CN102786550B - 具有开启式磷光发射的铱配合物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于有机光电材料技术领域，具体涉及一类具有开启式磷光发射的铱配合物及其制备方法和在化学/生物传感以及细胞标记、成像领域中的应用。该类配合物材料由环金属配体、金属中心和吡啶羧酸衍生物配体组成，结构通式如下。该材料合成步骤简单、条件温和，通过配合物中2,4-二硝基苯磺酰氯基团与半胱氨酸和高半胱氨酸的巯基发生反应生成羟基，导致铱配合物的磷光发射从无到有，实现了开启式半胱氨酸和高半胱氨酸磷光探针，在细胞成像领域具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于有机光电材料技术领域。具体涉及一类开启式磷光探针的制备方法及其在半胱氨酸和高半胱氨酸检测、细胞标记、成像领域中的应用。
背景技术
氨基酸在人体生理活动中起到重要的作用，含有巯基（-SH）的氨基酸如高半胱氨酸（Hcy）、半胱氨酸（Cys）和谷胱甘肽（GSH）与人体一些重要的疾病密切相关，所以，近年来，对于含有巯基的氨基酸的检测发展迅速。人们对细胞内的氨基酸的检测，研究越发的深入。荧光标记和成像分析是当前广泛应用于活细胞分析的一种有效的可视化分析技术。当前，应用于活细胞标记和成像分析领域的荧光探针多为小分子有机荧光染料分子。
磷光重金属铱配合物具有良好地光物理性质，例如较长的发射寿命、良好地光化学稳定性、室温下高的三线态光量子效率、易调节的发射波长、大的斯托克斯位移和可见光区激发等优点，当前，已经应用于电致发光和发光电化学池器件、生物传感等领域。更重要的是，相对于小分子有机荧光染料分子，磷光重金属配合物长的发射寿命可使用时间分辨技术与背景荧光信号相区分以提高检测的灵敏度和信噪比。
在生物标记和成像应用上，开启式磷光探针具有明显的优势。可以实现裸眼检测。大多数开启式磷光探针，都具有强的吸电子基，可以猝灭配合物自身的荧光，探针本身不发光。当加入含有巯基的氨基酸后，强吸电子基脱去，探针发光，实现了对含有巯基的氨基酸的裸眼检测。
在众多磷光重金属配合物中，铱配合物由于发光量子效率高、发射光谱易调节而受到更多关注。因此，研究发明基于磷光铱配合物的开启式氨基酸磷光探针，具有非常重要的意义。
发明内容
技术问题：本发明的目的在于提供一类具有开启式磷光发射的铱配合物及其制备方法，并提出这类配合物在半胱氨酸和高半胱氨酸检测、细胞标记和成像中的应用。
技术方案： 本发明的具有开启式磷光发射的铱配合物具有如下结构式：
其中，C^N配体为2-(2′,4′-二氟苯基)吡啶、2-苯基吡啶、2-(2′-噻吩基)喹啉、2-苯基喹啉、1-苯基异喹啉或2-(2′-苯并噻吩基)吡啶，R是O或者NH。
本发明的具有开启式磷光发射的铱配合物的制备方法的合成路线如下：
具体是将C^N配体与三氯化铱加入到乙二醇乙醚和水的混合溶剂中，加热搅拌，制备二氯桥中间体，将二氯桥中间体,乙二醇乙醚和碳酸钠存在条件下与3-羟基-2吡啶羧酸加热回流制备铱配合物1’，在N2保护条件下，将铱配合物1’溶于二氯甲烷和三乙胺溶液中，逐滴滴加2,4-二硝基苯磺酰氯溶液，搅拌2-8小时；反应结束后，冷却至室温后，旋出二氯甲烷和三乙胺溶液，将旋得的固体用柱层析方法分离，即得到具有开启式磷光发射的铱配合物1。
本发明的具有开启式磷光发射的铱配合物应用于半胱氨酸和高半胱氨酸探针，应用于细胞标记和成像，应用于时间分辨磷光探针。
有益效果：通过核磁共振（NMR）、色质联机（GCMS）、基质辅助激光解析时间飞行质谱（MALDI-TOF-MS）等表征铱配合物材料及中间体的结构，通过紫外吸收光谱、荧光发射光谱、瞬态荧光光谱测试，研究这一系列铱配合物的光物理性质。
磷光重金属铱配合物具有良好地光物理性质，例如较长的发射寿命、良好地光化学稳定性、室温下高的三线态光量子效率、易调节的发射波长、大的斯托克斯位移和可见光区激发等优点，当前，已经应用于电致发光和发光电化学池器件、生物传感等领域。相对于小分子有机荧光染料分子，磷光重金属配合物长的发射寿命可使用时间分辨技术与背景荧光信号相区分以提高检测的灵敏度和信噪比。
附图说明
图1. 本发明中合成的配合物的紫外-可见滴定光谱图。
图2. 本发明中合成的配合物的荧光发射滴定谱图。
图3. 本发明中合成的配合物的荧光发射竞争谱图。
图4. 本发明中合成的配合物的瞬态荧光谱图。
图5. 本发明中合成的配合物的细胞成像图。
具体实施方式
本发明的含铱配合物的磷光材料的制备是通过在配体中氧原子或者氮氢原子上接入2,4-二硝基苯磺酰氯基团，使铱配合物不发光，当加入含有巯基的高半胱氨酸和半胱氨酸后，2,4-二硝基苯磺酰氯基团脱去，铱配合物发光，实现了磷光探针的开启式，从而在细胞成像领域有良好的应用前景。具有如下结构式：
其中，C^N配体 为2-(2′,4′-二氟苯基)吡啶、2-苯基吡啶、2-（2′-噻吩基）喹啉、2-苯基喹啉、1-苯基异喹啉、2-(2′-苯并噻吩基)吡啶。R可以为氧原子或者氮氢原子。
开启式磷光探针合成路线如下：
具体是将C^N配体与三氯化铱加入到乙二醇乙醚和水的混合溶剂中，加热搅拌，制备二氯桥中间体。将二氯桥中间体,乙二醇乙醚和碳酸钠存在条件下与3-羟基-2吡啶羧酸加热回流制备铱配合物1’。
在N2保护条件下，将铱配合物1’溶于二氯甲烷和三乙胺溶液中，在-10 ℃-10 ℃条件下，逐滴滴加2,4-二硝基苯磺酰氯溶液，搅拌1-10小时；反应结束后，冷却至室温后，旋出二氯甲烷和三乙胺溶液，将旋得的固体用柱层析方法分离，即得到铱配合物1。
开启式磷光探针的应用为：半胱氨酸和高半胱氨酸检测、细胞标记和成像、瞬态荧光。
为了更好地理解本发明专利的内容，下面通过具体的实例来进一步说明本发明的技术方案。但这些实施实例并不限制本发明。
实施例1、C^N配体2-(2′-噻吩基)喹啉的制备：
化合物1：2-胺基苯甲醛的制备
在圆底烧瓶中加入3.8 g 2-硝基苯甲醛，加入85 mL无水乙醇完全溶解，加入10 g Fe粉，85 mL 乙酸，42.5 mL蒸馏水和一滴浓盐酸。在76 ℃回流15分钟。反应完毕，使其冷却至室温，过滤，滤液用二氯甲烷萃取3次，有机相用碳酸氢钠饱和溶液萃取3次，再用水洗涤3次，旋出有机相，为黄色油状物（70 %）。GC-MS (EI-m/z):151 (M+)（理论值：151.2）
化合物2：2-（2′-噻吩基）喹啉的制备
将2.13 g 2-胺基苯甲醛加入圆底烧瓶中，再加入3.5 g 2-乙酰基噻吩，3.52 g氢氧化钠和80 mL乙醇，加热到80 ℃回流过夜。反应结束后，冷却至室温，常压过滤，旋干，用二氯甲烷和石油醚重结晶，用柱层析方法分离。得白色针状晶体。GC-MS (EI-m/z): 212 (M+)（理论值：211.3）
实施例2：铱配合物1的制备：
化合物1：铱配合物1’的制备
在N2保护下，称取铱二氯桥化合物260 mg 和3-羟基-2-吡啶基羧酸 64 mg 加入到双颈瓶中，再加入64 mg碳酸钠和6 mL乙二醇乙醚，110 ℃磁搅拌下回流5小时。反应结束后，降至室温，减压旋蒸除去溶剂，将所得固体混合物再溶于二氯甲烷中，用柱层析（二氯甲烷/石油醚）分离得到纯品。产率：50%。MS (MALDI-TOF): m/e 750 (M - PF6).(理论值：750.87)
化合物2：铱配合物1的制备
在N2保护条件下，将1当量的铱配合物溶于5 mL蒸过的二氯甲烷液中，加入0.03 mL三乙胺，混合液搅拌5分钟使其完全溶解，将41.6 mg 2, 4-二硝基苯磺酰氯溶液溶解于6 mL蒸过的二氯甲烷中，在0 ℃下，逐滴加入混合溶液中，将反应混合溶液在室温下搅拌5个小时。反应结束后，冷却至室温，旋出二氯甲烷和三乙胺混合溶液，将旋得的固体溶于少量二氯甲烷后用柱层析（二氯甲烷/乙酸乙酯）分离，旋除展开剂并真空干燥，即得到铱配合物1。Yield 32% MS (MALDI-TOF): m/e 980 (M - PF6).（理论值：981.2）
实施例3：紫外-可见吸收谱图滴定实验
将2 mg铱配合物1溶解在25 mL容量瓶中，配置浓度为4.07×10-5 M的溶液，再分别配置5.075×102 M的半胱氨酸和高半胱氨酸溶液。测试时，先在两个比色皿中各移入2.5 mL所用溶剂，扫描基线。待基线扫描完成后，移出样品池中比色皿里的溶剂，加入2.5 mL铱配合物1溶液，扫描铱配合物1溶液的紫外-可见吸收曲线。然后用移液枪移取20 μL的半胱氨酸溶液于比色皿中，将比色皿放置于37 ℃恒温水浴箱中，20分钟后，取出比色皿放入样品池，扫描加入半胱氨酸后铱配合物1溶液的紫外-可见吸收曲线。重复上述滴加步骤，直到继续加入半胱氨酸后铱配合物1溶液的紫外-可见吸收曲线再无变化时为止。高半胱氨酸的紫外-可见吸收谱图的滴定方法同上。测试显示，开启式磷光探针溶液随着半胱氨酸和高半胱氨酸的加入，溶液的紫外-可见吸收曲线发生明显变化，说明探针和氨基酸发生了反应。
实施例4：荧光滴定实验
配置浓度为8.14×10-5 M的铱配合物1溶液，再配置浓度为5.075×102 M的半胱氨酸和高半胱氨酸溶液。取2.5 mL铱配合物1溶液于比色皿中，扫描铱配合物1溶液的荧光发射曲线。然后用移液枪移取20 μL的半胱氨酸于比色皿中，放置于37 ℃恒温水浴锅中，20分钟后，扫描加入半胱氨酸后铱配合物1溶液的荧光发射曲线。重复上述滴加步骤，直到继续加入半胱氨酸后铱配合物1溶液的荧光发射曲线再无变化时为止。高半胱氨酸的荧光发射谱图的滴定方法同上。测试说明，开启式磷光探针本身不发光，随着半胱氨酸和高半胱氨酸的加入，溶液的荧光发射光谱强度明显增强，实现了对半胱氨酸和高半胱氨酸的裸眼检测。
实施例5：时间分辨（TRES）实验
采用379 nm二极管激光器，脉冲频率为1000 kHz，收集从525 nm到750 nm波长的磷光信号。为了更进一步证实磷光信号的优越性，我们通过时间相关单光子计数技术，在有背景荧光干扰的情况下，测试磷光探针对氨基酸的检测性能。为了说明这个概念，选用氟硼二吡咯溶液作为背景荧光，收集525 nm到750 nm波长范围内铱配合物1和氟硼二吡咯混合溶液的稳态光谱，再收集延迟100 ns后的铱配合物1和氟硼二吡咯溶液的光谱。然后，加入半胱氨酸，收集混合溶液延迟100 ns后的光谱。实验说明，开启式磷光探针能够有效抑制短寿命荧光信号的干扰，显现出了磷光探针的长磷光寿命的优势。
实施例:6：活细胞成像实验：
将铱配合物配制成10 mmol 的溶液，移取20 uL 溶液到2000 uL PBS缓冲溶液中使其浓度稀释至10 μM。取2 mL 溶液孵育细胞30分钟后用PBS缓冲液清洗细胞3-5次，用405纳米波长激发细胞共聚焦成像，Z扫描。测试数据表明：开启式铱配合物具有良好的细胞穿透性，分布在细胞质区域。
Claims (4)
1.一种具有开启式磷光发射的铱配合物的制备方法，其特征在于该铱配合物具有如下结构式：
具有开启式磷光发射的铱配合物的制备方法，其特征在于合成路线如下：
具体是将C^N配体2-(2'-噻吩基)喹啉与三氯化铱加入到乙二醇乙醚和水的混合溶剂中，加热搅拌，制备二氯桥中间体，将二氯桥中间体,在乙二醇乙醚和碳酸钠存在条件下与3-羟基-2-吡啶羧酸加热回流制备铱配合物(thq)2Ir(pic-OH)，在N2保护条件下，将铱配合物(thq)2Ir(pic-OH)溶于干燥的二氯甲烷和干燥的三乙胺溶液中，逐滴滴加2,4-二硝基苯磺酰氯溶液，搅拌2-8小时；反应结束后，冷却至室温后，旋出二氯甲烷和三乙胺溶液，将旋得的固体用柱层析方法分离，即得到具有开启式磷光发射的铱配合物(thq)2Ir(pic-DNBS)。
2.一种如权利要求1所述的具有开启式磷光发射的铱配合物应用于半胱氨酸和高半胱氨酸探针。
3.一种如权利要求1所述的具有开启式磷光发射的铱配合物应用于细胞标记和成像。
4.一种如权利要求1所述的具有开启式磷光发射的铱配合物应用于时间分辨磷光探针。
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