CN113125625A - 一种富马酸丙酚替诺福韦中基因毒性杂质的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种富马酸丙酚替诺福韦中基因毒性杂质的检测方法，包括以下步骤：S1、取供试品配制供试品溶液；S2、高效液相色谱检测；高效液相色谱检测包括如下条件：流动相A：磷酸溶液；流动相B：乙腈；洗脱方式：梯度洗脱。其通过高效液相色谱对成品富马酸丙酚替诺福韦原料药中基因毒性杂质亚磷酸三苯酯进行了检测；实现了对基因毒性杂质亚磷酸三苯酯的质量控制。本发明的检测方法，适用性良好、专属性良好、检测限度低、灵敏度高、有良好的线性关系、准确度高、重复性好、精密度高、稳定性好且耐用性好。

Description

一种富马酸丙酚替诺福韦中基因毒性杂质的检测方法

技术领域

本发明涉及药物分析技术领域，具体涉及一种富马酸丙酚替诺福韦中基因毒性杂质的检测方法。

背景技术

富马酸替诺福韦酯是新型核苷酸类逆转录酶抑制剂替诺福韦的前药，临床上用于治疗艾滋病和慢性乙型肝炎。富马酸替诺福韦酯在合成和贮存过程中会引入多种杂质，基因毒性杂质亚磷酸三苯酯便是其中的一种。

基因毒性杂质是指药物中能直接或间接损伤细胞DNA，产生致突变或致癌作用的物质。基因毒性杂质作为工艺杂质的一类，近年来受到国内外的高度重视。目前采用气相色谱法检测富马酸丙酚替诺福韦原料药中基因毒性杂质亚磷酸三苯酯，但该方法检测成本高，供试品本身在衍生化过程中不稳定，干扰很大，检测灵敏度低，达不到基因毒性杂质的检测要求。

因此，开发一种检测限低且准确度高的富马酸丙酚替诺福韦中基因毒性杂质亚磷酸三苯酯的检测方法具有非常重要的社会意义和经济效益。

发明内容

本发明要解决的第一个技术问题为：提供一种适用性良好、专属性良好、检测限度低、灵敏度高、有良好的线性关系、准确度高、重复性好、精密度高、稳定性好且耐用性好的富马酸丙酚替诺福韦中基因毒性杂质的检测方法。

本发明要解决的第二个技术问题为：提供一种富马酸丙酚替诺福韦原料药的质量控制方法。

为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案为：一种富马酸丙酚替诺福韦中基因毒性杂质的检测方法，包括以下步骤：

S1、取供试品配制供试品溶液；

S2、高效液相色谱检测；

高效液相色谱检测包括如下条件：

流动相A：磷酸溶液；

流动相B：乙腈；

洗脱方式：梯度洗脱；

富马酸丙酚替诺福韦中基因毒性杂质为亚磷酸三苯酯。

根据本发明的一些实施方式，亚磷酸三苯酯的结构如下式所示：

。

根据本发明的一些实施方式，梯度洗脱的程序方式为：

0min~5min，流动相A在流动相A和流动相B中的体积分数为60%~90%；

5min~15min，流动相A在流动相A和流动相B中的体积分数由60%~90%下降至10%~20%；

15min~18min，流动相A在流动相A和流动相B中的体积分数保持为10%~20%；

18min~20min，流动相A在流动相A和流动相B中的体积分数由10%~20%升高至60%~90%；

20min~25min，流动相A在流动相A和流动相B中的体积分数保持为60%~90%。

根据本发明的一些实施方式，高效液相色谱检测中的色谱柱包括十八烷基硅烷键合硅胶。

根据本发明的一些实施方式，高效液相色谱检测中的色谱柱包括Waters NovaPak C18。

根据本发明的一些实施方式，Waters Nova Pak C18的规格为3.9 mm*150mm 4μm。

根据本发明的一些实施方式，磷酸溶液的质量浓度为0.05%~0.3%。

根据本发明的一些实施方式，高效液相色谱检测的检测器为紫外检测器。

根据本发明的一些实施方式，紫外检测器的检测波长为210nm。

亚磷酸三苯酯在200nm~400nm范围无明显的最大吸收波长，为末端吸收，在210nm处有较大吸收，且在该波长处基线较平滑，故选择210nm作为亚磷酸三苯酯的检测波长。

根据本发明的一些实施方式，高效液相色谱检测的柱温为30℃~40℃。

根据本发明的一些实施方式，流动相A的流速为0.9mL/min~1.1 mL/min；流动相B的流速为0.9mL/min~1.1 mL/min；优选地，流动相A的流速为1.05 mL/min；流动相B的流速为1.05mL/min。

根据本发明的一些实施方式，供试品包括富马酸丙酚替诺福韦原料药。

根据本发明的一些实施方式，供试品溶液中富马酸丙酚替诺福韦原料药浓度为0.54mg/mL~0.66mg/ mL。

根据本发明的一些实施方式，步骤S1中配制供试品溶液包括以下操作：取供试品10.8mg~13.2mg用稀释剂溶解配制为20mL溶液，即得供试品溶液。

根据本发明的一些实施方式，富马酸丙酚替诺福韦中基因毒性杂质的检测方法还包括以下步骤：

（a）、配制对照品贮备液：取对照品10.8mg~13.2mg用稀释剂溶解配制为20mL溶液，即得对照品贮备液；

(b)、配制20倍限度对照品贮备液：

（1）、取对照品贮备液1.0mL用稀释剂配制为50mL溶液，得稀释液；

（2）、再取稀释液0.5mL用稀释剂溶解配制为20mL溶液，即得20倍限度对照品贮备液；

（c）、配制对照品溶液：取20倍限度对照品贮备液1.0mL用稀释剂溶解配制为20mL溶液，即得对照品溶液。

供试品和对照品的质量为10.8mg~13.2mg（12±1.2mg）；代表供试品和对照品的质量10.8mg~13.2mg（12±1.2mg）。

根据本发明的一些实施方式，稀释剂包括乙腈水溶液；优选地，乙腈水溶液中乙腈体积分数为80%。

根据本发明的一些实施方式，富马酸丙酚替诺福韦中基因毒性杂质的检测方法还包括以下步骤：

（Ⅰ）配制混合对照品溶液1：精密量取联苯PMPA对照品贮备液、PMPA双酰胺化物对照品贮备液、GS-7339对照品贮备液、TAF非对映异构体1对照品贮备液和TAF非对映异构体2对照品贮备液各1mL，苯酚对照品贮备液、PMPA单酰胺化物对照品贮备液各1.5mL置同一10mL量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，既得混合对照品溶液1。

（Ⅱ）配制混合对照品溶液2：精密量取对甲苯磺酸乙酯对照品贮备液、对甲苯磺酸异丙酯对照品贮备液、DMAP对照品贮备液各0.6mL，9-（丙烯基）腺嘌呤对照品贮备液0.4mL置同一100mL量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，既得混合对照品溶液2。

（Ⅲ）配制混合对照品溶液：分别精密量1mL混合对照品溶液1、0.5mL混合对照品溶液2、0.5mL PMPA对照品贮备液、0.5mL PMPA酐对照品贮备液、0.5mL 单苯基PMPA对照品贮备液、0.5mL富马酸对照品贮备液和5mL 20倍限度对照品溶液置同一100mL量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得混合对照品溶液。

（Ⅳ）配制专属性混合对照品溶液：取富马酸丙酚替诺福韦原料药（C₂₃H₃₁O₇N₆P，CAS号：1392275-56-7）约12mg，精密称定，置20mL量瓶中，用混合对照品溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，即得专属性混合对照品溶液。

根据本发明实施方式的富马酸丙酚替诺福韦中基因毒性杂质的检测方法，至少具备如下有益效果：

1、该方法适用性好：空白溶液无干扰，对照品溶液所得色谱图中亚磷酸三苯酯峰的信噪比不低于20，通过对基因毒性杂质亚磷酸三苯酯的检测方法的波长选择、系统适用性、专属性、定量限与检测限、线性与范围、准确度、精密度、溶液稳定性和耐用性等九个方面进行了验证，试验结果表明该方法的适用性良好，可用于基因毒性杂质亚磷酸三苯酯的测定。

2、该方法专属性好：空白溶液无干扰，对照品溶液所得色谱图中亚磷酸三苯酯峰的信噪比不低于20，供试品溶液中未检出亚磷酸三苯酯；专属性混合溶液中亚磷酸三苯酯峰与相邻峰之间的分离度大于1.5，专属性混合溶液中亚磷酸三苯酯峰与对照品溶液中亚磷酸三苯酯峰的保留时间一致。

3、该方法检测限度低且灵敏度高：亚磷酸三苯酯的定量限溶液浓度为4.6842ng/mL，相当于供试品溶液浓度的7.81ppm；6份定量限溶液中亚磷酸三苯酯峰的信噪比均在11~15范围内，保留时间的RSD为0.026%，不大于1.0%，峰面积的RSD为1.9%，不大于10%；检测限溶液浓度为1.4052ng/mL，相当于供试品溶液浓度的2.34ppm；3针检测限溶液中亚磷酸三苯酯峰的信噪比均在4~5范围内。

4、该方法有良好的线性关系：亚磷酸三苯酯在4.6842ng/mL~31.2277ng/mL浓度范围内，线性方程为y = 161.74x + 2.7116；回归曲线的回归系数R为0.9998，不低于0.990，响应因子的RSD为1.6%，小于10%，Y轴截距占100%响应值的0.07%，在25%以内，说明该方法在4.6842ng/mL~31.2277ng/mL浓度范围内测定杂质亚磷酸三苯酯具有良好的线性关系。

5、该方法准确度高：对照品溶液所得色谱图中亚磷酸三苯酯峰的信噪比均不低于20，系统适用性符合要求。供试品中未检出亚磷酸三苯酯；往供试品中加入4.6842ng/mL～23.4208ng/mL浓度范围内的亚磷酸三苯酯，回收率均在97.7%～102.1%之间，9份回收率的RSD为1.4%，小于10%。

6、该方法重复性和精密度高：6份加限度浓度亚磷酸三苯酯的中间精密度供试品溶液中亚磷酸三苯酯含量的RSD为4%，不大于6%。依据重复性和中间精密度12份溶液测定结果，得知亚磷酸三苯酯含量的RSD为4%。

7、对照品溶液在常温下稳定性好：对照品溶液在常温下放置8h，亚磷酸三苯酯峰面积RSD为2.8%，小于10%，说明对照品溶液在常温下放置8h是稳定的；供试品溶液在常温下放置10h，均未检出亚磷酸三苯酯，且没有新的干扰亚磷酸三苯酯检出的杂质峰检出，说明供试品溶液在常温下放置10h是稳定的。

8、该方法耐用性好：对色谱参数条件中的流速、柱温以及色谱柱批次进行微小改变时，对照品溶液色谱图中亚磷酸三苯酯峰信噪比均不低于20，系统适用性均符合要求，各测试条件下测试加限度浓度亚磷酸三苯酯的供试品溶液，亚磷酸三苯酯含量的RSD均不大于10%。

为解决上述第二个技术问题，本发明提供的技术方案为：一种富马酸丙酚替诺福韦原料药的质量控制方法。

根据本发明的一些实施方式，质量控制方法包括通过上述的检测方法对富马酸丙酚替诺福韦原料药中的亚磷酸三苯酯进行检测。

根据本发明实施方式的质量控制方法，至少具备如下有益效果：该质量控制方法通过高效液相色谱对成品富马酸丙酚替诺福韦原料药中基因毒性杂质亚磷酸三苯酯进行了检测；实现了对基因毒性杂质亚磷酸三苯酯的质量控制，检测限度低（4.6842ng/mL）。

附图说明

图1为本发明实施例一中空白溶液的高效液相色谱检测图谱；

图2为本发明实施例一中亚磷酸三苯酯对照品溶液的高效液相色谱检测图谱；

图3为本发明实施例一中供试品溶液的高效液相色谱检测图谱；

图4为本发明实施例一中专属性混合对照品溶液的高效液相色谱检测图谱；

图5为本发明实施例一中亚磷酸三苯酯的紫外光谱图；

图6为本发明实施例中亚磷酸三苯酯的标准曲线。

具体实施方式

以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。

本发明实施方式中约12mg是指10.8mg~13.2mg（12±1.2mg）。

本发明的实施例一

一种富马酸丙酚替诺福韦中基因毒性杂质的检测方法，包括以下步骤：

S1、溶液配制：

空白溶液：将乙腈和水按体积比为80：20混合，备用。

对照品贮备液：精密称取对照品约12mg，精密称定，置20mL量瓶中，用稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

20倍限度对照品溶液：

（1）、精密量取上述对照品贮备液1.0mL，置50mL量瓶，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，得稀释液；

（2）、再精密量取稀释液0.5mL，置20mL量瓶，加稀释剂至刻度，摇匀，即得。

对照品溶液：精密量取上述20倍限度对照品贮备液1mL，置20mL量瓶，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得（浓度约15ng/mL）。

其中，对照品为：亚磷酸三苯酯（CAS号：101-02-0）、PMPA（(R)-9-[2-(磷酰基甲氧基)丙基]腺嘌呤，CAS号：147127-20-6）、对甲苯磺酸乙酯（CAS号：80-40-0）、对甲苯磺酸异丙酯（CAS号：2307-69-9）、（丙烯基）腺嘌呤（CAS号：4121-40-8）、9-联苯PMPA（(R)-9-[2-(双苯氧基磷酰基甲氧基)丙基]腺嘌呤，CAS号：342631-41-8）、PMPA酐（二-((((R)-1-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-2-丙基)氧基)甲基)二膦酸，CAS号：1607007-18-0）、DMAP（4-二甲氨基吡啶，CAS号：1122-58-3）、苯酚（CAS号：108-95-2）、单苯基PMPA（(R)-9-[2-(苯氧基磷酰基甲氧基)丙基]腺嘌呤，CAS号：379270-35-6）、PMPA单酰胺化物（丙-2-基N-[({[(2R)-l-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)丙-2-基]-氧化}甲基)(羟基)磷酰基]-1-L-丙氨酸酯，CAS号：851456-00-3）、PMPA双酰胺化物（(R)-9-[2-(双丙-2-基N-1-L丙氨酸酯基磷酰基甲氧基)丙基]腺嘌呤，CAS号：1883563-86-7）、TAF非对映异构体1（丙-2-基N-[(S)-({[(2R)-l-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)丙-2-基]-氧化}甲基)(苯氧基)磷酰基]-1-D-丙氨酸酯，CAS号：2053424-82-9）、TAF非对映异构体2（丙-2-基N-[(S)-({[(2S)-l-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)丙-2-基]-氧化}甲基)(苯氧基)磷酰基]-1-L-丙氨酸酯，购自广州研创生物技术发展有限公司）、GS-7339（丙-2-基N-[(R)-({[(2R)-l-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)丙-2-基]-氧化}甲基)(苯氧基)磷酰基]-1-L-丙氨酸酯，CAS号：383365-04-6）和富马酸（CAS号：110-17-8）。

分别取上述对照品，按上述方法配制对照品贮备液、20倍限度对照品溶液和对照品溶液。

混合对照品溶液1：精密量取联苯PMPA对照品贮备液、PMPA双酰胺化物对照品贮备液、GS-7339对照品贮备液、TAF非对映异构体1对照品贮备液和TAF非对映异构体2对照品贮备液各1mL，苯酚对照品贮备液、PMPA单酰胺化物对照品贮备液各1.5mL置同一10mL量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，既得。

混合对照品溶液2：精密量取对甲苯磺酸乙酯对照品贮备液、对甲苯磺酸异丙酯对照品贮备液、DMAP对照品贮备液各0.6mL，9-（丙烯基）腺嘌呤对照品贮备液0.4mL置同一100mL量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，既得。

供试品溶液：取富马酸丙酚替诺福韦原料药（C₂₃H₃₁O₇N₆P，CAS号：1392275-56-7）约12mg，精密称定，置20mL量瓶中，加适量稀释剂溶解，再用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。

混合对照品溶液：分别精密量1mL混合对照品溶液1、0.5mL混合对照品溶液2、0.5mL PMPA对照品贮备液、0.5mL PMPA酐对照品贮备液、0.5mL 单苯基PMPA对照品贮备液、0.5mL富马酸对照品贮备液和5mL 20倍限度亚磷酸三苯酯对照品溶液置同一100mL量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。

专属性混合对照品溶液：取富马酸丙酚替诺福韦原料药（C₂₃H₃₁O₇N₆P，CAS号：1392275-56-7）约12mg，精密称定，置20mL量瓶中，用混合对照品溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

S2、高效液相色谱检测：

精密量取对空白溶液、亚磷酸三苯酯对照品溶液、混合对照品溶液、专属性混合对照品溶液和供试品溶液各30μL，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，要求对照品溶液所得色谱图中亚磷酸三苯酯峰的信噪比不得低于20。

供试品溶液的色谱图中如有亚磷酸三苯酯峰，按下式计算，其含量不得过25ppm。

。

式中，A_S为供试品溶液中亚磷酸三苯酯的峰面积；

A_R为对照品溶液中亚磷酸三苯酯的峰面积；

C_S为供试品溶液的浓度（mg/mL）；

C_R为对照品溶液的浓度（ng/mL）。

上述高效液相色谱条件如下：

色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱（Waters Nova Pak C18 3.9 mm*150mm 4μm）；

流动相A：0.1%磷酸；

流动相B：乙腈；

稀释剂：乙腈水溶液（体积比为80：20）；

检测波长：210nm；

进样量：30μL；

流速：1.0mL/min；

柱温：35℃；

运行时间：25min。

上述梯度洗脱的程序方式为：

0min~5min，所述流动相A的体积分数为90%；

5min~15min，所述流动相A的体积分数由90%下降至10%；

15min~18min，所述流动相A的体积分数保持为10%；

18min~20min，所述流动相A的体积分数由10%升高至90%；

20min~25min，所述流动相A的体积分数保持为90%。

上述亚磷酸三苯酯的结构如下式所示：

。

本发明实施例一中检测方法的专属性及检测结果分析：

本发明实施例一中空白溶液、对照品溶液、供试品溶液、混合对照品溶液和专属性混合对照品溶液的高效液相色谱检测图谱如图1～5所示：

从图1中得知空白溶液无干扰。

从图2中得知对照品溶液所得色谱图中亚磷酸三苯酯峰的信噪比为43，不低于20，亚磷酸三苯酯的保留时间为16.136min（亚磷酸三苯酯的出峰位置）。

从图3中得知供试品溶液中未检出亚磷酸三苯酯（9.525min为丙酚替诺福韦出峰位置）；亚磷酸三苯酯出峰的位置（16min左右）空白里没有基线和峰出现，为无干扰。

从图4中得知专属性混合溶液中亚磷酸三苯酯峰与相邻峰之间的分离度大于1.5（16.142min为亚磷酸三苯酯出峰位置，9.525min为丙酚替诺福韦出峰位置，分离度为27.8），亚磷酸三苯酯与相邻峰之间的分离度大于1.5，说明实现了对亚磷酸三苯酯有效检测。专属性混合溶液中亚磷酸三苯酯峰与对照品溶液中亚磷酸三苯酯峰的保留时间一致，说明该方法专属性良好。

从图5中得知：亚磷酸三苯酯在200nm~400nm范围无明显的最大吸收波长，为末端吸收，在210nm处有较大吸收，且在该波长处基线较平滑，故选择210nm作为亚磷酸三苯酯的检测波长。

本发明实施例一中检测方法的线性与范围试验：

空白溶液：将乙腈和水按体积比为80：20混合，备用。

线性溶液：取亚磷酸三苯酯对照品适量，分别配制成一系列浓度的溶液，依照实施例中的色谱方法测定，测定结果见表1和图6。

表1 不同浓度亚磷酸三苯酯的峰面积测试结果及标准曲线

从表1中得知，亚磷酸三苯酯相对浓度为30%时的定量限溶液浓度为4.6842ng/mL；该亚磷酸三苯酯的浓度（4.6842ng/mL）相当于供试品溶液浓度的7.81ppm。说明该方法检测限度低。

相对浓度为30%、50%、80%、100%、150%和200%的6份定量限溶液中亚磷酸三苯酯峰的信噪比均在11~15范围内，保留时间的RSD（相对标准偏差）为0.026%，不大于1.0%，峰面积的RSD为1.9%，不大于10%；检测限溶液浓度为1.4052ng/mL，相当于供试品溶液浓度的2.34ppm；3针检测限溶液中亚磷酸三苯酯峰的信噪比均在4~5范围内。说明该方法灵敏度高。

亚磷酸三苯酯在4.6842ng/mL~31.2277ng/mL浓度范围内，线性方程为y =161.74x + 2.7116；回归曲线的回归系数R为0.9998，不低于0.990，响应因子的RSD为1.6%，小于10%，Y轴截距占100%响应值的0.07%，在25%以内，说明该方法在4.6842ng/mL~31.2277ng/mL浓度范围内测定杂质亚磷酸三苯酯具有良好的线性关系。

本发明实施例一中检测方法的回收率试验：

配制如下溶液：

空白溶液：将乙腈和水按体积比为80：20混合，备用。

对照品贮备液：精密称取杂质亚磷酸三苯酯对照品约12mg，置20mL量瓶中，用稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

20倍限度浓度对照品溶液：

（a）、精密量取对照品贮备液1.0mL置50mL量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，得稀释液；

（b）、再精密量取稀释液0.5mL至20mL量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。

供试品溶液：精密称取富马酸丙酚替诺福韦原料药供试品约12mg，置20mL量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。平行配制2份。

20倍30%回收率贮备液：精密量取20倍限度浓度对照品溶液6mL置20mL量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。

30%加样回收率溶液：精密称取富马酸丙酚替诺福韦原料药约12mg，置20mL量瓶中，精密加入20倍30%回收率贮备液1mL，用稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。平行配制3份。

加样回收率贮备液：即为20倍限度浓度对照品溶液。

100%加样回收率溶液：精密称取富马酸丙酚替诺福韦原料药约12mg，置20mL量瓶中，精密加入1.0mL加样回收率贮备液，用稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。平行配制3份。

150%加样回收率溶液：精密称取富马酸丙酚替诺福韦原料药约12mg，置20mL量瓶中，精密加入1.5mL加样回收率贮备液，用稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。平行配制3份。

精密量取上述溶液各30μL，分别注入液相色谱仪，依照本实施例中的高效液相色谱方法检测，计算回收率，回收率测试结果如表2所示。

表2 本发明实施例一检测方法的回收率测试结果

从表2中得知，往供试品中加入浓度范围为4.6842ng/mL～23.4208ng/mL的9份亚磷酸三苯酯溶液，回收率在97.7%～102.1%， 回收率RSD为1.4%，小于10%，符合2020版中国药典第四部通则9101规定（回收率在80%～115%之间），说明该方法准确度高。

本发明实施例一中检测方法的重复性试验：

溶液配制：

空白溶液：将乙腈和水按体积比为80：20混合，备用。

按照步骤S1中对照品贮备液、20倍限度对照品溶液和对照品溶液的配制方法，再次配制杂质亚磷酸三苯酯对照品贮备液、亚磷酸三苯酯20倍限度浓度对照品溶液和亚磷酸三苯酯对照品溶液。

重复性供试品溶液：取富马酸丙酚替诺福韦原料药12±1.2mg，精密称定，置20mL量瓶中，加适量稀释剂超声溶解，精密加入20倍限度亚磷酸三苯酯对照品溶液1mL至该量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。平行配制6份。

精密量取上述溶液各30μL，分别注入液相色谱仪，依照本实施例中的高效液相色谱方法检测，计算重复性，重复性测试结果见表3。

表3 本发明实施例一中检测方法的重复性试验测试结果

从表3中得知，6份加限度浓度亚磷酸三苯酯的重复性供试品溶液中亚磷酸三苯酯含量的RSD为0.9%，不大于6%，说明该方法检测亚磷酸三苯酯重复性好。

本发明实施例一中检测方法的稳定性试验：

常温（约25℃）条件下，将亚磷酸三苯酯对照品溶液放置8小时，分别于0h、1h、2h、3h、5h、6h、8h进行测定，结果显示亚磷酸三苯酯峰面积的RSD均小于10%，说明对照品溶液在常温下放置8h是稳定的。

常温条件下，将供试品溶液放置10小时，分别于0h、1h、2h、3h、5h、8h、10h进行测定，结果显示供试品溶液中，均未检出亚磷酸三苯酯，且没有新的干扰亚磷酸三苯酯检出的杂质峰检出，说明供试品溶液在常温下放置10h是稳定的。

通过对基因毒性杂质亚磷酸三苯酯的检测方法的波长选择、系统适用性、专属性、定量限与检测限、线性与范围、准确度、精密度、溶液稳定性和耐用性等九个方面进行了验证，试验结果表明该方法的适用性良好，可用于基因毒性杂质亚磷酸三苯酯的测定。

对色谱参数条件中的流速、柱温以及色谱柱批次进行微小改变时，对照品溶液色谱图中亚磷酸三苯酯峰信噪比均不低于20，系统适用性均符合要求，各测试条件下测试加限度浓度亚磷酸三苯酯的供试品溶液，亚磷酸三苯酯含量的RSD均不大于10%。说明该方法耐用性好。

本发明的实施例二为：一种富马酸丙酚替诺福韦中基因毒性杂质的检测方法，与实施例一的差异在于：

流动相A为：质量分数为0.3%磷酸溶液。

本发明的实施例三为：一种富马酸丙酚替诺福韦中基因毒性杂质的检测方法，与实施例一的差异在于：

梯度洗脱采用如下方式：

0min~5min，所述流动相A的体积分数为60%；

5min~15min，所述流动相A的体积分数由60%下降至20%；

15min~18min，所述流动相A的体积分数保持为20%；

18min~20min，所述流动相A的体积分数由20%升高至60%；

20min~25min，所述流动相A的体积分数保持为60%。

本发明实施例二中亚磷酸三苯酯的信噪比有25，略大于20，实施例三中亚磷酸三苯酯基线不平，信噪比仅有13，低于20，与实施例一处相比灵敏度略差。

综上所述，本发明通过高效液相色谱对成品富马酸丙酚替诺福韦原料药中基因毒性杂质亚磷酸三苯酯进行了检测；实现了对基因毒性杂质亚磷酸三苯酯的质量控制；本发明的检测方法检测限度低（4.6842ng/mL）。

以上结合说明书及附图内容对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

Claims (9)

1.一种富马酸丙酚替诺福韦中基因毒性杂质的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：

S1、取供试品配制供试品溶液；

S2、高效液相色谱检测；

所述高效液相色谱检测包括如下条件：

流动相A：磷酸溶液；

流动相B：乙腈；

洗脱方式：梯度洗脱；

所述富马酸丙酚替诺福韦中基因毒性杂质为亚磷酸三苯酯；

所述梯度洗脱的程序方式为：

0min~5min，所述流动相A在流动相A和流动相B中的体积分数为60%~90%；

5min~15min，所述流动相A在流动相A和流动相B中的体积分数由60%~90%下降至10%~20%；

15min~18min，所述流动相A在流动相A和流动相B中的体积分数保持为10%~20%；

18min~20min，所述流动相A在流动相A和流动相B中的体积分数由10%~20%升高至60%~90%；

20min~25min，所述流动相A在流动相A和流动相B中的体积分数保持为60%~90%。

2.根据权利要求1所述的一种富马酸丙酚替诺福韦中基因毒性杂质的检测方法，其特征在于：所述高效液相色谱检测中的色谱柱包括十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱。

3.根据权利要求1所述的一种富马酸丙酚替诺福韦中基因毒性杂质的检测方法，其特征在于：所述磷酸溶液的质量浓度为0.05%~0.3%。

4.根据权利要求1所述的一种富马酸丙酚替诺福韦中基因毒性杂质的检测方法，其特征在于：所述高效液相色谱检测的检测器为紫外检测器；所述高效液相色谱检测的柱温为30℃~40℃。

5.根据权利要求1所述的一种富马酸丙酚替诺福韦中基因毒性杂质的检测方法，其特征在于：所述流动相A的流速为0.9mL/min~1.1 mL/min；所述流动相B的流速为0.9mL/min~1.1 mL/min。

6.根据权利要求1所述的一种富马酸丙酚替诺福韦中基因毒性杂质的检测方法，其特征在于：还包括以下步骤：

（a）、配制对照品贮备液：取对照品10.8mg~13.2mg用稀释剂溶解配制为20mL溶液，即得对照品贮备液；

（b）、配制20倍限度对照品贮备液：

（1）取对照品贮备液1.0mL用稀释剂配制为50mL溶液，得稀释液；

（2）再取稀释液0.5mL用稀释剂溶解配制为20mL溶液，即得20倍限度对照品贮备液；

（c）、配制对照品溶液：取20倍限度对照品贮备液1.0mL用稀释剂溶解配制为20mL溶液，即得对照品溶液。

7.根据权利要求6所述的一种富马酸丙酚替诺福韦中基因毒性杂质的检测方法，其特征在于：所述稀释剂包括乙腈水溶液。

8.根据权利要求1所述的一种富马酸丙酚替诺福韦中基因毒性杂质的检测方法，其特征在于：所述供试品包括富马酸丙酚替诺福韦原料药。

9.一种富马酸丙酚替诺福韦原料药的质量控制方法，其特征在于：包括通过如权利要求1至8任一项所述的检测方法对富马酸丙酚替诺福韦原料药中的亚磷酸三苯酯进行检测。

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