CN111579523B - 一种利用近红外光谱法快速检测孕马尿中结合雌激素含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及化学检测技术领域，提供了一种利用近红外光谱法快速检测孕马尿中结合雌激素含量的方法。本发明针对不同的结合雌激素成分，通过预处理和选择特征光谱波段，采用偏最小二乘法建立了各结合雌激素的定量分析校正模型。与HPLC法相比较，本发明提供的近红外光谱法操作更为简便、快速，且适合大批量样本的含量测定，能够满足工业化生产中对大规模样本信息采集的需求，对药物生产过程及终端产品的稳定性可控性都具有重要意义。实施例结果表明，本发明提供的方法检测准确度较高，采用本发明提供的方法得到的预测值与真实值的相对偏差小于15％，准确度较高。
Description
技术领域
本发明涉及化学检测技术领域，尤其涉及一种利用近红外光谱法快速检测孕马尿中结合雌激素含量的方法。
背景技术
结合雌激素是从孕马尿中提取的一种天然混合雌激素。临床上主要用于激素代替疗法，缓解因雌激素不足引起的临床症状。每升孕马尿中富含雌激素的平均含量为70～130mg，每匹孕马在孕期内可形成雌激素5～100g。
但在孕马尿的实际生产过程中，由于收集尿液的过程受到诸多方面的约束，其检测多是采用离线操作、事后分析，因此，该检测过程存在很多缺陷。例如孕马尿中质控指标成分的降解，无法及时反馈待测样品的含量参数等质量问题。费时费力，操作繁琐，分析结果滞后等等情况均不利于孕马尿的质量控制。为了提高生产效率，迫切需要研究一种快速、高效、准确、便利的分析检测方法。
发明内容
本发明提供了一种利用近红外光谱法快速检测孕马尿中结合雌激素含量的方法，本发明提供的方法能够快速、高效、准确、便利地检测出孕马尿中结合雌激素的含量。
本发明提供了一种利用近红外光谱法快速检测孕马尿中结合雌激素含量的方法，包括以下步骤：
(1)将孕马尿进行样品前处理，得到供试品溶液；
(2)将所述供试品溶液进行近红外光谱扫描，采集供试品溶液的光谱数据；
(3)对步骤(2)采集的光谱数据进行预处理，然后进行波段选择，得到特征波段；采用偏最小二乘法对特征波段的光谱数据和孕马尿中对应的结合雌激素真实含量值做回归拟合计算，建立校正模型；
(4)按照步骤(2)的方法对未知的待测孕马尿供试品溶液进行近红外光谱扫描，将得到的光谱数据导入步骤(3)建立的校正模型，得到孕马尿中结合雌激素的含量；
所述结合雌激素包括雌酮硫酸钠、马烯雌酮硫酸钠和17α-二氢马烯雌酮硫酸钠中的一种或多种。
优选的，所述步骤(1)中样品前处理包括以下步骤：
(a)将孕马尿进行离心处理，得到上清液；
(b)将所述上清液用水稀释后，与盐酸混合，得到盐酸溶液；
(c)采用氢氧化钠水溶液调节所述盐酸溶液的pH值为7.0～8.0，然后依次经定容和过滤，取滤液作为供试品溶液。
优选的，所述步骤(b)中上清液和水的体积比为1:5～15；所述盐酸的浓度为0.3～3mol/L，所述步骤(b)中上清液和盐酸的体积比为1～5:1。
优选的，所述步骤(2)中近红外光谱扫描的参数包括：
采用在线或离线检测，以空气为背景，采用透射测样方式，波长检测范围为10000～4000cm-1，扫描次数为32～64次，分辨率为8cm-1，光程为2mm，每个供试品溶液重复扫描3～5次，取平均值作为光谱数据；
或者，依据光栅扫描分光原理，以卤钨灯为光源；光谱范围1000～1800nm，检测器：InGaAs检测器，分辨率：8cm-1；扫描次数：32次；光程1mm。
优选的，所述步骤(3)中预处理的方法包括：卷积平滑、一阶卷积求导、二阶卷积求导、多元散射校正、标准正态变量变换、多元散射校正和归一化法中的一种或几种相结合的方法。
优选的，所述预处理方法为二阶卷积求导的方法，窗口数为7～11，拟合次数为3次。
优选的，所述步骤(3)中结合雌激素的真实含量值由高效液相色谱法对供试品溶液进行测试得到，所述高效液相色谱法的测试参数为：
色谱柱：C18色谱柱；
色谱柱规格：250mm×4.6mm，5μm；
流动相：包括A相和B相，其中A相为磷酸二氢钠水溶液、乙腈和甲醇的混合溶液，所述A相中磷酸二氢钠水溶液的浓度为20mmol/L，pH值为3.5；所述A相中磷酸二氢钠水溶液、乙腈和甲醇的体积比为17:2:1；B相为磷酸氢二钠水溶液和乙腈的混合溶液，所述B相中磷酸氢二钠水溶液的浓度为10mmol/L，pH值为3.5；所述B相中磷酸氢二钠水溶液和乙腈的体积比为3:7；
流动相洗脱程序为：0～18min，A相体积分数由70％逐渐降低为67％；18～23min，A相体积分数由67％逐渐降低为20％；23～28min，A相体积分数由20％逐渐升高为70％；28～35min，A相体积分数稳定在70％；
流速：1.0mL/min；
柱温：40℃；
检测波长：205nm；
进样量：20μL；
不同结合雌激素在同一色谱条件下的不同保留时间处出峰。
优选的，所述步骤(3)中波段选择的方法包括全波长、相关系数法选择波长区间、相关成分法选择波长区间、迭代优化波长选择方法1、迭代优化波长选择方法2或迭代优化波长选择方法3。
优选的，所述步骤(3)中波段选择的方法为相关系数法选择波长区间，阈值为0.2～0.3。
优选的，所述步骤(3)中不同结合雌激素的校正模型如表1所示。
有益效果：
本发明提供了一种利用近红外光谱法快速检测孕马尿中结合雌激素含量的方法。本发明针对不同的结合雌激素成分，通过预处理和选择特征光谱波段，采用偏最小二乘法建立了各结合雌激素的定量分析校正模型。与HPLC法相比较，本发明提供的近红外光谱法操作更为简便、快速，且适合大批量样本的含量测定，能够满足工业化生产中对大规模样本信息采集的需求，对药物生产过程及终端产品的稳定性可控都具有重要意义。实施例结果表明，本发明提供的方法检测准确度较高，采用本发明提供的方法得到的预测值与真实值的相对偏差小于15％，准确度较高。
附图说明
图1为本发明实施例1中孕马尿中结合雌激素的近红外光谱图(A：原始光谱，B：无预处理；C：卷积平滑；D：一阶卷积求导；E：二阶卷积求导；F：标准正态变量变换；G：多元散射校正；H：归一化法；I：一阶卷积求导+多元散射校正)；
图2为本发明实施例1中雌酮硫酸钠校正模型下的各参数图；
图3为本发明实施例1中马烯雌酮硫酸钠校正模型下的各参数图；
图4为本发明实施例1中17α-二氢马烯雌酮硫酸钠校正模型下的各参数图；
图5为本发明实施例1中总含量校正模型下的各参数图；
图6为本发明实施例1中雌酮硫酸钠的真实值与预测值的关系图；
图7为本发明实施例1中马烯雌酮硫酸钠的真实值与预测值的关系图；
图8为本发明实施例1中17α-二氢马烯雌酮硫酸钠的真实值与预测值的关系图；
图9为本发明实施例1中总含量的真实值与预测值的关系图；
图10为本发明实施例2中雌酮硫酸钠的SEC/SECV与主因子数的变化趋势关系图；
图11为本发明实施例2中雌酮硫酸钠的真实值与预测值的关系图。
具体实施方式
本发明提供了一种利用近红外光谱法快速检测孕马尿中结合雌激素含量的方法，包括以下步骤：
(1)将孕马尿进行样品前处理，得到供试品溶液；
(2)将所述供试品溶液进行近红外光谱扫描，采集供试品溶液的光谱数据；
(3)对步骤(2)采集的光谱数据进行预处理，然后进行波段选择，得到特征波段，采用偏最小二乘法对特征波段的光谱数据和孕马尿中对应的结合雌激素真实含量值做回归拟合计算，建立校正模型；
(4)按照步骤(2)的方法对未知的待测孕马尿供试品溶液进行近红外光谱扫描，将得到的光谱数据导入步骤(3)建立的校正模型，得到孕马尿中结合雌激素的含量；
所述结合雌激素包括雌酮硫酸钠、马烯雌酮硫酸钠和17α-二氢马烯雌酮硫酸钠中的一种或多种。
本发明将孕马尿进行样品前处理，得到供试品溶液。
在本发明中，所述样品前处理优选包括以下步骤：
(a)将孕马尿进行离心处理，得到上清液；
(b)将上清液用水稀释后，与盐酸混合，得到盐酸溶液；
(c)采用氢氧化钠水溶液调节盐酸溶液的pH值为7.0～8.0，然后依次经定容和过滤，取滤液作为供试品溶液。
本发明将孕马尿进行离心处理，得到上清液。在本发明中，所述离心的转速优选为3000～5000r/min，离心的时间优选为5～20min。
离心结束后，本发明将离心得到的上清液用水稀释，然后与盐酸混合，得到盐酸溶液。在本发明中，所述上清液和水的体积比优选为1:5～15，所述盐酸的浓度优选为0.3～3mol/L，更优选为1mol/L，所述上清液和盐酸的体积比优选为1～5:1，更优选为5:1。在本发明中，所述混合优选为震荡混合，所述混合过程中，盐酸将孕马尿中的草酸进行置换，避免孕马尿中草酸对检测结果产生影响。
得到盐酸溶液后，本发明采用氢氧化钠水溶液调节盐酸溶液的pH值为7.0～8.0，然后依次经定容和过滤，取滤液作为供试品溶液。在本发明中，所述氢氧化钠水溶液的浓度优选为1～3mol/L。在本发明中，所述氢氧化钠水溶液的用量以将盐酸溶液的pH值调节到上述范围为准。本发明加入氢氧化钠，能够调节pH值，保证经HPLC检测的样品对色谱柱无损伤。本发明对定容和过滤的具体实施方式没有特别要求，采用本领域技术人员熟知的定容和过滤方式即可。
得到供试品溶液后，本发明将所述供试品溶液进行近红外光谱扫描，采集供试品溶液的光谱数据。
在本发明中，所述近红外光谱扫描的参数优选包括：采用在线或离线检测，以空气为背景，采用透射测样方式，波长检测范围为10000～4000cm-1，扫描次数为32～64次，分辨率为8cm-1，光程为2mm，每个供试品溶液重复扫描3～5次，取平均值作为光谱数据；
或者，依据光栅扫描分光原理，以卤钨灯为光源；光谱范围1000～1800nm，检测器：InGaAs检测器，分辨率：8cm-1；扫描次数：32次；光程1mm。
在本发明中，每次扫描平均需要3～5秒。
得到光谱数据后，本发明对采集的光谱数据进行预处理，然后进行波段选择，得到特征波段；采用偏最小二乘法对特征波段的光谱数据和孕马尿中对应的结合雌激素真实含量值做回归拟合计算，建立校正模型。
在本发明中，所述预处理的方法优选包括卷积平滑、一阶卷积求导、二阶卷积求导、多元散射校正、标准正态变量变换、多元散射校正和归一化法中的一种或几种相结合的方法，更优选为二阶卷积求导的方法，窗口数为7～11，拟合次数为3次。
在本发明中，所述波段选择的方法优选包括全波长、相关系数法选择波长区间、相关成分法选择波长区间、迭代优化波长选择方法1、迭代优化波长选择方法2或迭代优化波长选择方法3，更优选为相关系数法选择波长区间，阈值0.2～0.3。在本发明中，所述迭代优化波长选择方法1是指对N个波长区间段进行全排列组合，使用每一组合进行建模，最后选择SECV最小的为本次优化的最佳模型；所述迭代优化波长选择方法2是指从N个波长区间段中选择M段组合成一段光谱，进行建模，即N选M，对所有的可能组合进行建模，最后选择SECV最小的为本次优化的最佳模型，本部分选择的N为10，M为1、2或3；所述迭代优化波长选择方法3是指对N个波长区间段，第一次只用1个区间段光谱进行建模：每次增加一个波长区间，进行建模；一次增加一个波长区间，进行建模；最后选择SECV最小的本次优化的最佳模型，其中使用全波段光谱建模并取最小的SECV初始化整个该方法的SECV。
在本发明中，所述结合雌激素的真实含量值优选由高效液相色谱法对供试品溶液进行测试得到，所述高效液相色谱法的测试参数优选为：
色谱柱：C18色谱柱；
色谱柱规格：250mm×4.6mm，5μm；
流动相：包括A相和B相，其中A相为磷酸二氢钠水溶液、乙腈和甲醇的混合溶液，所述A相中磷酸二氢钠水溶液的浓度为20mmol/L，pH值为3.5；所述A相中磷酸二氢钠水溶液、乙腈和甲醇的体积比为17:2:1；B相为磷酸氢二钠水溶液和乙腈的混合溶液，所述B相中磷酸氢二钠水溶液的浓度为10mmol/L，pH值为3.5；所述B相中磷酸氢二钠水溶液和乙腈的体积比为3:7；
流动相洗脱程序为：0～18min，A相体积分数由70％逐渐降低为67％；18～23min，A相体积分数由67％逐渐降低为20％；23～28min，A相体积分数由20％逐渐升高为70％；28～35min，A相体积分数稳定在70％；
流速：1.0mL/min；
柱温：40℃；
检测波长：205nm；
进样量：20μL；
不同结合雌激素在同一色谱条件下的不同保留时间处出峰。
在本发明中，不同结合雌激素的校正模型优选如表1所示：
表1不同结合雌激素的校正模型
表1中最后一行的总含量指的是：雌酮硫酸钠、马烯雌酮硫酸钠和17α-二氢马烯雌酮硫酸钠三者含量的总和；
表1中预测-真实拟合方程中x代表真实值，y代表预测值。
得到校正模型后，本发明按照步骤(2)的方法对未知的待测孕马尿供试品溶液进行近红外光谱扫描，将得到的光谱数据导入步骤(3)建立的校正模型，得到孕马尿中结合雌激素的含量。在本发明中，所述结合雌激素包括雌酮硫酸钠、马烯雌酮硫酸钠和17α-二氢马烯雌酮硫酸钠中的一种或多种。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。
实施例1
实验仪器及试剂：在室温(15～30℃)下，利用Antaris MX傅立叶近红外过程分析仪(赛默飞世尔科技公司，美国，光源：卤钨灯，检测器：InGaAs检测器)；Waters 2695高效液相色谱仪(包括Alliance控制面板、紫外检测器PDA-2998、色谱工作站Empower2)。
实验材料：雌酮硫酸钠、马烯雌酮硫酸钠和17α-二氢马烯雌酮硫酸钠的混合标准品；孕马尿。
(1)供试品溶液的制备：取25mL孕马尿置于离心管中，经离心(离心的转速为4000r/min，离心时间15min)后，精密吸取5mL离心得到的上清液置于100mL量瓶中，加50mL水，再加1mol/L盐酸溶液1mL后迅速振摇2分钟，用2mol/L的NaOH水溶液调pH值至7.5后，用纯化水稀释至刻度，摇匀，过滤，取滤液作为供试品溶液。
(2)将供试品溶液进行近红外光谱扫描，采集供试品溶液的光谱数据，采用离线检测，以空气为背景，采用透射测样方式，其中波长检测范围为10000～4000cm-1，扫描次数为64次，分辨率为8cm-1，光程为2mm；
每个孕马尿样品重复扫描4次，每测一次平均需要4秒，取平均值作为光谱数据。
(3)采用高效液相色谱法对供试品溶液中结合雌激素含量进行测试，其中高效液相色谱法的测试参数为：
色谱柱：C18色谱柱；
色谱柱规格：250mm×4.6mm，5μm；
流动相：包括A相和B相，其中A相为磷酸二氢钠水溶液、乙腈和甲醇的混合溶液，所述A相中磷酸二氢钠水溶液的浓度为20mmol/L，pH值为3.5(用磷酸调节磷酸二氢钠水溶液的pH值为3.5)；所述A相中磷酸二氢钠水溶液、乙腈和甲醇的体积比为17:2:1；B相为磷酸氢二钠水溶液和乙腈的混合溶液，所述B相中磷酸氢二钠水溶液的浓度为10mmol/L，pH值为3.5(用磷酸调节磷酸氢二钠水溶液的pH值为3.5)；所述B相中磷酸氢二钠水溶液和乙腈的体积比为3:7；
流动相洗脱程序为：0～18min，A相体积分数由70％逐渐降低为67％；18～23min，A相体积分数由67％逐渐降低为20％；23～28min，A相体积分数由20％逐渐升高为70％；28～35min，A相体积分数稳定在70％；
流速：1.0mL/min；
柱温：40℃；
检测波长：205nm；
进样量：20μL；
不同结合雌激素在同一色谱条件下的不同保留时间处出峰。
(4)采用不同的预处理方法对采集的光谱数据进行预处理，预处理后的光谱如图1所示，图1中A：原始光谱；B：无预处理；C：卷积平滑；D：一阶卷积求导；E：二阶卷积求导；F：标准正态变量变换；G：多元散射校正；H：归一化法；I：一阶卷积求导+多元散射校正。图1中A～I的横坐标均为波数，单位为cm-1，波数范围为4000～11000；纵坐标均为吸光度。由图1可知，经过对上述9种预处理光谱的得到的校正模型进行比较，得出最佳预处理方法是二阶卷积求导。
(5)然后采用相关系数法选择波长区间的波段选择方法，采用偏最小二乘法对特征波段的光谱数据和孕马尿中对应的结合雌激素真实含量值做回归拟合计算，建立校正模型，不同结合雌激素的校正模型如表2所示：
表2实施例1不同结合雌激素的校正模型
实施例1中雌酮硫酸钠校正模型下的各参数图如图2所示，图2中依次为雌酮硫酸钠校正模型交互验证的相关系数图、SEC与主因子数的趋势变化图、SECV与主因子数的趋势变化图。
实施例1中马烯雌酮硫酸钠校正模型下的各参数图如图3所示，图3中依次为马烯雌酮硫酸钠校正模型交互验证的相关系数图、SEC与主因子数的趋势变化图、SECV与主因子数的趋势变化图。
实施例1中17α-二氢马烯雌酮硫酸钠校正模型下的各参数图如图4所示，图4中依次为17-α-二氢马烯雌酮硫酸钠校正模型交互验证的相关系数图、SEC与主因子数的趋势变化图、SECV与主因子数的趋势变化图。
实施例1中总含量校正模型下的各参数图如图5所示，图5中依次为总含量校正模型交互验证的相关系数图、SEC与主因子数的趋势变化图、SECV与主因子数的趋势变化图。
采用留一法对实施例1得到的不同校正模型进行交互验证，结果如表3～表6所示，表3为雌酮硫酸钠校正模型的交换验证结果，表4为马烯雌酮硫酸钠校正模型的交换验证结果，表5为17-α-二氢马烯雌酮硫酸钠校正模型的交换验证结果，表6为雌酮硫酸钠、马烯雌酮硫酸钠和17-α-二氢马烯雌酮硫酸钠总含量校正模型的交换验证结果。从表3～表6的校正模型交互验证结果得出，各预测值和真实值的相对偏差均小于15％，证明该模型具有较好的预测能力。
表3雌酮硫酸钠校正模型的交换验证结果
/>
表4马烯雌酮硫酸钠校正模型的交换验证结果
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表5 17-α-二氢马烯雌酮硫酸钠校正模型的交换验证结果
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/>
表6总含量校正模型的交换验证结果
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/>
对实施例1不同结合雌激素校正模型的预测能力进行检验，将按照实施例1近红外光谱扫描条件用近红外光谱仪采集的校正集原始光谱数据，导入化学计量学分析系统(THUNIR V3.0，清华大学)中，加载不同结合雌激素的校正模型，经系统计算得到预测集的预测值，将预测集的预测值与真实值对照，对校正模型进行检验。雌酮硫酸钠、马烯雌酮硫酸钠、17α-二氢马烯雌酮硫酸钠、总含量的真实值按照实施例1的高效液相色谱法进行测定。其中雌酮硫酸钠校正模型对预测集的预测结果如图6所示；马烯雌酮硫酸钠校正模型对预测集的预测结果如图7所示；17α-二氢马烯雌酮硫酸钠校正模型对预测集的预测结果如图8所示；总含量校正模型对预测集的预测结果如图9所示。
将预测值与真实值进行对比，结果如表7～表9所示，由表7～表9可知：预测值与真实值的绝对偏差均较小，其相对偏差均小于15％，说明建立的校正模型具有良好的预测能力。
表7雌酮验证集样本预测结果
/>
表8马烯雌酮验证集样本预测结果
/>
表9 17-α马烯雌酮验证集样本预测结果
/>
实施例2
按照实施例1的方法提供供试品溶液，按照实施例1的高效液相色谱条件测试供试品溶液中雌酮硫酸钠的真实值含量；
将供试品溶液进行近红外光谱扫描，采集供试品溶液的光谱数据，近红外光谱仪(聚光NIR1500光谱仪)，依据光栅扫描分光原理，光源：卤钨灯；光谱范围1000～1800nm，检测器：InGaAs检测器，分辨率：8cm-1；扫描次数：32次；光程1mm。
每个孕马尿样品重复扫描4次，每测一次平均需要4秒，取平均值作为光谱数据。
对光谱数据进行预处理，并选择建模波段，然后采用相关系数法选择波长区间的波段选择方法，采用偏最小二乘法对特征波段的光谱数据和孕马尿中雌酮硫酸钠真实含量值做回归拟合计算，建立校正模型，雌酮硫酸钠的校正模型如表10所示：
表10实施例2雌酮硫酸钠的校正模型
实施例2中雌酮硫酸钠的SEC/SECV与主因子数的变化趋势关系图如图10所示，当SECV值最小时，所选主因子数最佳，因此，选出主因子数为3。
对实施例2雌酮硫酸钠的校正模型的预测能力进行检验：将按照实施例1近红外光谱扫描条件用近红外光谱仪采集的校正集原始光谱数据，导入化学计量学分析系统(THUNIR V3.0，清华大学)中，加载雌酮硫酸钠的校正模型，经系统计算得到预测集的预测值，将预测集的预测值与真实值对照，对校正模型进行检验，雌酮硫酸钠的真实值与预测值的关系图如图11所示。由图11可知，预测值与真实值的绝对偏差均较小。
实施例2预测值与真实值的相对偏差数据如表11所示，由表11可知，其相对偏差均小于15％，说明建立的校正模型具有良好的预测能力。
表11实施例2真实值、预测值及其相对偏差
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (3)
1.一种利用近红外光谱法快速检测孕马尿中结合雌激素含量的方法，包括以下步骤：
(1)将孕马尿进行样品前处理，得到供试品溶液；
(2)将所述供试品溶液进行近红外光谱扫描，采集供试品溶液的光谱数据；
(3)对步骤(2)采集的光谱数据进行预处理，然后进行波段选择，得到特征波段；采用偏最小二乘法对特征波段的光谱数据和孕马尿中对应的结合雌激素真实含量值做回归拟合计算，建立校正模型；
(4)按照步骤(2)的方法对未知的待测孕马尿供试品溶液进行近红外光谱扫描，将得到的光谱数据导入步骤(3)建立的校正模型，得到孕马尿中结合雌激素的含量；
所述结合雌激素包括雌酮硫酸钠、马烯雌酮硫酸钠和17α-二氢马烯雌酮硫酸钠中的一种或多种；
所述步骤(1)中样品前处理包括以下步骤：
(a)将孕马尿进行离心处理，得到上清液；
(b)将所述上清液用水稀释后，与盐酸混合，得到盐酸溶液；所述盐酸的浓度为0.3~3mol/L；
(c)采用氢氧化钠水溶液调节所述盐酸溶液的pH值为7.0~8.0，然后依次经定容和过滤，取滤液作为供试品溶液；
所述步骤(2)中近红外光谱扫描的参数包括：采用在线或离线检测，以空气为背景，采用透射测样方式，波长检测范围为10000~4000cm-1，扫描次数为32~64次，分辨率为8cm-1，光程为2mm，每个供试品溶液重复扫描3~5次，取平均值作为光谱数据；
所述步骤(3)中波段选择的方法为相关系数法选择波长区间，阈值为0.2~0.3；
所述预处理方法为二阶卷积求导的方法，窗口数为7~11，拟合次数为3次；
所述步骤(3)中不同结合雌激素的校正模型如表1所示：
表1 不同结合雌激素的校正模型
表1中最后一行的总含量指的是：雌酮硫酸钠、马烯雌酮硫酸钠和17α-二氢马烯雌酮硫酸钠三者含量的总和；表1中预测-真实拟合方程中x代表真实值，y代表预测值。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(b)中上清液和水的体积比为1:5~15；所述步骤(b)中上清液和盐酸的体积比为1~5:1。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中结合雌激素的真实含量值由高效液相色谱法对供试品溶液进行测试得到，所述高效液相色谱法的测试参数为：
色谱柱：C18色谱柱；
色谱柱规格：250mm×4.6mm，5μm；
流动相：包括A相和B相，其中A相为磷酸二氢钠水溶液、乙腈和甲醇的混合溶液，所述A相中磷酸二氢钠水溶液的浓度为20mmol/L，pH值为3.5；所述A相中磷酸二氢钠水溶液、乙腈和甲醇的体积比为17:2:1；B相为磷酸氢二钠水溶液和乙腈的混合溶液，所述B相中磷酸氢二钠水溶液的浓度为10mmol/L，pH值为3.5；所述B相中磷酸氢二钠水溶液和乙腈的体积比为3:7；
流动相洗脱程序为：0~18min，A相体积分数由70％逐渐降低为67％；18~23min，A相体积分数由67％逐渐降低为20％；23~28min，A相体积分数由20％逐渐升高为70％；28~35min，A相体积分数稳定在70％；
流速：1.0mL/min；
柱温：40℃；
检测波长：205nm；
进样量：20μL；
不同结合雌激素在同一色谱条件下的不同保留时间处出峰。
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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