CN110988164A - 一种维帕他韦纯度的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种维帕他韦纯度的检测方法，所述方法为高效液相色谱法，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的反相色谱柱，以盐缓冲溶液和有机溶剂为流动相，对维帕他韦样品溶液进行梯度洗脱，按面积归一化法计算维帕他韦的纯度及其多个杂质含量。该方法工艺简单、成本低廉，采用梯度洗脱的方法，能够有效的测定并分离维帕及其制剂中的杂质，检验方法科学、合理、客观，从而能够更好的控制维帕他韦的纯度。

Description

一种维帕他韦纯度的检测方法
技术领域
本发明涉及药物分析领域，具体涉及一种维帕他韦纯度的检测方法。
背景技术
维帕他韦是一种NS5A蛋白酶抑制剂，其CAS号为：1377048-87-4，分子式为C49H54N8O8，分子量为：883.02，化学结构为：
Figure BDA0002295555300000011
维帕他韦是由吉利德公司新开发的一种泛基因型NS5A蛋白酶抑制剂，与索非布韦做成复合制剂(每粒含400mg索非布韦，100mg维帕他韦)，即为伊柯鲁沙(吉利德三代)，适用于全部基因型丙型肝炎，全口服服用，药效远优于吉利德二代，且副作用极小，治疗时间短，仅需12个月。2016年06月28日组合产品维帕他韦/索非布韦获得美国FDA批准。
作为刚刚上市的新药，维帕他韦对丙型肝炎具有非常高的治疗指数，但维帕他韦的药物结构十分复杂，它具有多个对映和非对映异构体杂质，现有的相关技术发明对其合成工艺和可能存在的杂质已有说明，但目前在维帕他韦的质量控制上尚无已公开的检测方法，故本发明旨在提供一种维帕他韦的质量控制方法，用于检测维帕他韦的纯度及其杂质含量。
发明内容
发明目的：本发明目的是提供一种维帕他韦纯度的检测方法，解决了目前在维帕他韦的质量控制上尚无已公开的检测方法的问题。故本发明旨在提供一种维帕他韦的质量控制方法，用于检测维帕他韦的纯度及其杂质含量。
技术方案：本发明一种维帕他韦纯度的检测方法，采用高效液相色谱法，色谱条件为：
供试品溶液：取维帕他韦粉末适量，用甲醇溶解并定量稀释成1.0mg/mL的样品溶液；
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；
流动相A：盐缓冲溶液；
流动相B：有机溶剂；
洗脱方式：梯度洗脱；
纯度计算：按面积归一化法；
梯度洗脱条件如下：
洗脱时间(分钟) 盐缓冲溶液(％) 有机溶剂(％)
0 55～45 45～55
A 0～50 50～100
B 0～50 50～100
C 45～55 55～45
其中，0＜A≤30分钟，30＜B≤45分钟，45＜C≤70分钟。
进一步，所述梯度洗脱条件如下：
洗脱时间(分钟) 盐缓冲溶液(％) 有机溶剂(％)
0 55～45 45～55
A 20～40 60～80
B 30～40 60～70
C 45～50 50～55
其中，10＜A≤30分钟，30＜B≤40分钟，40＜C≤45分钟。
进一步，所述填充剂粒径为3.0μm～5.0μm，色谱柱长为150mm～250mm，色谱柱直径为2.0nm～4.6nm。
进一步，所述色谱柱填充剂粒径为3μm，色谱柱长150mm，色谱柱直径为4.6nm。
进一步，所述盐缓冲溶液为磷酸二氢钾或磷酸二氢钠中的一种，所述有机溶剂为甲醇、乙醇、乙腈、异丙醇、四氢呋喃中的一种或多种。
进一步，所述盐缓冲溶液为磷酸二氢钾，所述有机溶剂为乙腈和甲醇的混合液。
进一步，所述盐缓冲液的浓度为20％～45％，pH控制在3～4之间。
进一步，所述盐缓冲液的浓度为30％，pH为3.5。
本发明还包括一种维帕他韦纯度的检测方法，采用反向高效液相色谱法进行检测，色谱条件为：
供试品溶液：取维帕他韦粉末适量，用甲醇溶解并定量稀释成1.0mg/mL的样品溶液；
检测器：VWD检测器，检测波长为310nm；
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，其中填充剂粒径为3μm，色谱柱长150mm，色谱柱直径为4.6nm；
柱温：40℃；
流速：1.0ml/min；
流动相A：pH为3.5的磷酸二氢钠盐缓冲溶液；
流动相B：乙腈和甲醇，其中乙腈与甲醇的体积比为7：3；
洗脱方式：梯度洗脱；
梯度洗脱条件如下：
洗脱时间 A相(％) B相(％)
0min 50 50
30min 47 53
40min 30 70
45min 45 55
46min 50 50
52min 50 50
取供试品溶液10ul注入高效液相色谱仪，记录色谱图，供试品溶液中如有杂质峰，按面积归一化法计算维帕他韦的纯度。
本发明的有益效果如下：
现有的已公开的维帕他韦的合成路线可知，其具有多个对映和非对映异构体杂质，这些杂质均是在合成工艺中可能产生的，且较难通过优化工艺完全去除。鉴于目前尚无公开的关于维帕他韦的质量控制方法，而本发明显示出对维帕他韦的多个杂质的检测优势，本发明通过大量实验，采用高效液相色谱法梯度洗脱，在该体系条件下，使维帕他韦中十分重要的工艺杂质或降解杂质能够完全分离，即适用于维帕他韦原料，也适用于维帕他韦制剂，为维帕他韦及其制剂提供了一种更可靠、更准确的质量控制方法。
具体实施例
下面结合实施例对本发明做进一步描述，检测方法参照高效液相色谱法(中国药典2010年版二部附录V D)测定：
实施例1
本实施例公开一种维帕他韦纯度的检测方法，采用高效液相色谱法，色谱条件为：
高效液相色谱仪采用Agilent 1260VWD型号的色谱仪；
样品溶液配制：精密称取维帕他韦粉末10mg，置于20ml量瓶中，用甲醇溶解并定量稀释成1.0mg/mL的样品溶液，摇匀，备用；
流动相，A相：量取1000ml浓度为55％的磷酸二氢钠溶液，用10％磷酸水溶液调PH值至3，作为流动相A；
流动相，B相：乙腈/甲醇的混合溶液，其中乙腈与甲醇的体积比为7：3；
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，其中填充剂粒径为3μm，色谱柱长150mm，色谱柱直径为2.0nm；
检测波长：310nm
流速：1.0ml/min
柱温：40℃
进样量：10ul
洗脱梯度条件如表1所示：
洗脱时间 A相(％) B相(％)
0min 55 45
30min 47 53
40min 10 90
45min 10 90
46min 50 50
52min 50 50
表1
最后，取样注入液相色谱仪，记录色谱图，按面积归一化法计算维帕他韦的纯度。
实施例2
本实施例公开一种维帕他韦纯度的检测方法，采用高效液相色谱法，色谱条件为：
高效液相色谱仪：Agilent 1260VWD
样品溶液配制：精密称取维帕他韦粉末10mg，置于20ml量瓶中，用甲醇溶解并定量稀释成1.0mg/mL的样品溶液，摇匀；
流动相，A相：量取1000ml浓度为55％的磷酸二氢钾溶液，用10％磷酸水溶液调PH值至4，作为流动相A；
流动相，B相：乙腈/甲醇的混合溶液，其中乙腈与甲醇的体积比为7：3；
色谱柱：phenomenexGeminil-C18 3μm，4.6*150mm
检测波长：310nm
流速：1.0ml/min
柱温：40℃
进样量：10ul
洗脱梯度条件如表2所示：
洗脱时间 A相(％) B相(％)
0min 55 45
30min 0 100
40min 50 50
45min 10 90
46min 45 55
52min 50 50
表2
最后，取样注入液相色谱仪，记录色谱图，按面积归一化法计算维帕他韦的纯度。
实施例3
本实施例公开一种维帕他韦纯度的检测方法，采用高效液相色谱法，色谱条件为：
高效液相色谱仪：Agilent 1260VWD
样品溶液配制：精密称取维帕他韦粉末10mg，置于20ml量瓶中，用甲醇溶解并定量稀释成1.0mg/mL的样品溶液，摇匀；
流动相，A相：量取1000ml浓度为45％的磷酸二氢钠溶液，用10％磷酸水溶液调PH值至4，作为流动相A；
B相：甲醇/乙醇的混合溶液，其中甲醇/乙醇的体积比为7：3；
色谱柱：phenomenexGeminil-C18 3μm，4.6*150mm
检测波长：310nm
流速：1.0ml/min
柱温：40℃
进样量：10ul
洗脱梯度条件如表3所示：
洗脱时间 A相(％) B相(％)
0min 45 55
20min 20 80
30min 40 60
40min 30 70
45min 40 60
46min 45 55
52min 55 45
表3
最后，取样注入液相色谱仪，记录色谱图，按面积归一化法计算维帕他韦的纯度。
实施例4
本实施例公开一种维帕他韦纯度的检测方法，采用反向高效液相色谱法，色谱条件为：
高效液相色谱仪：反向高效液相色谱法；
检测器：VWD检测器，检测波长为310nm；
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，其中填充剂粒径为3μm，色谱柱长150mm，色谱柱直径为4.6nm；
柱温：40℃；
流速：1.0ml/min；
流动相A：量取1000ml浓度为50％的磷酸二氢钠溶液，用10％磷酸水溶液调PH值至3.5，作为流动相A；
流动相B：乙腈和甲醇的混合溶液，其中乙腈与甲醇的体积比为7：3；
洗脱方式：梯度洗脱；
洗脱梯度条件如表4所示：
Figure BDA0002295555300000061
Figure BDA0002295555300000071
表4
最后，取样注入液相色谱仪，记录色谱图，按面积归一化法计算维帕他韦的纯度。

Claims (9)

1.一种维帕他韦纯度的检测方法，其特征在于,采用高效液相色谱法，色谱条件为：
供试品溶液：取维帕他韦粉末适量，用甲醇溶解并定量稀释成1.0mg/mL的样品溶液；
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；
流动相A：盐缓冲溶液；
流动相B：有机溶剂；
洗脱方式：梯度洗脱；
纯度计算：按面积归一化法；
梯度洗脱条件如下：
洗脱时间(分钟) 盐缓冲溶液(％) 有机溶剂(％) 0 55～45 45～55 A 0～50 50～100 B 0～50 50～100 C 45～55 55～45
其中，0＜A≤30分钟，30＜B≤45分钟，45＜C≤70分钟。
2.根据权利要求1所述的一种维帕他韦纯度的检测方法，其特征在于：所述梯度洗脱条件如下：
洗脱时间(分钟) 盐缓冲溶液(％) 有机溶剂(％) 0 55～45 45～55 A 20～40 60～80 B 30～40 60～70 C 45～50 50～55
其中，10＜A≤30分钟，30＜B≤40分钟，40＜C≤45分钟。
3.根据权利要求1或2所述的一种维帕他韦纯度的检测方法，其特征在于：所述填充剂粒径为3.0μm～5.0μm，色谱柱长为150mm～250mm，色谱柱直径为2.0nm～4.6nm。
4.根据权利要求3所述的一种维帕他韦纯度的检测方法，其特征在于：所述色谱柱填充剂粒径为3μm，色谱柱长150mm，色谱柱直径为4.6nm。
5.根据权利要求1或2所述的一种维帕他韦纯度的检测方法，其特征在于：所述盐缓冲溶液为磷酸二氢钾或磷酸二氢钠中的一种，所述有机溶剂为甲醇、乙醇、乙腈、异丙醇、四氢呋喃中的一种或多种。
6.根据权利要求5所述的一种维帕他韦纯度的检测方法，其特征在于：所述盐缓冲溶液为磷酸二氢钾，所述有机溶剂为乙腈和甲醇的混合液。
7.根据权利要求1或2所述的一种维帕他韦纯度的检测方法，其特征在于：所述盐缓冲液的浓度为20％～45％，pH控制在3～4之间。
8.根据权利要求7所述的一种维帕他韦纯度的检测方法，其特征在于：所述盐缓冲液的浓度为30％，pH为3.5。
9.根据权利要求1～8任意一项所述的一种维帕他韦纯度的检测方法，其特征在于,采用反向高效液相色谱法进行检测，色谱条件为：
供试品溶液：取维帕他韦粉末适量，用甲醇溶解并定量稀释成1.0mg/mL的样品溶液；
检测器：VWD检测器，检测波长为310nm；
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，其中填充剂粒径为3μm，色谱柱长150mm，色谱柱直径为4.6nm；
柱温：40℃；
流速：1.0ml/min；
流动相A：pH为3.5的磷酸二氢钠盐缓冲溶液；
流动相B：乙腈和甲醇，其中乙腈与甲醇的体积比为7：3；
洗脱方式：梯度洗脱；
梯度洗脱条件如下：
洗脱时间 A相(％) B相(％) 0min 50 50 30min 47 53 40min 30 70 45min 45 55 46min 50 50 52min 50 50
取供试品溶液10ul注入高效液相色谱仪，记录色谱图，供试品溶液中如有杂质峰，按面积归一化法计算维帕他韦的纯度。
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