有良好的线性关系，如图9所示。
表8不同浓度的（R）-9-（2-氯丙基）腺嘌呤对照品峰面积测试结果与标准曲线
从表8可知，（R）-9-（2-氯丙基）腺嘌呤在0.0060µg/ml～0.36µg/ml范围内，线性方程为y = 76455.5614 x - 42.2941，回归曲线的回归系数R为1.0000，不低于0.990，Y轴截距占100%响应值的4.83%，说明（R）-9-（2-氯丙基）腺嘌呤在0.0060µg/ml～0.36µg/ml范围内具有良好的线性关系，如图10所示。
配置如下溶液：
回收率储备液：取苯醌、（R）-9-（2-氯丙基）腺嘌呤各6mg，分别置10ml量瓶，用50%乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取该溶液各1ml，置20ml量瓶，加50%乙腈稀释至刻度，摇匀，精密量取1ml，置25ml量瓶，加溶剂稀释至刻度，摇匀（各杂质1.2µg/ml），平行配制2份。
对照品溶液：精密量取回收率储备液2ml，置20ml量瓶中，用流动相A稀释至刻度，摇匀（各杂质0.12µg/ml），平行配制2份。
本底供试品溶液：取富马酸丙酚替诺福韦原料药约44mg，精密称定，置20ml量瓶中，加流动相A溶解并稀释至刻度，摇匀。
50%回收率溶液（30ppm）：取富马酸丙酚替诺福韦原料药约44mg，精密称定，置20ml量瓶中，加回收率储备液1ml，加流动相A溶解并稀释至刻度，摇匀，平行配制3份。
100%回收率溶液（60ppm）：取富马酸丙酚替诺福韦原料药约44mg，精密称定，置20ml量瓶中，加回收率储备液2ml，加流动相A溶解并稀释至刻度，摇匀，平行配制3份。
150%回收率溶液（90ppm）：取富马酸丙酚替诺福韦原料药约44mg，精密称定，置20ml量瓶中，加回收率储备液3ml，加流动相A溶解并稀释至刻度，摇匀，平行配制3份。
精密量取上述各溶液20µl，照本实施例中的色谱条件进行测定，计算回收率，结果见表9～表10。
表9 本发明实施例检测方法的苯醌的回收率试验结果
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表10 本发明实施例检测方法的（R）-9-（2-氯丙基）腺嘌呤的回收率试验结果
由表9可知，供试品溶液中未检出苯醌，往供试品溶液中加入0.058 ng/ml～0.174ng/ml浓度范围内的苯醌，回收率在89.58%～105.55%，平均回收率为101.1%，回收率均在85%~110%范围内，回收率的RSD为5.97%，小于8%，说明该方法检测苯醌准确度好。
由表10可知，供试品溶液中未检出（R）-9-（2-氯丙基）腺嘌呤，往供试品溶液中加入0.060 ng/ml～0.180 ng/ml浓度范围内的苯醌，回收率在97.66%～98.69%，平均回收率为98.1%，回收率均在85%~110%范围内，回收率的RSD为0.40%，小于8%，说明该方法检测（R）-9-（2-氯丙基）腺嘌呤准确度好。
各浓度下的苯醌、（R）-9-（2-氯丙基）腺嘌呤的回收率均符合2020版中国药典第四部通则9101的规定，回收率在85%~110%范围内，说明该方法准确度良好。
本发明实施例中检测方法的溶液稳定性试验：
室温下，将苯醌、（R）-9-（2-氯丙基）腺嘌呤混合对照品溶液放置17h，分别于0h、7h、14h、17h进行测定，结果显示苯醌的峰面积RSD为6.70%，（R）-9-（2-氯丙基）腺嘌呤的峰面积RSD为2.21 %，均小于10.0%，说明对照品溶液在室温放置17h是稳定的。
室温下，供试品溶液放置11h，分别于0h、8h、11h进行测定，均未检出苯醌和（R）-9-（2-氯丙基）腺嘌呤，说明供试品溶液在室温放置11h是稳定的。
通过对富马酸丙酚替诺福韦原料药中基因毒性杂质含量检测方法的系统适用性、专属性、检测限和定量限、线性于范围、准确度及溶液稳定性等方面进行了验证，试验结果表明该方法可用于富马酸丙酚替诺福韦原料药中基因毒性杂质含量的测定。
虽然已经参考优选实施例对本申请进行了描述，但在不脱离本申请的范围的情况下，可以对其进行各种改进并且可以用等效物替换其中的部件，尤其是，只要不存在结构冲突，各个实施例中所提到的各项技术特征均可以任意方式组合起来。本申请并不局限于文中公开的特定实施例，而是包括落入权利要求的范围内的所有技术方案。
Claims (8)
1.一种检测富马酸丙酚替诺福韦原料药中基因毒性杂质含量的方法，其特征在于，所述基因毒性杂质包括(R)-9-(2-氯丙基)腺嘌呤和苯醌，所述基因毒性杂质的检测方法包括如下步骤：
S1、配置溶液：将(R)-9-(2-氯丙基)腺嘌呤和苯醌用第一稀释剂配置成(R)-9-(2-氯丙基)腺嘌呤和苯醌的浓度均为0.12μg/mL～0.18μg/mL的混合溶液，所述混合溶液为对照品溶液；取富马酸丙酚替诺福韦原料药，用第二稀释剂配置成浓度为2mg/mL～3μg/mL的供试品溶液，其中，所述第一稀释剂为乙腈水溶液；所述第二稀释剂为醋酸铵溶液；
S2、用液相色谱法对对照品溶液和供试品溶液进行检测，记录色谱图，检测条件如下：
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；
流动相A：浓度为0.018～0.022mol/L的醋酸铵溶液；
流动相B：乙腈；
检测波长：260nm；
洗脱方式：梯度洗脱，
所述梯度洗脱包括：
在开始洗脱的0～15min，所述流动相A在所述流动相A与所述流动相B总体积中的百分含量由95％降至80％；
在洗脱进行中的第15～35min，所述流动相A在所述流动相A与所述流动相B总体积中的百分含量由80％降至60％；
在洗脱进行中的第35～50min，所述流动相A在所述流动相A与所述流动相B总体积中的百分含量由60％降至30％；
在洗脱进行中的第50～55min，所述流动相A在所述流动相A与所述流动相B总体积中的百分含量维持30％；
在洗脱进行中的第55～56min，所述流动相A在所述流动相A与所述流动相B总体积中的百分含量由30％上升至95％；
S3、按照外标法以峰面积计算供试品溶液中(R)-9-(2-氯丙基)腺嘌呤和苯醌的含量。
2.根据权利要求1所述的检测富马酸丙酚替诺福韦原料药中基因毒性杂质含量的方法，其特征在于，步骤S2流动相A和流动相B的流速均为0.9～1.1ml/min。
3.根据权利要求1所述的检测富马酸丙酚替诺福韦原料药中基因毒性杂质含量的方法，其特征在于，步骤S2所述液相色谱中的柱温为25～30℃。
4.根据权利要求1所述的检测富马酸丙酚替诺福韦原料药中基因毒性杂质含量的方法，其特征在于，步骤S2进样室温度为2～8℃。
5.根据权利要求1所述的检测富马酸丙酚替诺福韦原料药中基因毒性杂质含量的方法，其特征在于，步骤S2中所述醋酸铵溶液的pH值范围为5.5～6.8。
6.根据权利要求1所述的检测富马酸丙酚替诺福韦原料药中基因毒性杂质含量的方法，其特征在于，步骤S1中还包括空白溶液的配置，所述空白溶液包括第一稀释剂和第二稀释剂。
7.根据权利要求1所述的检测富马酸丙酚替诺福韦原料药中基因毒性杂质含量的方法，其特征在于，S1中所述混合溶液的制备方法包括：
称取苯醌，用第一稀释剂将其配置成浓度为0.6mg/mL～0.9mg/mL的苯醌杂质储备液；
称取(R)-9-(2-氯丙基)腺嘌呤，用第一稀释剂将其配置成浓度为0.6mg/mL～0.9mg/mL的(R)-9-(2-氯丙基)腺嘌呤杂质储备液；
取所述苯醌杂质储备液和所述(R)-9-(2-氯丙基)腺嘌呤杂质储备液，用第一稀释剂将两者配置成杂质混合储备液，再用第一稀释剂将所述杂质混合储备液稀释至(R)-9-(2-氯丙基)腺嘌呤和苯醌的浓度均为0.12μg/mL～0.18mg/mL的混合溶液。
8.根据权利要求7所述的检测富马酸丙酚替诺福韦原料药中基因毒性杂质含量的方法，其特征在于，所述计算供试品溶液中(R)-9-(2-氯丙基)腺嘌呤和苯醌的含量的计算公式为：
其中，杂质含量(％)：(R)-9-(2-氯丙基)腺嘌呤或苯醌的质量百分含量；A供试：供试品溶液中杂质的峰面积，单位为mV*min；A对照：对照品溶液中杂质的峰面积，单位为mV*min；W供试：供试品称样量，单位为mg；W对照：对照品称样量，单位为mg。
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| HPLC 法检测富马酸丙酚替诺福韦中的有关物质;韩抒真 等;中国医药工业杂志;全文 * |
| Identification, synthesis and characterization of new impurities in tenofovir;Jun He 等;Pharmazie;全文 * |
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