CN115047106B - 一种马来酸阿伐曲泊帕中有关物质的检测方法 - Google Patents

一种马来酸阿伐曲泊帕中有关物质的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种马来酸阿伐曲泊帕中有关物质的检测方法，选择选择包含高氯酸的水‑甲醇混合溶液和高氯酸的乙腈‑甲醇混合溶液作为混合流动相进行梯度洗脱，在梯度洗脱过程中，控制流动相中高氯酸的含量，检测出的杂质多、灵敏度高、专属性好，各杂质峰之间、阿伐曲泊帕主峰及其相邻杂质峰之间的分离度好，对研究杂质均能有效分离，能快速、有效、准确的监控马来酸阿伐曲泊帕中的有关物质。

Description

一种马来酸阿伐曲泊帕中有关物质的检测方法
技术领域
本发明属于药物分析技术领域，具体涉及一种马来酸阿伐曲泊帕中有关物质的检测方法。
背景技术
马来酸阿伐曲泊帕（Avatrombopag Maleate），化学名称为1-（3-氯-5-{[4-（4-氯噻吩-2-基）-5-（4-环己基哌嗪-1-基）-1,3-噻唑-2-基]氨甲酰}吡啶-2-基）哌啶-4-羧酸马来酸盐，其分子式为C29H34Cl2N6O3S2·C4H4O4，分子量为765.73，其结构式如下：
马来酸阿伐曲泊帕是血小板生成素受体激动药，通过刺激骨髓祖细胞的增殖和巨核细胞分化，增加血小板的生成。用于计划接受手术的慢性肝病成年患者的血小板减少症。对先前治疗反应不足的慢性免疫性血小板减少症成年患者的血小板减少症。
为了保证药物的安全有效，对药物的有关物质进行研究、检测和监控。
发明内容
本发明的目的是在现有技术的基础上， 提供一种马来酸阿伐曲泊帕中有关物质的检测方法，检测出的杂质多、灵敏度高、专属性好，各杂质峰之间、阿伐曲泊帕主峰及其相邻杂质峰之间的分离度好，对研究杂质均能有效分离，能快速、有效、准确的监控马来酸阿伐曲泊帕中的有关物质。
本发明的技术方案如下：
一种马来酸阿伐曲泊帕中有关物质的检测方法，该检测方法采用高效液相色谱法，其色谱条件包括：色谱柱为Zorbax Bonus-RP；采用流动相A和流动相B为混合流动相进行梯度洗脱；其中，流动相A为包含0.15~0.25%高氯酸的水-甲醇混合溶液，在流动相A中水和甲醇的体积比为940~960:60~40；流动相B为包含0.15~0.25%高氯酸的乙腈-甲醇混合溶液，在流动相B中乙腈和甲醇的体积比为940~960:60~40；所述梯度洗脱过程如下：（1）在0-35分钟内，流动相A和流动相B的体积比由70:30匀速渐变至45:55；（2）在35-45分钟内，流动相A和流动相B的体积比由45:55匀速渐变至0:100；（3）在45-50分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持0:100不变。
本发明通过筛选流动相以及优化流动相的比例，选择包含高氯酸的水-甲醇混合溶液和高氯酸的乙腈-甲醇混合溶液作为混合流动相进行梯度洗脱，在梯度洗脱的过程中，控制流动相中高氯酸的含量为0.15~0.25%，在其他条件配合下，各杂质峰之间、阿伐曲泊帕主峰及其相邻杂质峰之间的分离度高，即可快速、有效、准确监控马来酸阿伐曲泊帕中的有关物质。
本发明提供的检测方法，流动相A采用包含高氯酸的水-甲醇混合溶液，流动相B为包含高氯酸的乙腈-甲醇混合溶液，在梯度洗脱时，流动相A和/或流动相B中高氯酸的含量为0.15~0.25%，流动相中高氯酸的含量过高或者过低会影响主峰与杂质峰之间的分离效果。当流动相A和/或流动相B中高氯酸的含量过高，例如，流动相A和流动相B中高氯酸的含量0.3%，杂质4和杂质5重合为一个色谱峰，分离度低，分离效果不佳；当流动相A和/或流动相B中高氯酸的含量过低，例如，流动相A和流动相B中高氯酸的含量0.1%，杂质1和马来酸未达到基线分离，分离效果不佳。
对于本发明而言，流动相A采用包含高氯酸的水-甲醇混合溶液，具体高氯酸的含量可以但不局限于0.15%、0.16%、0.17%、0.18%、0.19%、0.20%、0.21%、0.22%、0.23%、0.24%或0.25%，为了获得更好的效果，流动相A中高氯酸胺的含量0.2%。
在流动相A中，水和甲醇的体积比为940~960:60~40，可以但不局限于940:60、945:55、950:50、955:45、960:40，为了获得更好的效果，在流动相A中，水和甲醇的体积比为950~50。
流动相B采用包含高氯酸的乙腈-甲醇混合溶液，具体高氯酸胺的含量可以但不局限于0.15%、0.16%、0.17%、0.18%、0.19%、0.20%、0.21%、0.22%、0.23%、0.24%或0.25%，为了获得更好的效果，流动相B中高氯酸胺的含量0.2%。
在流动相B中，乙腈和甲醇的体积比为940~960:60~40，可以但不局限于940:60、945:55、950:50、955:45、960:40，为了获得更好的效果，在流动相B中，乙腈和甲醇的体积比为950~50。
本发明提供的检测方法，在选择最佳的流动相之后，需要筛选出恰当的色谱柱。在色谱法中，色谱柱的选择十分重要，本发明在探索高效液相色谱条件时，也尝试了大量其他色谱柱，结果发现，选择性不佳，阿伐曲泊帕主峰及其相邻杂质峰之间的分离度较低，分离度效果较差。例如，选择色谱柱为YMC-Triant C18 ExRS，杂质6与阿伐曲泊帕峰未达到基线分离，分离效果较差。而本发明采用Zorbax Bonus-RP作为色谱柱，在其他条件配合下，各杂质峰之间、阿伐曲泊帕主峰及其相邻杂质峰之间的分离度高，即可快速、有效、准确监控马来酸阿伐曲泊帕中的有关物质。其中，色谱柱的规格可以根据实际需要进行调整，例如，Zorbax Bonus-RP（4×250mm，3.5μm），色谱柱的长度为250mm，直径为4.6mm，填料粒径为3.5µm。
本发明提供的检测方法，采用包含0.15~0.25%高氯酸的水-甲醇混合溶液（流动相A）和0.15~0.25%高氯酸的乙腈-甲醇混合溶液（流动相B）作为混合流动相进行梯度洗脱，在色谱分析时，选择色谱柱和流动相浓度后，需要确定洗脱过程是等度洗脱或是梯度洗脱，以及洗脱过程中不同时间段中流动相A和流动相B的比例，都会影响分析物在色谱柱上的响应，以及主峰后溶剂峰会不会干扰主峰的分析。
对于本发明而言，由于有关物质的结构与阿伐曲泊帕的结构相似，在梯度洗脱过程的时间和流动相的比例并不是可以随机选择的，是需要进行大量的实验和分析确定的，否则，各杂质之间、阿伐曲泊帕主峰及其相邻杂质峰之间的分离度较低，无法区分出各杂质峰与阿伐曲泊帕主峰，从而产生误判本品质量的严重后果。采用本发明的梯度洗脱过程进行色谱分析，检测出的杂质多、灵敏度高、专属性好，各杂质峰之间、阿伐曲泊帕主峰及其相邻杂质峰之间的分离度好，对研究杂质均能有效分离，能快速、有效、准确的监控马来酸阿伐曲泊帕中的有关物质。
对于本发明而言，柱温为30-60℃，具体的柱温可以但不局限于30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃或60℃。为了获得更好的分离效果，优选柱温为45-55℃，更优选为50℃。
进一步地，色谱条件包括：检测波长为220~270nm，优选为254nm。
进一步地，流速为0.8-1.2ml/min，优选1.0ml/min。
进一步地，色谱条件包括：进样量为5-50μl，可以但不局限于5μl、10μl、15μl、20μl、30μl或50μl，优选为10μl。
在本发明中，溶解样品的溶剂为包含0.1%三氟乙酸的水-乙腈混合溶液，在水-乙腈混合溶液中水和乙腈的体积比为40~60:60~40，可以但不局限于40:60、45:55、50:50、55:45或60:40，为了获得更好的效果，溶解样品的溶剂为包含0.1%三氟乙酸的水-乙腈混合溶液，在水-乙腈混合溶液中水和乙腈的体积比为50:50。
本发明提及的马来酸阿伐曲泊帕中有关物质的检测方法，所述有关物质包括：
本发明提供的检测方法的具体步骤为：分别配制杂质及主成分定位溶液和供试品溶液并进样，计算杂质的含量。
本发明提供的检测方法，在配制上述溶液时，所选择的溶剂为溶解样品的溶剂为包含0.1%三氟乙酸的水-乙腈混合溶液（水和乙腈的体积比为50:50）。
其中，杂质及马来酸阿伐曲泊帕（主成分）定位溶液为：取杂质1、2、3、4、5、6和马来酸阿伐曲泊帕样品，加溶剂（0.1%三氟乙酸-水-乙腈混合溶液，水和乙腈的体积比为50:50）溶解并稀释制成每1ml中约含各杂质1μg和马来酸阿伐曲泊帕1mg的溶液，作为杂质及马来酸阿伐曲泊帕的定位溶液。
供试品溶液为：取马来酸阿伐曲泊帕，加溶剂（0.1%三氟乙酸-水-乙腈混合溶液，水和乙腈的体积比为50:50）溶解并稀释制成每1ml中约含1mg的溶液。
本发明通过筛选合适流动相并优化流动相中各组分比例，以及筛选合适的其他色谱条件，对阿伐曲泊帕以及上述的各杂质进行色谱检测，确定了本发明检测方法，通过对各杂质和马来酸阿伐曲泊帕峰定位试验，干扰性试验和阿伐曲泊帕的降解试验对本发明进行专属性验证。
采用本发明的技术方案，优势如下:
本发明提供的马来酸阿伐曲泊帕中有关物质的检测方法，选择选择包含高氯酸的水-甲醇混合溶液和高氯酸的乙腈-甲醇混合溶液作为混合流动相进行梯度洗脱，在梯度洗脱过程中，控制流动相中高氯酸的含量，检测出的杂质多、灵敏度高、专属性好，各杂质峰之间、阿伐曲泊帕主峰及其相邻杂质峰之间的分离度好，对研究杂质均能有效分离，能快速、有效、准确的监控马来酸阿伐曲泊帕中的有关物质。
附图说明
图1是杂质及马来酸阿伐曲泊帕定位溶液的高效液相色谱图；
图2是实施例1中供试品溶液的高效液相色谱图；
图3是对比例1中主成分和杂质混合溶液的高效液相色谱图；
图4是对比例2中主成分和杂质混合溶液的高效液相色谱图；
图5是对比例3中主成分和杂质混合溶液的高效液相色谱图；
图6是对比例4中主成分和杂质混合溶液的高效液相色谱图；
图7是对比例5中主成分和杂质混合溶液的高效液相色谱图；
图8是实施例2中主成分和杂质混合溶液的高效液相色谱图；
图9是实施例3中主成分和杂质混合溶液的高效液相色谱图。
具体实施方式
通过以下实施例并结合附图对本发明的检测方法作进一步的说明，但这些实施例不对本发明构成任何限制。
实施例1
高效液相色谱条件：用烷基酰胺基键合硅胶为填充剂（Zorbax Bonus-RP，4.6mm×250mm，3.5μm）；以包含0.2%高氯酸的水-甲醇混合溶液为流动相A，在流动相A中水和甲醇的体积比为950:50；以包含0.2%高氯酸的乙腈-甲醇混合溶液为流动相B，在流动相B中乙腈和甲醇的体积比为950:50；按如下梯度洗脱过程进行梯度洗脱；流速为每分钟1.0ml；柱温为50℃；检测波长为254nm；进样体积10μl。
梯度洗脱过程为：（1）在0-35分钟内，流动相A和流动相B的体积比由70:30匀速渐变至45:55；（2）在35-45分钟内，流动相A和流动相B的体积比由45:55匀速渐变至0:100；（3）在45-50分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持0:100不变。
样品配制：
取马来酸阿伐曲泊帕供试品，加溶剂（0.1%三氟乙酸-水-乙腈混合溶液，水和乙腈的体积比为50:50）使溶解制成每1ml中约含马来酸阿伐曲泊帕1mg的溶液，作为供试品溶液。
试验操作：取供试品溶液10μl进样，记录色谱图，典型色谱图见图2。
取马来酸阿伐曲泊帕配制供试品溶液，进样并记录色谱图，以主成分自身对照法计算供试品中杂质的含量，结果见表1。
表1马来酸阿伐曲泊帕中各杂质的含量测定结果
杂质 杂质5 杂质2 最大单杂 总杂
含量（%） 0.039 0.066 0.043 0.268
由表1和图2可以看出，马来酸阿伐曲泊帕供试品中检出已知杂质5和杂质2，最大单杂为0.043%，总杂为0.268%。杂质个数为8个。
本发明通过筛选合适流动相并优化流动相中各组分比例，对马来酸阿伐曲泊帕以及6个杂质进行色谱检测，确定了本发明实施例1的检测方法。
通过对各杂质和马来酸阿伐曲泊帕的峰定位试验，干扰试验和降解试验对本发明进行专属性验证。
杂质及马来酸阿伐曲泊帕定位溶液的配制：取杂质1、2、3、4、5、6和马来酸阿伐曲泊帕样品，加溶剂（0.1%三氟乙酸-水-乙腈混合溶液，水和乙腈的体积比为50:50）溶解并稀释制成每1ml中约含各杂质1μg和马来酸阿伐曲泊帕1mg的溶液，作为杂质及马来酸阿伐曲泊帕的定位溶液。
取杂质和马来酸阿伐曲泊帕定位溶液，按实施例1中的高效液相色谱条件和方法进行检测，结果见表2和图1。
表2 专属性验证结果
杂质 马来酸 杂质1 杂质3 主成分 杂质5 杂质4 杂质6 杂质2
保留时间（min） 4.0 6.504 10.105 33.104 34.019 34.727 36.272 41.104
分离度 / 18.07 80.70 2.91 2.61 5.31 22.28
由表2和图1可以看出，各杂质峰之间，阿伐曲泊帕主峰及其相邻杂质峰之间的分离度均大于2.0，峰纯度均较好，本发明的专属性好。
分别取杂质1、2、3、4、5、6和马来酸阿伐曲泊帕对照品各适量，精密称定，制成每1ml中约含马来酸阿伐曲泊帕、杂质1、2、3、4、5、6依次为5.0μg、5.0μg、7.5μg、5.0μg、5.0μg、7.5μg、5.0μg的混合溶液，摇匀，作为对照品储备溶液。精密量取适量，加溶剂稀释制成定量限、20%、50%、80%、100%、120%、150%的溶液。
以浓度μg/ml为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归并求出回归方程，马来酸阿伐曲泊帕及杂质的线性范围及线性方程见表3。
取上述杂质及主成分逐步稀释后进样10μl，以 S/N≥10为定量限，以S/N≥3为检测限，结果见表3。
表3 马来酸阿伐曲泊帕和各杂质的检测限、定量限、线性结果
由表3可以看出，采用本发明的检测方法，马来酸阿伐曲泊帕和各杂质检测灵敏度均较高，各杂质在较低浓度范围内线性关系良好。
杂质对照品储备液：取杂质1、2、3、4、5、6对照品各适量，精密称定，用溶剂（0.1%三氟乙酸-水-乙腈混合溶液，水和乙腈的体积比为50:50）溶解并稀释至刻度，制成每1ml中约含杂质1、2、3、4、5、6依次为5.0μg/ml、5.0μg/ml、7.5μg/ml、5.0（μg/ml）、5.0μg/ml、7.5μg/ml、5.0μg/ml的混合溶液。
取马来酸阿伐曲泊帕供试品适量，加溶剂（0.1%三氟乙酸-水-乙腈混合溶液，水和乙腈的体积比为50:50）使溶解制成每1ml中约含马来酸阿伐曲泊帕1mg的溶液，作为本底溶液。
取马来酸阿伐曲泊帕供试品约25mg，分别杂质对照品储备液2.5ml、5.0ml、7.5ml，加溶剂（0.1%三氟乙酸-水-乙腈混合溶液，水和乙腈的体积比为50:50）稀释至刻度，各平行配制3份，作为回收率供试品溶液。
取上述本底溶液、回收率供试品溶液各10μl注入液相色谱仪，进行回收率试验，结果见表4。
表4 马来酸阿伐曲泊帕和各杂质的回收率结果
有表4可以看出，本发明的回收率试验符合要求，回收率高。
对比例1
高效液相色谱条件：用烷基酰胺基键合硅胶为填充剂（Zorbax Bonus-RP，4.6mm×250mm，3.5μm）；以包含0.1%高氯酸的水-甲醇混合溶液为流动相A，在流动相A中水和甲醇的体积比为950:50；以包含0.1%高氯酸的乙腈-甲醇混合溶液为流动相B，在流动相B中乙腈和甲醇的体积比为950:50；按如下梯度洗脱过程进行梯度洗脱；流速为每分钟1.0ml；柱温为50℃；检测波长为254nm；进样体积10μl。
梯度洗脱过程为：（1）在0-35分钟内，流动相A和流动相B的体积比由70:30匀速渐变至45:55；（2）在35-45分钟内，流动相A和流动相B的体积比由45:55匀速渐变至0:100；（3）在45-50分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持0:100不变。
样品配制：
取马来酸阿伐曲泊帕供试品以及杂质1、2、3、4、5、6，加溶剂（0.1%三氟乙酸-水-乙腈混合溶液，水和乙腈的体积比为50:50）溶解并稀释制成每1ml中约含各杂质1μg和马来酸阿伐曲泊帕1mg的溶液，作为主成分和杂质混合溶液。
试验操作：取主成分和杂质混合溶液10μl进样，记录色谱图，典型色谱图见图3。
由图3可知，杂质1与马来酸未达到基线分离，分离度不佳。
对比例2
高效液相色谱条件：用烷基酰胺基键合硅胶为填充剂（Zorbax Bonus-RP，4.6mm×250mm，3.5μm）；以包含0.3%高氯酸的水-甲醇混合溶液为流动相A，在流动相A中水和甲醇的体积比为950:50；以包含0.3%高氯酸的乙腈-甲醇混合溶液为流动相B，在流动相B中乙腈和甲醇的体积比为950:50；按如下梯度洗脱过程进行梯度洗脱；流速为每分钟1.0ml；柱温为50℃；检测波长为254nm；进样体积10μl。
梯度洗脱过程为：（1）在0-35分钟内，流动相A和流动相B的体积比由70:30匀速渐变至45:55；（2）在35-45分钟内，流动相A和流动相B的体积比由45:55匀速渐变至0:100；（3）在45-50分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持0:100不变。
样品配制：
取马来酸阿伐曲泊帕供试品以及杂质1、2、3、4、5、6，加溶剂（0.1%三氟乙酸-水-乙腈混合溶液，水和乙腈的体积比为50:50）溶解并稀释制成每1ml中约含各杂质1μg和马来酸阿伐曲泊帕1mg的溶液，作为主成分和杂质混合溶液。
试验操作：取主成分和杂质混合溶液10μl进样，记录色谱图，典型色谱图见图4。
由图4可知，杂质4和杂质5重合为一个峰，分离度不佳。
对比例3
高效液相色谱条件：用烷基酰胺基键合硅胶为填充剂（Zorbax Bonus-RP，4.6mm×250mm，3.5μm）；以包含0.2%高氯酸的水-甲醇混合溶液为流动相A，在流动相A中水和甲醇的体积比为950:50；以包含0.2%高氯酸的乙腈-甲醇混合溶液为流动相B，在流动相B中乙腈和甲醇的体积比为950:50；按如下梯度洗脱过程进行梯度洗脱；流速为每分钟1.0ml；柱温为50℃；检测波长为254nm；进样体积10μl。
梯度洗脱过程为：（1）在0-5分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持70:30不变；（2）在5-35分钟内，流动相A和流动相B的体积比由70:30匀速渐变至45:55；（2）在35-45分钟内，流动相A和流动相B的体积比由45:55匀速渐变至0:100；（3）在45-50分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持0:100不变。
样品配制：
取马来酸阿伐曲泊帕供试品以及杂质1、2、3、4、5、6，加溶剂（0.1%三氟乙酸-水-乙腈混合溶液，水和乙腈的体积比为50:50）溶解并稀释制成每1ml中约含各杂质1μg和马来酸阿伐曲泊帕1mg的溶液，作为主成分和杂质混合溶液。
试验操作：取主成分和杂质混合溶液10μl进样，记录色谱图，典型色谱图见图5。
由图5可知，杂质1与马来酸未达到基线分离，分离度不佳。
对比例4
高效液相色谱条件：用烷基酰胺基键合硅胶为填充剂（YMC-Triant C18 ExRS，4.6mm×250mm，5μm）；以包含0.2%高氯酸的水-甲醇混合溶液为流动相A，在流动相A中水和甲醇的体积比为950:50；以包含0.2%高氯酸的乙腈-甲醇混合溶液为流动相B，在流动相B中乙腈和甲醇的体积比为950:50；按如下梯度洗脱过程进行梯度洗脱；流速为每分钟1.0ml；柱温为50℃；检测波长为254nm；进样体积10μl。
梯度洗脱过程为：（1）在0-35分钟内，流动相A和流动相B的体积比由70:30匀速渐变至45:55；（2）在35-45分钟内，流动相A和流动相B的体积比由45:55匀速渐变至0:100；（3）在45-50分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持0:100不变。
样品配制：
取马来酸阿伐曲泊帕供试品以及杂质1、2、3、4、5、6，加溶剂（0.1%三氟乙酸-水-乙腈混合溶液，水和乙腈的体积比为50:50）溶解并稀释制成每1ml中约含各杂质1μg和马来酸阿伐曲泊帕1mg的溶液，作为主成分和杂质混合溶液。
试验操作：取主成分和杂质混合溶液10μl进样，记录色谱图，典型色谱图见图6。
由图6可知，杂质6与阿伐曲泊帕峰重合。
表5 专属性验证结果
杂质 杂质3 杂质1 主成分/杂质6 杂质5 杂质4 杂质2
保留时间（min） 6.204 9.734 30.117 31.577 38.249 42.164
分离度 / 16.6 53.7 3.45 20.7 17.3
对比例5
高效液相色谱条件：用烷基酰胺基键合硅胶为填充剂（Zorbax Bonus-RP，4.6mm×250mm，3.5μm）；以包含0.2%三氟乙酸的水-甲醇混合溶液为流动相A，在流动相A中水和甲醇的体积比为950:50；以包含0.2%三氟乙酸的乙腈-甲醇混合溶液为流动相B，在流动相B中乙腈和甲醇的体积比为950:50；按如下梯度洗脱过程进行梯度洗脱；流速为每分钟1.0ml；柱温为50℃；检测波长为254nm；进样体积10μl。
梯度洗脱过程为：（1）在0-35分钟内，流动相A和流动相B的体积比由70:30匀速渐变至45:55；（2）在35-45分钟内，流动相A和流动相B的体积比由45:55匀速渐变至0:100；（3）在45-50分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持0:100不变。
样品配制：
取马来酸阿伐曲泊帕供试品以及杂质1、2、3、4、5、6，加溶剂（0.1%三氟乙酸-水-乙腈混合溶液，水和乙腈的体积比为50:50）溶解并稀释制成每1ml中约含各杂质1μg和马来酸阿伐曲泊帕1mg的溶液，作为主成分和杂质混合溶液。
试验操作：取主成分和杂质混合溶液10μl进样，记录色谱图，典型色谱图见图7。
由图7可知，杂质4和杂质5未达到基线分离，分离度不佳。
表6 专属性验证结果
杂质 马来酸 杂质1 杂质3 主成分 杂质5 杂质4 杂质6 杂质2
保留时间（min） 3.056 4.833 10.535 27.796 28.745 29.041 31.022 37.474
分离度 / 10.5 25.7 56.5 2.81 1.05 6.93 23.1
实施例2
高效液相色谱条件：用烷基酰胺基键合硅胶为填充剂（Zorbax Bonus-RP，4.6mm×250mm，3.5μm）；以包含0.2%高氯酸的水-甲醇混合溶液为流动相A，在流动相A中水和甲醇的体积比为950:50；以包含0.2%高氯酸的乙腈-甲醇混合溶液为流动相B，在流动相B中乙腈和甲醇的体积比为950:50；按如下梯度洗脱过程进行梯度洗脱；流速为每分钟1.0ml；柱温为45℃；检测波长为254nm；进样体积10μl。
梯度洗脱过程为：（1）在0-35分钟内，流动相A和流动相B的体积比由70:30匀速渐变至45:55；（2）在35-45分钟内，流动相A和流动相B的体积比由45:55匀速渐变至0:100；（3）在45-50分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持0:100不变。
样品配制：
取马来酸阿伐曲泊帕供试品以及杂质1、2、3、4、5、6，加溶剂（0.1%三氟乙酸-水-乙腈混合溶液，水和乙腈的体积比为50:50）溶解并稀释制成每1ml中约含各杂质1μg和马来酸阿伐曲泊帕1mg的溶液，作为主成分和杂质混合溶液。
试验操作：取主成分和杂质混合溶液10μl进样，记录色谱图，典型色谱图见图8。
由图8可知，主成分与相邻杂质以及各杂质之间均能够达到基线分离，分离度较好，其中，杂质5与杂质4之间的分离度略小于实施例1中分离度。
实施例3
高效液相色谱条件：用烷基酰胺基键合硅胶为填充剂（Zorbax Bonus-RP，4.6mm×250mm，3.5μm）；以包含0.2%高氯酸的水-甲醇混合溶液为流动相A，在流动相A中水和甲醇的体积比为950:50；以包含0.2%高氯酸的乙腈-甲醇混合溶液为流动相B，在流动相B中乙腈和甲醇的体积比为950:50；按如下梯度洗脱过程进行梯度洗脱；流速为每分钟1.0ml；柱温为55℃；检测波长为254nm；进样体积10μl。
梯度洗脱过程为：（1）在0-35分钟内，流动相A和流动相B的体积比由70:30匀速渐变至45:55；（2）在35-45分钟内，流动相A和流动相B的体积比由45:55匀速渐变至0:100；（3）在45-50分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持0:100不变。
样品配制：
取马来酸阿伐曲泊帕供试品以及杂质1、2、3、4、5、6，加溶剂（0.1%三氟乙酸-水-乙腈混合溶液，水和乙腈的体积比为50:50）溶解并稀释制成每1ml中约含各杂质1μg和马来酸阿伐曲泊帕1mg的溶液，作为主成分和杂质混合溶液。
试验操作：取主成分和杂质混合溶液10μl进样，记录色谱图，典型色谱图见图9。
由图9可知，主成分与相邻杂质以及各杂质之间均能够达到基线分离，分离度较好，与实施例1中分离度相当。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可能对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (15)

1.一种马来酸阿伐曲泊帕中有关物质的检测方法，其特征在于，该检测方法采用高效液相色谱法，其色谱条件包括：色谱柱为Zorbax Bonus-RP；采用流动相A和流动相B为混合流动相进行梯度洗脱；所述流动相A为包含0.15~0.25%高氯酸的水-甲醇混合溶液，在流动相A中水和甲醇的体积比为940~960:60~40；所述流动相B为包含0.15~0.25%高氯酸的乙腈-甲醇混合溶液，在流动相B中乙腈和甲醇的体积比为940~960:60~40；所述梯度洗脱过程如下：（1）在0-35分钟内，流动相A和流动相B的体积比由70:30匀速渐变至45:55；（2）在35-45分钟内，流动相A和流动相B的体积比由45:55匀速渐变至0:100；（3）在45-50分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持0:100不变；
所述有关物质包括：
阿伐曲泊帕主峰及上述有关杂质峰之间的分离度均大于2.0。
2.根据权利要求1所述的马来酸阿伐曲泊帕中有关物质的检测方法，其特征在于，所述流动相A为包含0.2%高氯酸的水-甲醇混合溶液，在流动相A中水和甲醇的体积比为950:50。
3.根据权利要求1所述的马来酸阿伐曲泊帕中有关物质的检测方法，其特征在于，所述流动相B为包含0.2%高氯酸的乙腈-甲醇混合溶液，在流动相B中乙腈和甲醇的体积比为950:50。
4.根据权利要求1所述的马来酸阿伐曲泊帕中有关物质的检测方法，其特征在于，色谱柱的长度为250mm，直径为4.6mm，填料粒径为3.5µm。
5.根据权利要求1所述的马来酸阿伐曲泊帕中有关物质的检测方法，其特征在于，所述色谱条件包括：柱温为30-60℃。
6.根据权利要求5所述的马来酸阿伐曲泊帕中有关物质的检测方法，其特征在于，所述色谱条件包括：柱温为45-55℃。
7.根据权利要求6所述的马来酸阿伐曲泊帕中有关物质的检测方法，其特征在于，所述色谱条件包括：柱温为50℃。
8.根据权利要求1所述的马来酸阿伐曲泊帕中有关物质的检测方法，其特征在于，所述色谱条件包括：检测波长为220~270nm。
9.根据权利要求8所述的马来酸阿伐曲泊帕中有关物质的检测方法，其特征在于，所述色谱条件包括：检测波长为254nm。
10.根据权利要求1所述的马来酸阿伐曲泊帕中有关物质的检测方法，其特征在于，所述色谱条件包括：流速为0.8-1.2ml/min。
11.根据权利要求10所述的马来酸阿伐曲泊帕中有关物质的检测方法，其特征在于，所述色谱条件包括：流速为1.0ml/min。
12.根据权利要求1所述的马来酸阿伐曲泊帕中有关物质的检测方法，其特征在于，所述色谱条件包括：进样量为5-50μl。
13.根据权利要求12所述的马来酸阿伐曲泊帕中有关物质的检测方法，其特征在于，所述色谱条件包括：进样量为10μl。
14.根据权利要求1所述的马来酸阿伐曲泊帕中有关物质的检测方法，其特征在于，溶解样品的溶剂为包含0.1%三氟乙酸的水-乙腈混合溶液，在水-乙腈混合溶液中水和乙腈的体积比为40~60:60~40。
15.根据权利要求14所述的马来酸阿伐曲泊帕中有关物质的检测方法，其特征在于，在水-乙腈混合溶液中水和乙腈的体积比为50:50。
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