CN113125626A - 一种从左乙拉西坦口服液中检测右旋异构体的hplc方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种从左乙拉西坦口服溶液中检测右旋异构体的HPLC方法，属于药物分析领域。该方法使用反相色谱系统，本发明通过选择合适的固定相和流动相，以及对色谱条件进行摸索和优化，优选出适合左乙拉西坦口服溶液中右旋异构体的检测方法，该方法中右旋异构体峰与主成分峰、防腐剂峰之间分离度均较好，检测的灵敏性和准确性较高。

Description

一种从左乙拉西坦口服液中检测右旋异构体的HPLC方法

技术领域

本发明属于药物分析领域，具体涉及一种从左乙拉西坦口服液中检测右旋异构体的HPLC方法。

背景技术

左乙拉西坦(Levetiracetam)，别名乐凡替拉西坦、利维西坦、左旋乙拉西坦，是一种白色结晶粉末的化学品。化学名称(S)-α-乙基-2-氧代-1-吡咯烷乙酰胺，分子式为C₈H₁₄N₂ O₂，分子量为170.21。左乙拉西坦为抗癫痫药，是一种吡咯烷酮衍生物，具有广谱、起效迅速，耐受性和安全性好等特点，临床上主要用于成人及4岁以上儿童癫痫患者难治愈部分性发作的辅助治疗。

左乙拉西坦口服溶液的有效成分为左乙拉西坦，是一个手性化合物。其R-异构体右乙拉西坦为工艺杂质和降解杂质，对于抑制癫痫作用不明，因此对右乙拉西坦进行质量控制是保证左乙拉西坦药物质量的关键。

左乙拉西坦口服溶液的标准收载于美国药典USP40及我国进口药品注册标准(开浦兰JX20060085)。左乙拉西坦原料药则在多国药典中均有收载，如USP40、EP9.0；左乙拉西坦注射液标准收载于USP40，左乙拉西坦片标准收载于USP40。其中，JX20060085标准中规定口服溶液中右乙拉西坦的限度为0.8％。

目前，各国药品标准中对右乙拉西坦的检测方法均无明显区别，采用的都是正相色谱系统，流动相大多为正己烷和醇的体系，色谱柱大多为硅胶表面涂敷有直链淀粉三-3，5二甲基苯基氨基甲酸酯的手性色谱柱，该类色谱柱不能接触水，若用于左乙拉西坦口服溶液检测，会导致色谱柱柱效快速下降。

查阅资料发现，目前已发表的文章或专利有介绍左乙拉西坦片、注射剂、原料药中右乙拉西坦的检测方法，尚没有关于左乙拉西坦口服溶液中右乙拉西坦的检测。CN109765316A公开了一种从药物中检测右乙拉西坦的方法，采用Chiralpak IC色谱柱，以正己烷∶无水乙醇为流动相检测右乙拉西坦；文献《HPLC法测定左乙拉西坦片的右旋异构体》采用Chiralpak AD-H色谱柱，以正己烷-无水乙醇为流动相测定左乙拉西坦片的右旋异构体；文献《HPLC法测定左乙拉西坦右旋异构体及其原料药含量》采用Chiralcel OD-H柱，以正己烷-异丙醇为流动相测定左乙拉西坦原料药中右旋异构体。这些检测方法均采用正相色谱系统，在实际情况中常需要将仪器系统置换后使用，处理过程繁琐且所使用的色谱试剂成本相对较高。

CN112415123A公开一种左乙拉西坦原料或氯化钠注射液中左乙拉西坦对映异构体的反相色谱检测方法，采用Chiralpak AGP色谱柱，以20mmol/L磷酸盐缓冲液为流动相；文献《HPLC测定左乙拉西坦氯化钠注射液中异构体的含量》采用Chiralpak IE色谱柱，以10mmol/L乙酸铵水溶液-无水乙醇为流动相的反相色谱。但由于口服液中含有大量辅料如防腐剂等，申请人在使用这些文献方法进行左乙拉西坦口服液实际检测时，发现防腐剂如羟苯甲酯、羟苯丙酯等会对检测结果产生干扰，从而降低检测准确性。

发明内容

本发明的目的是提供一种从左乙拉西坦口服液中检测右旋异构体的HPLC方法，该方法使用反相色谱系统，通过选择合适的固定相和流动相，以及对色谱条件进行摸索和优化，从而实现左乙拉西坦口服溶液中右旋异构体的准确检测。

上述目的是通过以下技术方案实现的：

一种从左乙拉西坦口服液中检测右旋异构体的HPLC方法，该方法为，采用多糖衍生物反相涂敷型手性色谱柱为固定相，0.1mol/L六氟磷酸钠溶液和乙腈的混合溶液为流动相对右乙拉西坦进行HPLC测定，液相色谱的检测条件包括：

0.1mol/L六氟磷酸钠溶液∶乙腈＝70～80∶30～20，流动相采用等度洗脱；

流动相流速为0.5～0.7ml/min；

柱温为25～35℃；

检测器采用紫外检测器，检测波长为200～210nm。

优选地，所述多糖衍生物反相涂敷型手性色谱柱为纤维素-三(4-甲基苯甲酸酯)键合硅胶柱。

优选地，所述0.1mol/L六氟磷酸钠溶液∶乙腈＝75∶25。

优选地，所述0.1mol/L六氟磷酸钠溶液中含有0.1％三乙胺，并用磷酸调pH为5.5。

优选地，所述色谱柱规格：150mm×4.6mm，5μm。

优选地，所述流动相流速为0.6ml/min。

优选地，所述柱温为30℃。

优选地，所述检测波长为205nm。

本发明的有益效果是：

(1)与正相系统相比，反相色谱系统具有色谱介质性能稳定，分离能力强，操作过程简单等优点。

(2)本发明能排除口服溶液制剂中防腐剂对检测对象的干扰，提高检测结果的准确性。

(3)本发明可直接将口服溶液稀释后检测，无需对样品进行前处理，尤其适合口服溶液中右乙拉西坦的检测。

(4)本发明实现了左乙拉西坦及其异构体的有效分离，在检测杂质右乙拉西坦的同时也能对主药进行含量测定，具有很好的实用性。

(5)本发明对右乙拉西坦的检测范围3.11μg/ml～77.84μg/ml，检测限达到0.0031％，定量限达到0.0124％，具有很高的灵敏性和准确性，能很好地控制药品质量。

附图说明

图1是本发明色谱条件下系统适用性的检测图谱。

图2是以Chiralpak AGP手性色谱柱，20mmol/L磷酸盐缓冲液(氨水调pH至5.0)为流动相，得到的系统适用性的检测图谱。

图3是以Chiralpak IE(250mm×4.6mm，5μm﹚手性色谱柱，10mmol/L乙酸铵水溶液：无水乙醇＝80：20为流动相，得到的系统适用性的检测图谱。

图4是以Chiralcel OD-RH(150mm×4.6mm，5μm)手性色谱柱，0.1mol/L六氟磷酸钠溶液∶乙腈＝75：25为流动相，得到的系统适用性的检测图谱。

图5是以Chiralcel OJ-RH(150mm×4.6mm，5μm)手性色谱柱，20mmol/L磷酸盐缓冲液(氨水调pH至5.0)为流动相，得到的系统适用性的检测图谱。

图6是以Chiralcel OJ-RH(150mm×4.6mm，5μm)手性色谱柱，10mmol/L乙酸铵水溶液：无水乙醇＝80：20为流动相，得到的系统适用性的检测图谱。

图7是本发明色谱条件下空白溶剂的检测图谱。

图8是本发明色谱条件下空白辅料的检测图谱。

图9是本发明色谱条件下右乙拉西坦对照品的检测图谱。

图10是本发明色谱条件下左乙拉西坦定位的检测图谱。

图11是本发明色谱条件下羟苯甲酯定位的检测图谱。

图12是本发明色谱条件下羟苯丙酯定位的检测图谱。

图13是右乙拉西坦线性回归方程图。

图14是本发明色谱条件下供试品的检测图谱。

具体实施方式

实施例1不同反向色谱方法的检测效果试验

色谱条件：

(1)Chiralcel OJ-RH(150mm×4.6mm，5μm)硅胶表面涂敷有纤维素-三(4-甲基苯甲酸酯)的手性色谱柱

流动相：0.1mol/L六氟磷酸钠溶液(称取六氟磷酸钠16.8g，加水1L溶解，加入1mL三乙胺，再用磷酸调pH至5.5)∶乙腈＝75：25

(2)Chiralpak AGP(150mm×4mm，5μm)硅胶表面共价键合有ɑ1-酸性糖蛋白的蛋白质键合型手性色谱柱

流动相：20mmol/L磷酸盐缓冲液(称取磷酸二氢钾2.7g，加水1L溶解，再用氨水调pH至5.0)

(3)Chiralpak IE(250mm×4.6mm，5μm﹚硅胶表面共价键合有直链淀粉-三(3,5-二氯苯基氨基甲酸酯)的耐溶剂型手性色谱柱

流动相：10mmol/L乙酸铵水溶液(称取乙酸铵0.77g，加水1L溶解﹚：无水乙醇＝80：20

色谱仪器：Agilent 1260高效液相色谱仪

检测器及波长：UV-205

流速：0.6ml/min

柱温：30℃

进样量：20μl

稀释液：流动相。

系统适用性溶液：取左乙拉西坦对照品、右乙拉西坦对照品、羟苯甲酯对照品与羟苯丙酯对照品各适量，加乙腈溶解并稀释制成每1ml中含左乙拉西坦、右乙拉西坦各20μg与羟苯甲酯、羟苯丙酯各2μg的混合溶液。

色谱图如图1、2、3所示。

结论：在色谱方法(1)下，羟苯丙酯、羟苯甲酯、右乙拉西坦、左乙拉西坦依次出峰，分离良好，峰形良好，右乙拉西坦保留适中(图1)；色谱方法(2)下，羟苯甲酯与右乙拉西坦未有效分离(图2)；色谱方法(3)下，峰形差，信号响应低(图3)。

实施例2不同固定相的检测效果试验

(1)Chiralcel OJ-RH(150mm×4.6mm，5μm)硅胶表面涂敷有纤维素-三(4-甲基苯甲酸酯)的手性色谱柱

(2)Chiralcel OD-RH(150mm×4.6mm，5μm)硅胶表面涂敷有纤维素-三(3，5-二甲苯基氨基甲酸酯)的手性色谱柱

色谱仪器：Agilent 1260高效液相色谱仪

流动相：0.1mol/L六氟磷酸钠溶液(称取六氟磷酸钠16.8g，加水1L溶解，加入1mL三乙胺，再用磷酸调pH至5.5)∶乙腈＝75：25

检测器及波长：UV-205

流速：0.6ml/min

柱温：30℃

进样量：20μl

稀释液：流动相。

系统适用性溶液：同实施例1。

色谱图如图1、4所示。

结论：在色谱柱(1)条件下，羟苯丙酯、羟苯甲酯、右乙拉西坦、左乙拉西坦依次出峰，分离良好，峰形良好，右乙拉西坦保留适中(图1)；色谱柱(2)条件下，右乙拉西坦峰形较差，有肩峰，且与羟苯甲酯峰分离度小(图4)。

实施例3不同流动相的检测效果试验

色谱条件：

(1)流动相：0.1mol/L六氟磷酸钠溶液(称取六氟磷酸钠16.8g，加水1L溶解，加入1mL三乙胺，再用磷酸调pH至5.5)∶乙腈＝75:25

(2)流动相：20mmol/L磷酸盐缓冲液(称取磷酸二氢钾2.7g，加水1L溶解，再用氨水调pH至5.0)

(3)流动相：10mmol/L乙酸铵水溶液(称取乙酸铵0.77g，加水1L溶解﹚：无水乙醇＝80：20

色谱仪器：Agilent 1260高效液相色谱仪

色谱柱：Chiralcel OJ-RH(150mm×4.6mm，5μm)

检测器及波长：UV-205

流速：0.6ml/min

柱温：30℃

进样量：20μl

稀释液：流动相。

系统适用性溶液：同实施例1。

色谱图如图1、5、6所示。

结论：在流动相(1)条件下，羟苯丙酯、羟苯甲酯、右乙拉西坦、左乙拉西坦依次出峰，分离良好，峰形良好，右乙拉西坦保留适中(图1)；流动相(2)条件下，左乙拉西坦的出峰时间晚于右乙拉西坦的出峰时间，左乙拉西坦与其R-异构体右乙拉西坦可有效分离，但主成分左乙拉西坦和羟苯甲酯重合在一起，不能有效分离(图5)；流动相(3)条件下，各峰分离良好，但与流动相(1)条件下相比峰形较差(图6)。

实施例4方法学考察

本发明初步建立了右乙拉西坦分析方法的色谱条件，检测结果表明，可以将右乙拉西坦与主药、防腐剂有效分离，下面进一步进行检测方法学考察。

色谱条件：

色谱仪器：Agilent 1260高效液相色谱仪

色谱柱：Chiralcel OJ-RH(150mm×4.6mm，5μm)

流动相：0.1mol/L六氟磷酸钠溶液(称取六氟磷酸钠16.8g，加水1L溶解，加入1mL三乙胺，再用磷酸调pH至5.5)∶乙腈＝75:25

柱温：30℃

检测器及波长：UV-205

流速：0.6ml/min

进样量：20μl

(1)系统适用性和专属性

系统适用性溶液：取左乙拉西坦对照品、右乙拉西坦对照品、羟苯甲酯对照品与羟苯丙酯对照品各适量，加流动相溶解并稀释制成每1ml中含左乙拉西坦、右乙拉西坦各20μg与羟苯甲酯、羟苯丙酯各2μg的混合溶液，作为系统适用性溶液。

空白溶剂：同流动相。

空白辅料储备液：按照处方量配制不含左乙拉西坦原料药的空白溶液。

空白辅料溶液：精密量取空白辅料储备液5ml，置20ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，量取续滤液1ml，置10ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，滤过即得。

右乙拉西坦对照品溶液：精密称取右乙拉西坦对照品适量，用流动相溶解并稀释制成每1ml约含20μg的溶液，作为对照品溶液。

左乙拉西坦定位溶液：取左乙拉西坦对照品对照品适量，加流动相溶解并稀释制成每1ml中含左乙拉西坦100μg的溶液，作为定位溶液。

羟苯甲酯定位溶液：取羟苯甲酯对照品适量，加流动相溶解并稀释制成每1ml中含羟苯甲酯100μg的溶液，作为定位溶液。

羟苯丙酯定位溶液：取羟苯丙酯对照品适量，加流动相溶解并稀释制成每1ml中含羟苯丙酯各100μg的溶液，作为定位溶液。

取上述溶液20μl注入液相色谱仪，记录色谱图。色谱图如图1、7、8、9、10、11、12所示，系统适用性结果见表1。

表1系统适用性结果

名称	保留时间(min)	分离度	理论板数	拖尾因子
					羟苯丙酯	5.052	--	2754	1.25
羟苯甲酯	6.729	3.06	4758	1.33
					右乙拉西坦	8.560	3.20	3314	1.29
左乙拉西坦	11.582	4.29	3047	1.04

结果显示，系统适用性溶液中，右乙拉西坦保留适中，与相邻峰的分离度均大于1.5，分离良好。空白溶剂和空白辅料对测定无干扰。

(2)线性及范围

在该色谱条件下，以右乙拉西坦的限度浓度(20μg/ml)作为线性中间浓度，各浓度点的设置分别为16％、40％、80％、100％、200％和400％。配制稀释成浓度分别为3.11μg/ml、7.78μg/ml、15.57μg/ml、19.46μg/ml、38.92μg/ml、77.84μg/ml的右乙拉西坦对照品线性溶液，精密量取各线性溶液20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，对左乙拉西坦对映异构体的浓度和峰面积作图，如图13所示，结果表明，右乙拉西坦在3.11μg/ml～77.84μg/ml浓度范围内，与峰面积响应均呈现良好的线性关系，线性方程为y＝23925.5619x+9555.6555，相关系数r＝0.9996。(限度浓度的计算：拟定主成分浓度为2.5mg/ml，右乙拉西坦的限度为0.8％。)

(3)检测限和定量限

取线性试验项下的右乙拉西坦对照品溶液，逐级定量稀释配制成定量限浓度(信噪比S/N约为10)溶液和检测限浓度(信噪比S/N约为3)溶液，平行进样2针。结果右乙拉西坦的定量限浓度为0.311μg/ml(相当于供试品溶液浓度的0.0124％)，检测限浓度为0.078μg/ml(相当于供试品溶液浓度的0.0031％)，均远远小于右乙拉西坦的限度浓度(20μg/ml)，表明该方法的检测灵敏度较高。

(4)精密度

a.进样精密度试验

取线性试验项下浓度为19.46μg/ml的右乙拉西坦对照品溶液，连续进样6针，计算峰面积的RSD，考察系统的进样精密度，结果显示，进样6针，右乙拉西坦峰面积的RSD为0.98％，表明该系统的进样精密度良好。

b.重复性试验

供试品溶液：取左乙拉西坦口服溶液(批号：20160701)5ml，置20ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，量取续滤液1ml，置10ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液，平行制备6份。结果显示，6份供试品溶液中，右乙拉西坦的测定结果一致，均未检出，说明本方法的重复性良好。

c.中间精密度试验

由不同分析人员使用不同仪器在不同的日期，对相同批次样品6份供试品溶液进行检测，方法同“重复性试验”项下。结果显示，12份供试品溶液中，均未检出右乙拉西坦，表明本方法的中间精密度良好。

(5)准确度

采用标准加入法(往供试品溶液中加入右乙拉西坦)对左乙拉西坦口服溶液(批号：20160701)测定回收率，选择右乙拉西坦50％、100％(限度浓度20μg/ml)和150％三个浓度水平进行试验，每种浓度分别制备3份供试品溶液，用9份样品的测定结果进行评价。回收率＝(测得量-已有量)/加入量。

右乙拉西坦在不同浓度水平的加样回收率在97.1％～100.4％之间，组间回收率平均值为98.9％，RSD为1.11％，符合要求。表明此方法用于测定左乙拉西坦口服溶液中的右乙拉西坦，准确度良好。

(6)耐用性

通过考察色谱参数的微小变化，对该方法进行耐用性试验。具体色谱参数见表2。

表2耐用性试验的色谱参数

结果表明，不同柱温、流速检测波长、流动相pH及流动相比例的微小变化，系统适用性溶液中右乙拉西坦的保留时间、理论塔板数、拖尾因子、峰面积、与相邻峰的分离度等均无明显影响，均能满足检测要求。

综上所述，本发明检测方法的系统适用性和专属性、线性和范围、检测限和定量限、精密度、准确度和耐用性均符合要求，证明该本发明检测方法适合用于右乙拉西坦的检测。方法学考察结果总结见表3。

表3左乙拉西坦口服溶液中右乙拉西坦分析方法验证总结

实施例5左乙拉西坦口服溶液样品检测

采用本发明的方法对6批左乙拉西坦口服溶液中试样品(批号：20160701、20160702、20160703、20180301、20180302、20180303)中R-异构体右乙拉西坦进行检测，并按外标法计算，结果显示中试6批样品均未检出右旋异构体，符合规定，测定结果详见表4。

表4中试样品测定结果

自制药批号	右乙拉西坦
		20160701	未检出
20160702	未检出
		20160703	未检出
20180301	未检出
		20180302	未检出
20180303	未检出

Claims (8)

1.一种从左乙拉西坦口服液中检测右旋异构体的HPLC方法，其特征在于：采用多糖衍生物反相涂敷型手性色谱柱为固定相，0.1mol/L六氟磷酸钠溶液和乙腈的混合溶液为流动相对右乙拉西坦进行HPLC测定，液相色谱的检测条件包括：

0.1mol/L六氟磷酸钠溶液∶乙腈＝70～80∶30～20，流动相采用等度洗脱；

流动相流速为0.5～0.7ml/min；

柱温为25～35℃；

检测器采用紫外检测器，检测波长为200～210nm。

2.如权利要求1所述从左乙拉西坦口服液中检测右旋异构体的HPLC方法，其特征在于：所述多糖衍生物反相涂敷型手性色谱柱为纤维素-三(4-甲基苯甲酸酯)键合硅胶柱。

3.如权利要求1所述从左乙拉西坦口服液中检测右旋异构体的HPLC方法，其特征在于：所述0.1mol/L六氟磷酸钠溶液∶乙腈＝75∶25。

4.如权利要求1所述从左乙拉西坦口服液中检测右旋异构体的HPLC方法，其特征在于：所述0.1mol/L六氟磷酸钠溶液中含有0.1％三乙胺，并用磷酸调pH为5.5。

5.如权利要求1所述从左乙拉西坦口服液中检测右旋异构体的HPLC方法，其特征在于：所述色谱柱规格：150mm×4.6mm，5μm。

6.如权利要求1所述从左乙拉西坦口服液中检测右旋异构体的HPLC方法，其特征在于：所述流动相流速为0.6ml/min。

7.如权利要求1所述从左乙拉西坦口服液中检测右旋异构体的HPLC方法，其特征在于：所述柱温为30℃。

8.如权利要求1所述从左乙拉西坦口服液中检测右旋异构体的HPLC方法，其特征在于：所述检测波长为205nm。

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