CN107179355A - 一种分离检测替诺福韦艾拉酚胺及其有关物质的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种分离检测替诺福韦艾拉酚胺及其有关物质的方法，所述方法采用十八烷基键合亚乙基桥杂化硅胶色谱柱，对替诺福韦艾拉酚胺样品进行检测。本发明所述的分离检测方法能够有效地分离检测替诺福韦艾拉酚胺的非对应异构体及其他有关物质，该方法简便、准确、可靠，适合于工业中控制替诺福韦艾拉酚胺的产品质量。
Description
技术领域
本发明涉及医药分析检测领域，更具体地涉及一种分离检测替诺福韦艾拉酚胺及其有关物质的方法。
背景技术
替诺福韦艾拉酚胺，其结构式如下：
替诺福韦艾拉酚胺，英文名字为Tenofovir Alafenamide，为吉利德(Gilead)公司推出的一个抗艾滋病毒和乙肝病毒的替诺福韦的前药(代号GS-7340)。
替诺福韦艾拉酚胺是一个含有3个手性中心化合物，其理论上应该有7个光学异构体(其中3对非对映异构体，1个对映异构体)，均为杂质。在现有的合成工艺中，如WO2002008241A2公开的路线中，替诺福韦艾拉酚胺的对映异构体是通过在2个引入手性的起始物料PMPA(替诺福韦)和L-丙氨酸分别进行了控制，因此在替诺福韦艾拉酚胺中存在对映异构体的含量在制备过程中就得到了有效控制。然而，替诺福韦艾拉酚胺的其他6个非对映异构体及其杂质则没有得到有效的控制。
在医药领域中，对化学药品的杂质的控制关乎到药品的质量和使用安全，因此对化学药品的有关物质进行准确地分析检测，控制其含量是非常有意义的。
CN01813161A1核苷酸膦酸酯类似物前药及其筛选和制备方法中公开了一种采用反相HPLC分离检测替诺福韦艾拉酚胺及其一个非对映异构体的分析方法。该分析方法采用Phenomenex Luna C18 5μm，100A°(或等效色谱柱)；保护柱是Pellicular C18(或等效色谱柱)；流动相是，A相含有0.02％磷酸(85％)的水-乙腈(95:5)溶液，B相是含有0.02％磷酸(85％)的水-乙腈(50:50)溶液；
梯度洗脱如下：
操作时间：50min；
平衡延迟：在100％流动相A的条件下为10min；
流速：1.2mL/min；温度：室温；检测：UV 260nm；样品溶液：20mmol/L磷酸钠缓冲溶液，pH 6。
所述方法能够有效地分离检测替诺福韦艾拉酚胺及其中之一的非对映异构体，但是其未能同时有效地分离检测其他的非对映异构体，以及存在的其他有关物质。
在目前的替诺福韦艾拉酚胺分析检测方法中，没有提供一种简便的，准确的，可靠的，能同时检测替诺福韦艾拉酚胺及其3对非对映异构体以及其它有关物质的方法。因此开发一种能解决以上技术问题的分析方法，有效控制替诺福韦艾拉酚胺的药品质量是非常有意义和必要的。
发明内容
发明概述
本发明提供一种分离检测替诺福韦艾拉酚胺及其有关物质的分析方法，该方法能够同时分离检测替诺福韦艾拉酚胺、3对非对映异构体以及其他有关物质。本发明中所述的3对非对映异构体分别表示为异构体1、异构体2和异构体3。
本发明所述的异构体1、异构体2和异构体3可能包含分别如下：
即，异构体1、异构体2或异构体3分别如上表格中所表示。
另外本发明所述的其他有关物质至少包含以下所示的杂质A、杂质B、杂质C和/或杂质D，
本发明人经过长期的实验研究和尝试，意外地发现采用特定填料的色谱柱，十八烷基键合亚乙基桥杂化硅胶色谱柱(如XBridge BEH C18)，对替诺福韦艾拉酚胺样品进行检测，能够有效地分离检测替诺福韦艾拉酚胺、异构体1、异构体2、异构体3以及其他有关物质(如杂质A、杂质B、杂质C和杂质D等)。
术语定义
本发明中，除另有说明外，“％”均指质量百分比。
本发明中，除另有说明外，所用到的水或所指的水溶液是指分析领域通常所使用分析用水，包括但不限于纯化水、超纯水、去离子水等。
本发明中，无论在具体数值之前是否有“约”表示，都是指该具体数值的可以在本领域认可的范围内波动，具体地可以是具体数值的绝对值±10％内波动。
发明详述
本发明提供一种分离检测替诺福韦艾拉酚胺及其有关物质的方法，所述方法采用十八烷基键合亚乙基桥杂化硅胶色谱柱，A相可以是pH值1.0～7.0的缓冲盐溶液或缓冲盐溶液与一定比例的有机溶液(如，甲醇、乙醇或异丙醇等)的混合液，B相是甲醇、乙醇或异丙醇，进行梯度洗脱样品，采用紫外检测器进行检测。
本发明提供的分析方法中，所述的十八烷基键合亚乙基桥杂化硅胶色谱柱可以是XBridge BEH C18。具体地，所述的XBridge BEH C18具体规格可以是直径1mm～4.6mm，柱长30mm～250mm，粒径1.7～10μm，如XBridge BEH C18，4.6×75mm，2.5μm。根据本领域公知常识，本领域普通技术人员可以根据需要，在本发明的技术方案的基础上，为了获得更好的实验效果，或根据实验检测环境的变化等因数选用其他具体规格的XBridge BEH C18色谱柱，以实现本发明的发明目的。仅是XBridge BEH C18色谱柱在规格上的变化，属于等同的色谱柱，不会影响本发明技术方案的实现所要解决的技术问题。
本发明提供的分析方法中，所述的缓冲盐溶液是pH值为1.0～7.0的铵盐水溶液或磷酸二氢钠和高氯酸钠的水溶液，所述的铵盐包括但不限于磷酸氢二铵、磷酸铵、甲酸铵和醋酸铵中的一种或几种。
更具体地，本发明提供一种分离检测替诺福韦艾拉酚胺及其有关物质的方法，所述方法采用XBridge BEH C18色谱柱，A相可以是pH值1.0～7.0的缓冲盐溶液或缓冲盐溶液与一定比例的有机溶液(如，甲醇、乙醇或异丙醇等)的混合液，B相是甲醇、乙醇或异丙醇，进行梯度洗脱样品，采用紫外检测器进行检测；其中所述的缓冲盐溶液可以是磷酸氢二铵、磷酸铵、甲酸铵和醋酸铵中的一种或几种的水溶液或者是磷酸二氢钠和高氯酸钠的水溶液；其中色谱柱温度可以是15℃～40℃；流动相流速是0.3mL/min～1.5mL/min；紫外检测器检测波长220nm～280nm。
经过多次的实验研究，本发明人发现当采用高浓度的缓冲盐溶液时(铵盐或磷酸氢二钠与高氯酸钠水溶液)，本发明所述的分析方法的待测样品的色谱峰的峰型更好。
在一些实施例中，本发明所述的方法采用XBridge BEH C18，4.6×75mm，2.5μm。
在一些实施例中，本发明所述的方法在方法运行时色谱柱温度是24℃。
在一些实施例中，本发明所述的方法的A相可以是pH值2.0～5.0的浓度为30mmol/L～300mmol/L或30mmol/L～100mmol/L的磷酸氢二铵水溶液；或者可以是所述磷酸氢二铵水溶液与有机溶液(如甲醇、乙醇或异丙醇等)的混合溶液，体积比可以是100:0～80:20。
在一些实施例中，本发明所述的方法的A相可以是pH值2.0～5.0的浓度为5mmol/L～50mmol/L或5mmol/L～20mmol/L的磷酸氢二钠和浓度为30mmol/L～500mmol/L或30mmol/L～150mmol/L高氯酸钠水溶液；或者可以是所述磷酸二氢钠和高氯酸钠水溶液与有机溶液(如甲醇、乙醇或异丙醇等)的混合溶液，体积比可以是100:0～80:20。
在一些实施例中，本发明所述的方法的流动相的流速是0.3mL/min～1.5mL/min。
在一些实施例中，本发明所述的方法的梯度洗脱程序是：
| 时间，min | A相，％，体积比 | B相，％，体积比 |
| 0 | 100 | 0 |
| 2 | 100 | 0 |
| 8 | 66 | 34 |
| 29 | 59 | 41 |
| 31 | 54 | 46 |
| 42 | 43 | 57 |
| 50 | 43 | 57 |
| 55 | 22 | 78 |
| 55.1 | 100 | 0 |
| 60 | 100 | 0 |
在一些实施例中，本发明所述的一种分离检测替诺福韦艾拉酚胺及其有关物质的方法，其特征是：
色谱柱：XBridge BEH C18，4.6×75mm，2.5μm；
检测器：UV检测器，检测波长260nm；
流速：0.6mL/min；
柱温：24℃；
流动相：A相：磷酸氢二铵水溶液:甲醇＝97:3，体积比，其中所述的磷酸二氢铵水溶液的pH值是约2.5，浓度是约70mmol/L；B相：甲醇或乙醇；
梯度程序如下：
在一些实施例中，本发明所述的一种分离检测替诺福韦艾拉酚胺及其有关物质的方法，其特征是：
色谱柱：XBridge BEH C18，4.6×75mm，2.5μm；
检测器：UV检测器，检测波长260nm；
流速：0.7mL/min；
柱温：24℃；
流动相：
A相：磷酸氢二钠与高氯酸钠水溶液:甲醇＝95:5，体积比；B相：甲醇或乙醇；
梯度程序如下：
| 时间，min | A相，％，体积比 | B相，％，体积比 |
| 0 | 100 | 0 |
| 2 | 100 | 0 |
| 8 | 66 | 34 |
| 29 | 59 | 41 |
| 31 | 55 | 45 |
| 42 | 44 | 56 |
| 50 | 44 | 56 |
| 55 | 22 | 78 |
| 55.1 | 100 | 0 |
| 60 | 100 | 0 |
其中，磷酸氢二钠与高氯酸钠水溶液：取约1.36g磷酸二氢钠，约10.5g高氯酸钠，加入1000mL水，溶解并混合均匀，调节pH值到2.5。
在一些实施例中，在本发明所述的方法，其中供试品溶液的配制是采用稀释液溶解并稀释样品配制所得，供试品溶液的浓度可以是0.2mg/mL～5.0mg/mL或者是约0.7mg/mL。其中稀释液可通过取约1.36g磷酸二氢钾，加入1000mL水，溶解并混合均匀，调pH至5.5～7.5之间而制得。
经过多次试验筛选，本发明人还意外地发现在本发明的分析检测中，稀释液的pH为5.5～7.5时所配置的供试品溶液具有更好的稳定性，使得分析检测的精密度、回收率以及耐用性更佳，分析检测结果更加准确可靠。
本发明所述的方法简便、准确、灵敏度高，能够同时分离检测替诺福韦艾拉酚胺的3对非对映异构体及其他有关物质。特别地，但不限于，适用于分离检测替诺福韦艾拉酚胺、异构体1、异构体2、异构体3、杂质A、杂质B、杂质C和/或杂质D。
附图说明
图1示实施例1中的空白溶液的色谱图
图2示实施例1中的供试品溶液的色谱图
图3示实施例2中的供试品加标溶液的色谱图
图4示实施例3中的供试品加标溶液的色谱图
图5示实施例4中的酸降解试验溶液的色谱图
图6示实施例5中的碱降解试验溶液的色谱图
图7示实施例6中的氧化降解试验溶液的色谱图
图8示实施例7中的光照降解试验溶液的色谱图
图中色谱峰的标号分别代表样品中的组分如下：
| 色谱峰标号 | 代表的待测组分 |
| 1 | 富马酸 |
| 2 | 杂质A |
| 3 | 杂质D |
| 4 | 杂质B |
| 5 | 异构体1或异构体2 |
| 6 | 异构体3 |
| 7 | 替诺福韦艾拉酚胺 |
| 8 | 异构体1或异构体2 |
| 9 | 杂质C |
其中，所述的色谱峰5或8不同时是异构体1或异构体2。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面进一步披露一些非限制实施例对本发明作进一步的详细说明。
本发明所使用的试剂均可以从市场上购得或者可以通过本发明所描述的方法制备而得。
以下实施例中所用的分析试剂均为分析纯试剂，作为流动相的有机溶液采用色谱级纯度的有机溶液，分析用水属于纯化水。
实施例1
色谱条件：
美国Agilent 1260型高效液相色谱系统及工作站；
色谱柱：XBridge BEH C18(75×4.6mm，2.5μm)；
紫外检测波长：260nm；
流速：0.6mL/min；
柱温：24℃；
进样体积：10μL；
流动相：
磷酸二氢铵水溶液：取9.2g磷酸二氢铵，加入1000mL水，用磷酸调pH至2.5，摇匀，用0.22μm滤膜过滤，脱气；
A相：磷酸二氢铵水溶液:甲醇＝97:3，体积比；B相：甲醇；
洗脱程序如下：
| 时间，min | A相，％，体积比 | B相，％，体积比 |
| 0 | 100 | 0 |
| 2 | 100 | 0 |
| 8 | 66 | 34 |
| 29 | 59 | 41 |
| 31 | 54 | 46 |
| 42 | 43 | 57 |
| 50 | 43 | 57 |
| 55 | 22 | 78 |
| 55.1 | 100 | 0 |
| 60 | 100 | 0 |
溶液配制：
稀释溶液或空白溶剂：取1.36g磷酸二氢钾，加入1000mL水，溶解并混合均匀，用氢氧化钾溶液调pH至6.5。
供试品溶液：取富马酸替诺福韦艾拉酚胺供试品约35mg，精密称定，置于50mL容量瓶中，加入适量的稀释溶液(约三分之二容量瓶体积)，超声溶解，然后再用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。
分别取空白溶液和供试品溶液，按上述条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图，结果见图1、图2。图1表明空白溶剂无干扰；图2中保留时间约25min色谱峰是富马酸替诺福韦艾拉酚胺的色谱峰，可见，富马酸替诺福韦艾拉酚胺色谱峰和周围杂质分离情况良好，并且有较高的色谱纯度，本法可以用于富马酸替诺福韦艾拉酚胺的质量监测。
实施例2
色谱条件：
仪器与条件同实施例1。
溶液配制：
非对映异构体溶液：取约5mg替诺福韦艾拉酚胺非对映异构体(含有3个替诺福韦艾拉酚胺非对映异构体)，置100mL容量瓶中，加水溶解，稀释至刻度。
供试品溶液：取样品富马酸替诺福韦艾拉酚胺约51.30mg样品，精密称定至50mL容量瓶中，加水溶解定容。
供试品加标溶液：取约2mL富马酸替诺福韦艾拉酚胺供试品溶液，加入约3滴上述非对映异构体溶液混合均匀，即得。
取供试品加标溶液，照实施例1的色谱条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图，结果见图3。图3表明富马酸替诺福韦艾拉酚胺及其非对映异构体杂质(共3个峰，标示为“5”，“6”，“8”)能有效分离，并且能和其他有关物质(如中间体杂质、工艺杂质和富马酸)色谱峰有效分离。
实施例3
色谱条件：
美国Agilent 1260型高效液相色谱系统及工作站；
色谱柱：XBridge BEH C18(75×4.6mm，2.5μm)；
紫外检测波长：260nm；
流速：0.7mL/min
柱温：24℃；
进样体积：10μL。
流动相：
磷酸二氢钠与高氯酸钠水溶液：取1.36g磷酸二氢钠，10.5g高氯酸钠，加入1000mL水，溶解并混合均匀，用磷酸调节pH值到2.5，摇匀，用0.22μm滤膜过滤，脱气；
A相：磷酸二氢钠与高氯酸钠水溶液:甲醇＝95:5，体积比；B相：甲醇；
洗脱程序：
| 时间，min | A相，％，体积比 | B相，％，体积比 |
| 0 | 100 | 0 |
| 2 | 100 | 0 |
| 8 | 66 | 34 |
| 29 | 59 | 41 |
| 31 | 55 | 45 |
| 42 | 44 | 56 |
| 50 | 44 | 56 |
| 55 | 22 | 78 |
| 55.1 | 100 | 0 |
| 60 | 100 | 0 |
溶液配制：
供试品加标溶液配制方法同实施例1。
取供试品加标溶液，照实施例1的色谱条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图，结果见图4。图4表明富马酸替诺福韦艾拉酚胺和其非对映异构体杂质(共3个峰，标示为“5”，“6”，“8”)能有效分离，并且能和其他有关物质(如中间体杂质、工艺杂质和富马酸)色谱峰有效分离。
实施例4
色谱条件：
色谱条件如实施例1。
溶液配制：
稀释溶液或空白溶剂：取1.36g磷酸二氢钾，加入1000mL水，溶解并混合均匀，用氢氧化钾溶液调pH至6.5。
酸降解试验溶液：取富马酸替诺福韦艾拉酚胺供试品350mg，精密称定至100mL容量瓶中，用稀释液溶解并稀释至刻度，摇匀，取上述溶液10mL于50mL量瓶，加入25mL稀释剂摇匀，再加入5mL 0.1mol/L盐酸溶液摇匀，放置4h，加5mL 0.1mol/L的氢氧化钠溶液中和，用稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，立即进样进行检测；
取酸降解试验溶液，照实施例1的色谱条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图，结果见图5。图5表明富马酸替诺福韦艾拉酚胺和酸降解杂质能有效分离，说明本法可以有效检测出富马酸替诺福韦艾拉酚胺酸降解杂质及其他潜在杂质，能有效控制富马酸替诺福韦艾拉酚胺的有关物质。
实施例5
色谱条件：
色谱条件如同实施例1。
溶液配制：
稀释溶液或空白溶剂：取1.36g磷酸二氢钾，加入1000mL水，溶解并混合均匀，用氢氧化钾溶液调pH至6.5。
碱降解试验溶液：取富马酸替诺福韦艾拉酚胺供试品350mg，精密称定至100mL容量瓶中，用稀释液溶解并稀释至刻度，摇匀，取上述溶液10mL于50mL量瓶，加入1mL 0.2mol/L氢氧化钠溶液摇匀，放置10h，加入等量的0.2mol/L的盐酸中和后，用稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，立即进样进行检测；
取碱降解试验溶液，照实施例1的色谱条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图，结果见图6。图6表明，富马酸替诺福韦艾拉酚胺和碱降解杂质能有效分离，说明本法可以有效检测出富马酸替诺福韦艾拉酚胺碱降解杂质及其他潜在杂质，能有效控制富马酸替诺福韦艾拉酚胺的有关物质。
实施例6
色谱条件：
色谱条件如同实施例1。
溶液配制：
稀释溶液或空白溶剂：取1.36g磷酸二氢钾，加入1000mL水，溶解并混合均匀，用氢氧化钾溶液调pH至6.5。
氧化降解试验溶液：取供试品350mg，精密称定至100mL容量瓶中，用稀释液溶解并稀释至刻度，摇匀，取上述溶液10mL于50mL量瓶，加入1mL 30％双氧水(浓双氧水)，摇匀，放置约24h后，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，立即进样检测；
取氧化降解试验溶液，照实例1的条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图，结果见图7。图7表明富马酸替诺福韦艾拉酚胺和氧化降解杂质能有效分离，说明本法可以有效检测出富马酸替诺福韦艾拉酚胺氧化降解杂质及其他潜在杂质，能有效控制富马酸替诺福韦艾拉酚胺的有关物质。
实施例7
色谱条件：
色谱条件如同实施例1。
溶液配制：
稀释溶液或空白溶剂：取1.36g磷酸二氢钾，加入1000mL水，溶解并混合均匀，用氢氧化钾溶液调pH至6.5。
光照降解试验溶液：取供试品350mg，精密称定至100mL容量瓶中，用稀释液溶解并稀释至刻度，摇匀，取上述溶液10mL于50mL量瓶，用稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，置可见光4500Lux±500Lux、紫外光1.7W×h/m2条件下光照13天使可见光照强度总量达到1200000Lux，紫外光强度达到200W/m2以上。
取光照降解试验溶液，照实施例1的色谱条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图，结果见图8。图8表明富马酸替诺福韦艾拉酚胺和光照降解杂质能有效分离，说明本法可以有效检测出富马酸替诺福韦艾拉酚胺光照降解杂质及其他潜在杂质，能有效控制富马酸替诺福韦艾拉酚胺的有关物质。
综上实施例所述，
根据实施例1-7的实验结果，可见本发明所提供的一种分离检测替诺福韦艾拉酚胺及其有关物质的方法能够有效地分离检测替诺福韦艾拉酚胺的非对映异构体及其他有关物质，该方法简便、准确、可靠，适合于工业中控制替诺福韦艾拉酚胺的产品质量。
本发明的方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明内。
Claims (10)
1.一种分离检测替诺福韦艾拉酚胺及其有关物质的方法，所述方法采用十八烷基键合亚乙基桥杂化硅胶色谱柱；A相是pH值1.0～7.0的缓冲盐溶液或所述缓冲盐溶液与一定比例的甲醇、乙醇或异丙醇的混合液；B相是甲醇、乙醇或异丙醇；进行梯度洗脱样品，采用紫外检测器进行检测。
2.根据权利要求1所述的方法，所述的色谱柱是XBridge BEH C18。
3.根据权利要求1所述的方法，所述的缓冲盐溶液是磷酸氢二铵、磷酸铵、甲酸铵和醋酸铵中的一种或几种的水溶液或者是磷酸二氢钠和高氯酸钠的水溶液。
4.根据权利要求3所述的分析方法，其中缓冲盐溶液与甲醇、乙醇或异丙醇的混合液的比例是100:0～80:20，体积比。
5.根据权利要求1所述的方法，其中色谱柱温度是15℃～40℃；流动相流速是0.3mL/min～1.5mL/min；紫外检测器检测波长220nm～280nm。
6.根据权利要求1-5所述的方法，其中梯度洗脱程序是：
。
7.根据权利要求6所述的方法，其中供试品溶液的配制是采用稀释液溶解并稀释样品所得，供试品溶液的浓度是0.2mg/mL～5.0mg/mL；其中稀释液是取约1.36g磷酸二氢钾，加入1000mL水，溶解并混合均匀，调pH至5.5～7.5之间。
8.根据权利要求7所述的方法，用于测定替诺福韦艾拉酚胺的异构体1、异构体2、异构体3、杂质A、杂质B、杂质C或杂质D。
9.一种分离检测替诺福韦艾拉酚胺及其有关物质的方法，其特征是：
色谱柱：XBridge BEH C18，4.6×75mm，2.5μm；
检测器：UV检测器，检测波长260nm；
流速：0.6mL/min；
柱温：24℃；
流动相：A相：磷酸氢二铵水溶液:甲醇＝97:3，体积比，其中所述的磷酸二氢铵水溶液的pH值是约2.5，
浓度是约70mmol/L；B相：甲醇或乙醇；
梯度程序如下：
。
10.一种分离检测替诺福韦艾拉酚胺及其有关物质的方法，其特征是：
色谱柱：XBridge BEH C18，4.6×75mm，2.5μm；
检测器：UV检测器，检测波长260nm；
流速：0.7mL/min；
柱温：24℃；
流动相：
A相：磷酸二氢钠与高氯酸钠水溶液:甲醇＝95:5，体积比；B相：甲醇或乙醇；
梯度程序如下：
其中，磷酸二氢钠与高氯酸钠水溶液：取约1.36g磷酸二氢钠，约10.5g高氯酸钠，加入1000mL水，溶解并混合均匀，调节pH值到2.5。
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