CN103336067A - 一种检测替诺福韦二乙酯含量的高效液相检测方法 - Google Patents

一种检测替诺福韦二乙酯含量的高效液相检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种检测替诺福韦二乙酯含量的高效液相检测方法，其技术要点包括如下步骤：（1）先通过色谱柱、柱温、检测波长及流动相来确定色谱条件；（2）供试品及对照品溶液的制备；（3）测定方法则采用分别精密量取对照品溶液和供试品溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算；供试品溶液主峰与对照品溶液主峰的保留时间一致，而实现本发明。本发明的优点在于：建立了一种用于测定富马酸替诺福韦酯中间体替诺福韦二乙酯含量的高效液相检测方法。本检测方法可准确测定替诺福韦二乙酯含量；本法灵敏度高专属性强；可有效检测替诺福韦二乙酯含量，控制泰诺福韦替诺福韦二乙酯质量，以合成质量合格的富马酸替诺福韦酯。

Description

一种检测替诺福韦二乙酯含量的高效液相检测方法
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种检测替诺福韦二乙酯含量的高效液相检测方法。
背景技术
富马酸替诺福韦酯是一种新型核苷酸类逆转录酶抑制剂。其活性成分替诺福韦双磷酸盐可通过直接竞争性地与天然脱氧核糖底物相结合而抑制病毒聚合酶，也可以插人DNA中终止链，故其可以与核苷类逆转录酶抑制剂类似的方法抑制逆转录酶，从而具有潜在的抗HIV-1活性。替诺福韦是美国吉利德(Gilead)公司开发上市的一种核苷酸类抗病毒药。2001年经美国FDA批准用于治疗人免疫缺陷病毒（HIV）的感染。由于治疗效果确切，适用性好，剂量合适，是多个治疗指南推荐使用的一线抗HIV药物。因此，富马酸替诺福韦酯作为替诺福韦酯的前体物在抗艾滋病药物市场具有巨大的前景与市场。
替诺福韦二乙酯是制备富马酸替诺福韦酯的中间体，很多公司也将其作为制备富马酸替诺福韦酯的起始原料。目前，仅有美国药典论坛上记载了用于富马酸替诺福韦酯质量检测的方法，但此方法不能对替诺福韦二乙酯进行有效检测，而国内外也未见用于有效检测替诺福韦二乙酯的方法。因此，建立准确检测替诺福韦二乙酯含量的方法具有非常重要的意义。
发明内容
本发明提供了一种用于检测替诺福韦二乙酯含量的高效液相检测方法，该方法通过高效液相的方法测定富马酸替诺福韦酯中间体替诺福韦二乙酯的含量，该方法简便、专属、准确，适用于工业化生产的中间体快速检测。
本发明的目的是这样实现的：1、一种检测替诺福韦二乙酯含量的高效液相检测方法，其特征在于该检测方法包括如下步骤：
（1）色谱条件
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；
柱温：20-40℃；
检测波长：262nm；
流动相：醋酸盐缓冲液和有机相组成；
所述流动相中醋酸盐缓冲液的浓度为0.01-0.02mol/L，pH 为3.6~4.0，有机相为甲醇或乙腈；所述醋酸盐缓冲液与有机相的体积比为9-33:11；
（2）供试品及对照品溶液的制备：取供试品，精密称定，加流动相制成0.15mg/ml的溶液，作为供试品溶液；另取替诺福韦二乙酯物对照品，精密称定，同法制备，作为对照品溶液；
   （3）测定方法：分别精密量取对照品溶液和供试品溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算；供试品溶液主峰与对照品溶液主峰的保留时间一致；
计算公式：
Figure 201310206133X100002DEST_PATH_IMAGE001
CX为供试品的含量，   
  CR为对照品的含量，
AX为供试品的峰面积，
AR为对照品的峰面积，
WX为供试品的称样量，单位：mg，
WR为对照品的称样量，单位：mg。
由上所述，醋酸盐缓冲液为醋酸铵、醋酸钠缓冲液；所述的醋酸盐缓冲液的pH为3.8；所述流动相中醋酸盐缓冲液与有机相的体积比为65:35。
与现有技术相比，本发明的优点在于：建立了一种用于测定富马酸替诺福韦酯中间体替诺福韦二乙酯含量的高效液相检测方法。本检测方法可准确测定替诺福韦二乙酯含量；本法灵敏度高专属性强，定量限可达0.04μg/ml；可有效检测替诺福韦二乙酯含量，控制泰诺福韦替诺福韦二乙酯质量，以合成质量合格的富马酸替诺福韦酯。
附图说明
附图1是替诺福韦酯二乙脂色谱图。
具体实施方式
下面将通过实例对发明作进一步详细说明，但下述的实例仅仅是本发明其中的例子而已，并不代表本发明所限定的权利保护范围，本发明的权利保护范围以权利要求书为准。
实施例1
1 色谱条件的选择
1.1检测波长的选择  
取替诺福韦二乙酯适量，加流动相溶解并稀释制成0.15mg/ml溶液。由附图1中的DAD图谱显示，替诺福韦二乙酯在262nm有最大吸收，故选择262nm为检测波长。
1.2 色谱柱的选择  
选择十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱两种反相色谱柱。不同反相色谱柱的保留行为见表1。
 
Figure DEST_PATH_IMAGE002
结果显示，采用十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱均可用于测方法检测。
1.3 柱温的选择
对高效液相色谱法常用的柱温进行考察，结果见表2。
结果显示，主峰保留时间随柱温的升高而缩短，分离度均合格，含量检测结果正常。故在柱温为20-40℃时，均可以达到检测效果。
1.4流动相的选择
1.4.1缓冲液中不同盐浓度的选择
对不同浓度醋酸盐缓冲液进行考察，结果见表3。
Figure DEST_PATH_IMAGE004
结果显示，醋酸盐浓度较低时，色谱峰不稳定；而浓度较高时，峰形较差，分离度不高。在醋酸盐缓冲液浓度为0.01M-0.02 M的条件下都可以进行分析。但考虑到缓冲盐浓度过高，容易从流动相中析出，有可能损伤色谱柱和仪器。故优选醋酸盐缓冲液浓度为0.01M。
1.4.2 醋酸盐缓冲液pH的选择   对醋酸盐缓冲液的不同pH进行考察，结果见表4。
Figure DEST_PATH_IMAGE005
结果显示，在缓冲液pH为3.6-4.0替诺福韦二乙酯拖尾因子及分离度均符合要求，当pH为3.8时，效果最好。
1.4.3流动相中有机相的选择 
对醋酸盐缓冲液-甲醇和醋酸盐缓冲液-乙腈两种色谱条件进行考察，结果见表5。
Figure DEST_PATH_IMAGE006
结果显示，甲醇和乙腈作为有机相均可以达到分离效果。
1.4.4 流动相中不同成分配比的选择  通过筛查，固定流动相中成分为醋酸盐和甲醇，对流动相中不同成分配比进行考察，结果见表6。
Figure DEST_PATH_IMAGE007
结果显示，曾试验用0.01M醋酸盐缓冲液与甲醇调整不同的配比，如配比为:55:45时的流动相，但均存在峰型差，分离度低，本发明最终以pH为3.8的0.01M醋酸盐缓冲液（醋酸调pH为3.8）：甲醇为65:35为流动相进样测定，结果表明样品HPLC色谱图峰型对称性、理论板数及与杂质的分离度均较好。
实施例2
方法学的建立
2.1专属性   因杂质不能获得，采用氧化、酸、碱破坏方法，目的看杂质与主成分分离度是否符合要求，结果表明在采取加速破坏情况下主峰与杂质的分离度均符合要求，主峰纯度均达99.9%以上，理论塔板数按替诺福韦二乙酯计算为2000。
2.2线性范围  取替诺福韦二乙酯对照品适量，精密称定，加流动相溶解并稀释成1ml含1.41mg的溶液作为标准储备液。精密量取标准储备液0.5、0.8、1.0、1.3、1.5、1.8、2.1ml分别置于7个10ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，分别进样20μl，记录色谱图，以替诺福韦二乙酯（c，mg·ml﹣1）为横坐标，对应峰面积为纵坐标，进行线性回归，得回归方程为：Y=8e+06X+78168  r2=0.9994（n=7）。结果表明替诺福韦二乙酯溶液在0.07mg/ml—0.3mg/ml范围内呈线性，峰面积与浓度线性关系良好。
2.3回收率  精密称取已知含量的替诺福韦二乙酯样品约3-4mg（六份），分别置6个50ml量瓶中，再精密称取替诺福韦二乙酯对照品36.21mg置500ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，为对照品溶液，用对照品溶液分别稀释并定容替诺福韦二乙酯样品（六份,即每份加入对照品量为3.62mg），分别进样20μl、测定，计算回收率，得平均回收率为99.9%，RSD=0.95，说明准确度良好，见表7。
2.4样品溶液稳定性考察 供品溶液1份，分别在0-6h进行测定，记录峰面积，计算得RSD=0.19%，表明替诺福韦二乙酯的流动相溶液稳定性较好，日内误差较小。见表8。
 
Figure DEST_PATH_IMAGE009
2.5定量限测定  替诺福韦二乙酯对照品适量，加流动相制成一定浓度的替诺福韦二乙酯溶液，照样品含量测定条件进样，记录色谱图，定量限为0.04μg/ml（10倍信噪比）。
2.6 耐用性
2.6.1不同色谱柱测定
选用两根不同的色谱柱，分别进行供试品的分离度及含量测定，未发现对测定结果有影响。
Figure DEST_PATH_IMAGE010
2.6.2流动相配比改变
适当改变流动相配比，对本品进行测定，未发现对测定结果有影响，未发现对测定结果有影响。
Figure DEST_PATH_IMAGE011
2.6.3流动相pH值改变
适当改变流动相pH值，对本品进行测定，未发现对测定结果有影响，未发现对测定结果有影响。
结果显示，采用高效液相色谱法按上述条件测定替诺福韦二乙酯的含量及与主杂质峰的分离度，经验证方法准确可行，能够较好地控制本品的质量。
实施例2 替诺福韦二乙酯样品含量的测定
色谱条件：
（1）色谱柱： Inertsil ODS-3柱（250mm4.6, 5μm）；
柱温：20-40℃；
检测波长：262nm 
流速：1.0ml/min；
流动相：0.01 mol/L醋酸铵缓冲液：甲醇=65:35， pH=3.8；
（2）供试品及对照品溶液的制备：取供试品，精密称定25.21mg，加流动相制成0.15mg/ml的溶液，作为供试品溶液；另取替诺福韦二乙酯物对照品（含量98.1%），精密称定26.56mg，同法制备，作为对照品溶液。
（3）测定方法：分别精密量取对照品溶液和供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算；供试品溶液主峰与对照品溶液主峰的保留时间一致。
（4）计算结果
   AX  =7695703；AR  =8102387（n=5；RSD=0.22%）；
 
Figure DEST_PATH_IMAGE013
                       
实施例3  
  （1）色谱柱： Inertsil ODS-3柱（250mm4.6, 5μm）；
柱温：20-40℃；
检测波长：262nm 
流速：1.0ml/min；
流动相：0.01 mol/L醋酸铵缓冲液：乙腈=45:55， pH=3.6；
（2）供试品及对照品溶液的制备：取供试品，精密称定22.68mg，加流动相制成0.15mg/ml的溶液，作为供试品溶液；另取替诺福韦二乙酯物对照品（含量98.1%），精密称定23.90mg，同法制备，作为对照品溶液。
（3）测定方法：分别精密量取对照品溶液和供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算；供试品溶液主峰与对照品溶液主峰的保留时间一致。
AX=7986315 ；AR= 8415772（n=5；RSD=0.22%）
Figure DEST_PATH_IMAGE014
实施例4 
（1）色谱柱： Inertsil ODS-3柱（250mm4.6, 5μm）；
柱温：20-40℃；
检测波长：262nm 
流速：1.0ml/min；
流动相：0.01 mol/L醋酸铵缓冲液：乙腈=75:25， pH=4.0；
（2）供试品及对照品溶液的制备：取供试品，精密称定27.70mg，加流动相制成0.15mg/ml的溶液，作为供试品溶液；另取替诺福韦二乙酯物对照品（含量98.1%），精密称定29.21mg，同法制备，作为对照品溶液。
（3）测定方法：分别精密量取对照品溶液和供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算；供试品溶液主峰与对照品溶液主峰的保留时间一致。
 AX=7924879 ；AR =8359987（n=5，RSD=0.11%）
Figure 752819DEST_PATH_IMAGE014

Claims (4)

1.一种检测替诺福韦二乙酯含量的高效液相检测方法，其特征在于该检测方法包括如下步骤：
（1）色谱条件
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；
柱温：20-40℃；
检测波长：262nm；
流动相：醋酸盐缓冲液和有机相组成；
所述流动相中醋酸盐缓冲液的浓度为0.01-0.02mol/L，pH 为3.6~4.0，有机相为甲醇或乙腈；所述醋酸盐缓冲液与有机相的体积比为9-33:11；
（2）供试品及对照品溶液的制备：取供试品，精密称定，加流动相制成0.15mg/ml的溶液，作为供试品溶液；另取替诺福韦二乙酯物对照品，精密称定，同法制备，作为对照品溶液；（3）测定方法：分别精密量取对照品溶液和供试品溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算；供试品溶液主峰与对照品溶液主峰的保留时间一致；
计算公式：
Figure 201310206133X100001DEST_PATH_IMAGE001
 CX为供试品的含量，   
 CR为对照品的含量，
AX为供试品的峰面积，
AR为对照品的峰面积，
WX为供试品的称样量，单位：mg，
WR为对照品的称样量，单位：mg。
2.根据权利要求1所述的高效液相检测方法，其特征在于所述醋酸盐缓冲液为醋酸铵、醋酸钠缓冲液。
3.根据权利要求2所述的高效液相检测方法，其特征在于所述的醋酸盐缓冲液的pH为3.8。
4.根据权利要求1所述的高效液相检测方法，其特征在于所述流动相中醋酸盐缓冲液与有机相的体积比为65:35。
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