JPH03118449A - ヒト血清アルブミンの検出及び測定法 - Google Patents

ヒト血清アルブミンの検出及び測定法

Info

Publication number
JPH03118449A
JPH03118449A JP2214459A JP21445990A JPH03118449A JP H03118449 A JPH03118449 A JP H03118449A JP 2214459 A JP2214459 A JP 2214459A JP 21445990 A JP21445990 A JP 21445990A JP H03118449 A JPH03118449 A JP H03118449A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
aryl
alkyl
cyano
alkoxy
indicates
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2214459A
Other languages
English (en)
Inventor
Manfred Kessler
マンフレート・ケッスレル
Otto S Wolfbeis
オットー・エス・ウオルフバイス
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Individual
Original Assignee
Individual
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Individual filed Critical Individual
Publication of JPH03118449A publication Critical patent/JPH03118449A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6827—Total protein determination, e.g. albumin in urine
    • G01N33/6839—Total protein determination, e.g. albumin in urine involving dyes, e.g. Coomassie blue, bromcresol green
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N31/00—Investigating or analysing non-biological materials by the use of the chemical methods specified in the subgroup; Apparatus specially adapted for such methods
    • G01N31/22—Investigating or analysing non-biological materials by the use of the chemical methods specified in the subgroup; Apparatus specially adapted for such methods using chemical indicators
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/52—Use of compounds or compositions for colorimetric, spectrophotometric or fluorometric investigation, e.g. use of reagent paper and including single- and multilayer analytical elements

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〈産業上の利用分野〉 本発明は、生体液体中のヒト血清アルブミンの定量的測
定のための新規蛍光分析法に関する。この方法は、特定
のアニオン性シアニン染料の蛍光強度を、ヒト血清アル
ブミンの存在下に同定し。
その結果ヒト血清アルブミンの測定に関する光学的パラ
メーターを提供するという観測に基づく。
〈従来の技術〉 生体液体中のアルブミンの特異的測定に関する多くの方
法は１文献中に記載されている：１）酵素結合性免疫分
析法（ＥＬＩＳＡ）は、極めて敏感であり１選択的免疫
酵素法である：ベルグメイヤー（Ｂｅｒｇｍｅｙｅｒ）
　＋酵素分析の方法、第三版。
１９８６年、第■巻、第５７頁。酵素活性の検出は。
光学的方法又は他の方法によって行われる。
２）放射性免疫分析法（ＲＩＡ）は敏感であり、かつ選
択的方法である：Ｊ、ヴオー（Ｗｏｏ）　、　Ｍ、フロ
イド（Ｆｌｏｙｄ）、　Ｄ、　Ｃ，キャノン（Ｃａｎｎ
ｏｎ）、　Ｂ、　　カーノ（Ｋａｈｎ）　＋尿アルブミ
ンの放射免疫分析法、　Ｃ１１ｎ。
Ｃｈｅｍ、２４．１４６４−７（Ｉ９７８）。
３）免疫電気泳動は、敏感であり２選択的電気泳動免疫
法（Ｃ，Ｂ、ローレル（Ｌａｕｒｅｌｌ）　、アガロー
スゲル含有抗体中で電気泳動によるタンパク質の定量評
価、Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅ＋ｗ、１５．第４５頁−
第５２頁、　　（Ｉ９６６））。
４）速度測定法は、　ｔｌｓＡの内的リパーゼ活性に基
づく。この方法で酵素基質として作用する合成脂肪酸エ
ステルの開裂を９時間の関数として光度測定で又は蛍光
分析で観察する：　Ａ、Ｒ，ギュラカー（Ｇｕｒａｋａ
ｒ）、　Ｏ、Ｓ、ウオルフバイス（Ｗｏｌｆｂｅｉｓ）
、　　新しい色素原の及び蛍光原の基質を用で、血清ア
ルブミン酵素に似た加水分解活性に基づく、敏感な血清
アルブミン速度分析法。
Ｃｌ１ｎ、　Ｃｈｉｎａ、　Ａｃｔａ　　１７２．　３
５−４６（Ｉ９８８）。
５）最後に、アルブミンに結合する染料のスペクトル変
化に基づく方法がある：ＬＶ、ワルラー（Ｗａｌｌｅｒ
）、　Ｋ、　Ｍ、ワード（Ｗａｒｄ）、　Ｊ、　Ｄ、マ
ハン（Ｍａｈａｎ）、　ｏ、　Ｋ、ヴイスマット（Ｗｉ
ｓ＋＊ａｔｔ）　＋　タンパク質尿症の現在の概念＋　
Ｃｌ１ｎ、　Ｃｈｅｗ、　３５　（５Ｌ７７５−６５　
（Ｉ９８９）。このうち、最もよく知られているのはＣ
ＢＢ法である：染料コオマシー（Ｃｏｏｍａｓｓ　ｉｅ
）ブリリアントブルーはＩＳＡに結合し、その色を黄色
から青色に変える。この色変化は、　ＩＳＡに結合する
に従って染料のｐＫ値が変化することによる。結果とし
て染料は、青色の共役塩基形に変わる：ｌ’１．Ｍ、ブ
ラッドホード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）　、タンパク質−染
料結合の原則を利用して、タンパク質のマイクログラム
量の急速かつ敏感な定量法、　Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈ
ｅ＋ｗ、７２．２４８−５４（Ｉ９７６）。
〈発明が解決しようとする課題〉 公知方法が、なぜ完全に満足されないかいくつかの理由
がある。ｔｌｓＡの存在下で染料のスペクトル変化に基
づく方法は、極めて敏感でなく　（検出限界１０−１０
０ｍｇ八〇かつへた方法の精度を制限する特異性がない
。タンパク質尿症の早期発見のために、１ｍｇ／ｌの検
出限界が望まれる。
電気泳動法は２時間を消費する。更に結果の定量化は、
しばしば困難となる。というのは多（の場合大多数の誤
りを引き起す他のタンパク質分画からＩＳＡは完全に分
離されないからである。分離の技術を改良するためにい
くつか試みられている。
たとえば等電点電気泳動（Ｅ、　　マイジンガー（Ｍｅ
ｉｓｉｎｇｅｒ）　、Ｎ　、ブレラ（Ｇｒｅｔｚ）、　
Ｍ、ストラウヒ（Ｓｔｒａｕｃｈ）　、尿タンパクを分
析する新しい可能性；固定化ｐ）ｌ勾配による等電点電
気泳動、ネフロン弧（Ｉ）、　　６７−９（Ｉ９８６）
；免疫電気泳動（Ｃ，Ｂ、ローレル、アガロースゲル含
有抗体中で電気泳動によってタンパク質の定量評価、　
Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、１５゜４５−５２（Ｉ９
６６））　、この高価な方法は、特別な通用に限定され
る。
ＩＳＡの内的リパーゼ活性に基づく速度法も、あまり敏
感でなく２選択的でない。限定的事実は。
はとんどのタンパク質分画、特にリパーゼの妨害である
。
現在の技術水準の免疫法は、極めて敏感で９選択である
と考えられるが、それは高価であり２作業が困難である
。酵素結合免疫分析法（今までのところもっとも精巧な
、公知免疫法）は、約２１０分の培養時間を必要とする
。
〈課題を解決するための手段〉 本発明は、上記欠点を排除する。　ＩＳＡの新規測定法
を提供する。敏感な）ＩＳＡ法を、　ＩＳＡの適切な蛍
光分析測定の手段によって達成する。
本発明は一般式（Ｉ） （式中ｎは０又は１を示し。
Ｍ９は一価のカチオンであり。
ＲＯはシアノ、アリール又はＣＯＲ（Ｒはアルコキシ。
アルキル又はアリールを示す、）であり。
９重はシアノ、アリール又はＣＯＩ？　（Ｒはアルコキ
シ。
アルキル又は了り−ルを示す、）であり。
Ｒ２，Ｒ１は水素、アルキル又はシアノを示し。
Ｈｆｆ、　Ｒ５，Ｒ６，Ｒ？は水素又はアルキルを示し
。
Ｒ４は水素、ハロゲン、アルキル、アリール、アリール
オキシ、アルコキシ又はＮＲ，（Ｒはアルキル又はアリ
ールを示す。）を示し。
Ｒ９はシアノ、アリール、　ＣＯＲ（Ｒはアルコキシ。
アルキル、又は了り−ルを示す。）、　Ｃｏ−ＮＡＢ（
Ａはアルキル、アリール又はカルバモイル。
Ｂはアルキル又はアリールを示す。）、　水素又はヘテ
ロサイクリルを示し。
Ｒ１０はシアノ、アリール、　ＣＯＲ（Ｒはアルコキシ
。
アルキル又は了り−ルを示す。）、　Ｃ０−ＮＡＢ　（
Ａはアルキル、アリール又はカルバモイル、Ｂはアルキ
ル又はアリールを示す。）、　水素又はヘテロサイクリ
ルを示し。
Ｒ（Ｉ，Ｒ１，Ｒ９又はＲ１１１の少なくとも１個の置
換基はシアノを示し、またＲ３　　Ｒ５は環の構成員。
たとえば−（ＣＵｚ）　Ｚ−又は−（ＣＬ）ｘ−を示す
。）なるアニオン性シアニン染料を使用することに基づ
く。
特に有用な化合物は３式中 ｎは０９ Ｒ２及びＲ８は水素。
Ｒ３Ｒ５はエチレン又はプロピレン Ｒ４は塩素である化合物を包含する。
特別な配慮が式（Ｉ）（式中 ＲＯ，ｐｌ、Ｒ９はシアノ。
１１７１０はシアノ又はベンゾアゾール−２−イル−置
換基、たとえばベンズオキサシリル、ベンゾチアゾリル
、又はそのクロロ誘導体を示す。）なる化合物に払われ
る。
次表に３選択されたアニオン性シアニン染料を示すが、
それによって本性に適する蛍光染料の数は限定されない
。夫々の最大吸収を最右欄に示す。
表１゜ ＩＳＡの蛍光測定に適用できる。與 シアニン染料の置換パターン及び Ｎｏ。
０ １ ２ ３−Ｒ５ ４ ＯＣＮＣＮ　　　　Ｈ ＯＣＮＣＮ　　　　Ｈ ＯＣＮＣＮ　　　　Ｈ ＯＣＮＣＮ　　　　Ｈ ＯＣＮＣＮ　　　　Ｈ ＯＣＮＣＮ　　　　Ｈ ＯＣＮ　　Ｃ００Ｅｔ　　Ｈ ＯＣＮＣＮ　　　　Ｈ ＯＣＮＣＮ　　　　Ｈ ＯＣＮ　　Ｃ００Ｅｔ　　Ｈ ＯＣＮＣＮ　　　　Ｈ ＯＣＮ　　ＣＮ　　　　Ｉ（ ＯＣＮ　　ＣＮ　　　　ＩＩ ＯＣＮ　　ＣＮ　　　　ＣＮ ＯＣＮ　　ＣＮ　　　　ＣＮ ０ＣＮＣＮ　　　　Ｈ （ＣＨｚ）　ｚ− −（ＣＨ２）！− （ＣＨｚ）ｚ （Ｃｔｂ）ｚ− −（ＣＨｚ）　ｚ （ＣＨｚ）ｚ −（ＣＨ２）２− （ＣＨｚ）ｘ （ＣＨｚ）　３ （Ｃ１ｈ）３ −ＣＨｚＯＣＨｚ− １１、Ｈ Ｈ，Ｈ Ｈ，Ｈ −ＣＨ＝ＣＨ Ｈ，Ｈ １型的な一般式（Ｉ）のアニオン性 ；最大吸収（ｎｍ） Ｒ６Ｒ？　Ｒ１１Ｒ９Ｒ１６λｍａｘ　（ｎｍ）８４ ９４ ７８ ４０ ９３ ９９ ０８ ６４ ８０ ８８ ４７ ３８ ６４ ３２ ７４ ４２ 表１．　　（続き） Ｎｏ、　ｎ　Ｒ’　Ｒ’ ２ ３ ５ ７ ８ ＣＮ ＣＮ ＣＮ ＣＮ ＣＨ３ ■ Ｈ，Ｈ Ｈ，Ｈ ９ ＣＮ　　ＣＮ ■ （ＣＨ２）Ｚ ０ ＣＮ ＣＮ １ （ＣＨ２）２ １ ＣＮ ＣＮ ■ −（ＣＨｚ）　ｚ ２ ３ ＣＮ ＣＮ ＣＮ ＣＮ ）！　　　−（ＣＨｚ）　ｚ Ｈ−（ＣＨｚ）ｚ ４ Ｒ＆ ７ １１ ９ ＩＧ λ０Ｉａｘ　（ｎｎ＋） ■ ＣＨ。
ＣＮ ＣＨ３ ７２ ■ ■ ＣＮ ＣＮ ３２ ｌ Ｉ Ｉ Ｉ ＣＮ ０ ｈ ９７ Ｉ ＣＮ Ｃ０ＮｌＣＯＮＨ２ ００ く作用〉 本発明のシアニン染料は水溶性紫色、青色又と緑色化合
物である。その蛍光は、橙色又は赤色である。水性溶液
中での蛍光は、むしろ弱い。
ＩＳＡを、一般式（Ｉ）の染料の１つを有する溶液に加
えた場合、最大蛍光はより長い波長の方へずれ、そして
蛍光強度は著しく増加する。この作用は極めて強い、　
ＩＳＡの極めて少量でさえ著しいシグナルの変化を生じ
る。驚くべきことに生体液体中でＩＳＡの他のタンパク
質分画によって生じる。
この様な作用はない。たとえばγ−グロブリンは。
殆んどの腎疾患でその分泌量に関していえば第二の最も
大きい分画である。驚くべきことにこれは等量のＩＳＡ
のシグナル変化の０．１％以下を生じるにすぎない。か
くてＩＳＡのこの特異的測定法を。
他のタンパク質分画からＩＳＡを前もって分離すること
なく適用することができる。
広い範囲にわたる励起エネルギーと蛍光強度の間の線状
関係のゆえに、シグナル（すなわちしたがってこの方法
の敏感度）を、レーザー励起によって極めて増加するこ
とができる。更に雑音割合に対する極めて良好なシグナ
ルは、　ＩＳＡへの結合に基づき蛍光染料の最大励起の
赤シフトを使用することによって得ることができる。
表１の染料Ｎｏ、６の励起スペクトルを第１図に示す（
発光波長６４０ｎｍで測定）。ＩＳＡの不在下（曲線１
）、蛍光強度は極めて低い。しかしｌｌ５Ａの添加によ
って（曲線２）、蛍光強度は増加し、最大励起はより一
層長い波長へずれる。第１図から明らかな様に、　Ｈｅ
Ｎｅレーザーを励起源として利用した場合、　ＩＳＡに
結合しない染料分子は６３３ｎｍで非能率的にしか励起
されない。かくて本来の蛍光を、かなり減少する。Ｈ５
＾への結合に基づき、最大励起は長波にずれ、染料をレ
ーザー光線によってより能率的に励起する。結果として
ｌ５Ａ−結合形の高度に選択的励起が高い程度まであり
、蛍光染料の弱く蛍光する非結合形の本来の蛍光を実質
上無視することができる。
他の一般式（Ｉ）の蛍光染料を、同一方法で適用するこ
とができ、かくて通常の励起源、たとえばレーザーダイ
オード（ＬＤ）又は発光ダイオード（ＬＥＤ）によって
励起することができる。
この方法で、　ＩＳＡの検出限界は２表面上での吸着処
理のために高度に希釈されたＩＳＡ検出溶液の乏しい安
定性及び困難な取り扱いによってしか限定されない。し
たがってその感度は従来技術の最も敏感な方法に匹敵す
るか又はそれよりも良好でさえある。
本発明を更に説明すると、蛍光偏光解消又は崩壊時間の
変化を、蛍光染料のＩＳＡへの結合の結果として、蛍光
強度の変化の代りにパラメーターとして使用する。ｐＨ
７，４０の水性溶液中での適当な蛍光染料の蛍光は完全
に偏光解消されるが、　ＩＳＡに結合した時に偏光する
のを観察する。したがって偏光された蛍光の測定は、　
ＩＳＡの定性及び定量検出の他の可能性を提供する。ま
た蛍光染料の蛍光崩壊時間は、　ＩＳＡに結合した時に
変化する。この事実から時間分割された蛍光分析を用い
て）ＩＳＡの定性及び定量検出に関する他の方法が提供
される。
〈発明の効果〉 Ｈ３＾測定の従来法に比して、新規方法はいくつかの決
定的利点を提供する； １、この測定は、試薬液を試料液に加え１次いで蛍光強
度、偏光又は寿命を測定することに基づ（ので、この方
法の必要な時間及び価格を低く維持することができる。
２、この方法の感度を、染料の濃度及び機器パラメータ
ーの変化によって、すべての検査に１１節することがで
きる。これは前からある方法と少なくとも同じ様に敏感
である。
３、この方法は極めて選択的である。大過剰の他のタン
パク質分画でさえ、たとえば生体液体中に生じるその分
画さえ妨害しない。かくて分離工程は、不必要である。
４、適当な蛍光染料と固体光成分、たとえば発光ダイオ
ード又はレーザーダイオード（励起源として使用）及び
ホトダイオード（検出器として使用）との適合性のため
に、半導体工学のすべての利点（たとえば低い電圧供給
、小型、低い電流消費、高い寿命及び信頼性）を含んで
いる。
５、長波蛍光励起及び発光のために、連体材料の潜在的
に妨害する短波の本来の蛍光を取り除く。
したがって十分に蛍光分析の固有の感度を使用ることが
できる。
適当な蛍光染料は、後記の方法によって得られる。すな
わちＪ、Ｌ、スロミンスキ−（Ｓｌｏｍｉｎｓｋｉ　ｉ
）　＋Ｓ、Ｖ、ポポフ（Ｐｏｐｏｖ）、　　Ａ、イルチ
ェンコ（Ｉ　１ｃｈｅｎｋｏ）八、■、トルマチョフ（
Ｔｏｌｍａｃｈｅｖ）、　Ｚｈ、　Ｏｒｇａｎ。
Ｋｈｉｍｉｉ、　２１．１２９４（Ｉ９８５）及び門、
ストレル（Ｓｔｒｅｌｌ）。
−０Ｂ、ブラウンブルク（Ｂｒａｕｎｂｒｕｃｋ）、　
Ｗ、Ｆ、フユラー（Ｆｕｈｌｅｒ）、　ｏ、ツーバー（
Ｈｕｂｅｒ）、　Ｌｉｅｂｉｇｓ　Ａｎｎ。
Ｃｈｅｍ、　５８７．１７７（Ｉ９５４）である。
式（Ｉ）のアニオン性シアニン染料の製造に関して、弐
（ＩＩ） ＨＲ’　　　　　　　Ｈ へ工Ｃ−Ｃ，Ｃ−Ｃ＝Ｃ−８ Ｒ３ＲＳ　　　　　　　　　（ＩＩ） （式中へ は 〔 １Ｎ（ＣＨ３）！ 〕 又は酸素を示し。
Ｘはアニオン（特にパークロラート）を示し。
Ｂは−Ｎ（ＣＨ：Ｉ）！、−ＯＣＨ：ｌ又は−ＯＨを示
し。
Ｒ３，Ｒ４，ＲＳは上述（式（■））の意味を有する。
）なるジアルデヒド誘導体と一般式（ＩＩＩ）Ｒｏ−（
：）１ｇ−ＣＮ　　　　　　　（ＩＩＩ）（式中Ｒ０は
上述（式（■））の意味ををする。）なる活性メチレン
化合物とを塩基性縮合剤の存在下に反応させて５式（Ｉ
Ｖ） （ＩＶ） （式中Ｂは−Ｎ（Ｃ：ｔｂ）　ｚ、−０ＣＬ又は−ＯＨ
を示し。
ＲＯ，Ｒ３，Ｒ４，Ｒ５は上述（式（Ｉ））の意味を有
する。
なる中間体が得られ、これを単離する。
第二段階で式（ＩＶ）の中間体と式（Ｖ）Ｒ９−ＣＨｚ
−Ｒ１０（Ｖ） （式中Ｒ９，ＲＩＧは上述（式（■））の意味を有する
。）なる付加的な活性メチレン化合物とを反応させて。
） 式（Ｉ）のアニオン性シアニン染料が得られる。
この反応もまた塩基の存在下に実施する。
このメチレン化合物（ＩＩＩ）と（Ｖ）が同一である場
合１式（ＩＶ）の中間体生成物の単離は不必要であり１
反応を一槽反応として実施することができる。
適する触媒塩基として、ピリジン、第三脂肪族アミン並
びに第四級アミンの、アルカリ金属の及びアルカリ土類
金属の水酸化物が挙げられる。高活性メチレン化合物（
たとえばマロノニトリル）の場合１反応をピリジン中で
実施するのが好ましい。より小さい活性のメチレン化合
物をピリジン／トリエチルアミン中で又は塩基として水
酸化テトラメチルアンモニウムを用いて反応させるのが
好ましい。
２つの反応工程を、溶剤又は希釈剤の存在下に２０〜１
００℃の温度範囲で実施するのが好ましい。
適する溶剤は上記液状有機塩基、好ましくはピリジンで
ある。水酸化物を塩基成分として使用する場合、無水エ
タノール又はメタノールが好ましい。
第一段階でジアルデヒド誘導体（ｎ）と２つの分子（Ｉ
Ｉ［）との反応（所望されない副反応である。
）を回避するために、過剰の（ｎ）を使用し、上記溶剤
の１つ中で予め希釈することができる成分（Ｉ［）を徐
々に加える。
式（ＩＩ）の出発化合物は公知である；Ｌ、ベルリン（
Ｂｅｒｌｉｎ）及び０．リースター（Ｒｉｅｓｔｅｒ）
　；ホウベンヴエイル、有機化学の方法、第４版、第５
７１ｄ巻。
ゲオルグチーメ出版、シュツットガルト１９７２．　Ｇ
。
八、レイノルズ（Ｒｅｙｎｏｌｄｓ）　＋及びに、Ｈ，
ドレキサージ（Ｄｒｅｘｈａｇｅ）、　Ｊ、　Ｏｒｇ、
　Ｃｈｅｎ＋、　４２．８８５（Ｉ９７７）。
次の例中に、２つの蛍光染料（表１の中から）の合成及
び尿中のＩＳＡ測定にこれを使用することを示す。しか
しこの方法を変化させることができる。特に改良された
試料調製物を用いる方法、たとえば自動化学分析装置及
びフローインジェクションマニホルド中で、自動化臨床
分析装置又はディスポーザルプローベ中で行うことがで
きる。
例１ ヘリウム−ネオンレーザ−で励起しうる。　ＩＳＡ敏感
な蛍光染料（表１中のＮｏ、６）の合成ピリジン５ｉを
、　Ｎ−（（２−クロロ−３−（ジメチルアミノ）−メ
チレン）−１−シクロペンテン−１−イル〕−メチレン
ーＮ、Ｎ−ジメチルアンモニウムバークロラ　−　ト　
　（Ｉ［）　　６．３ｇ　　（２０ｍｍｏｌ）　　（八
　：　　ＣｌＯ４−”　　Ｎ（ＣＨｚ）ｚ；Ｂ　：　−
Ｎ（ＣＨ３）ｚ；　Ｒ’　：　Ｃ１；　Ｒ’　　Ｒ’；
　−（ＣＨＩ）２−）　とマロノジニトリル３．３ｇ　
（５０ｍｍｏｌ）　との混合物に加える。混合物は直ち
に暗青色に変り、まもなく固化し、結晶性ケーキを形成
する。懸濁液を１時間７〇−８０℃に加熱し、最後に冷
蔵庫中で一晩保つ。次いでジエチルエーテル２０−を加
え、混合物を濾過する。沈殿をジエチルエーテルで洗滌
し、デシケータ−中でＰ４Ｏ１０を介して乾燥し、残存
するピリジンを除去する。
収率：　６．７ｇ　（６８％）。染料を、更に精製する
ことなく　ＨＳＡ測定に関するこの方法に適用すること
ができる。
例２ ６７０ｎｍダイオードレーザーで励起しうるｌｌ５Ａ−
敏感な蛍光染料（表１中のＮｏ、１９）の合成（ａ）ピ
リジン５−中にマロノジニトリル１．２ｇ　（Ｉ８ｍｍ
ｏｌ）を有する溶液を、　Ｎ−（２−クロロ−３−（ジ
メチルアミノ）−メチレン−１−シグロペンテンー１−
イル〕−メチレン−Ｎ、Ｎ−ジメチル−アンモニウムバ
ークロラート　（Ｉｆ）７．０ｇ（２２，３ｍｍｏｌ）
　（＾　：　ＣｌＯ４−”Ｎ（ＣＨｚ）ｚ；　Ｂ　：　
Ｎ（ＣＨ３）ｚ；　Ｒ’、　Ｃ１，Ｒ’−Ｒ’。
Ｃ（ＣＬ）ｚ−）７．０ｇ（２２，３ｍｎｏｌの溶液に
１０分間かけて攪拌下に加える。次いで溶液を７０℃で
１５分間保ち放冷する。石油エーテルの添加によって得
られた沈殿を吸引濾取し、全部で５００−のメタノール
／水１：４（ｖ／いで洗滌して、紫色針状晶３．６ｇが
得られる。精製のために、生成物をトルエンから再結晶
する。融点：２１２℃。
（ｂ）第二段階で、この生成物０．１６ｇ（０，６９ｍ
ｍｏ＋）及び５−クロロ−２−シアノメチレン−ベンゾ
オキサゾール０．１４ｇ（０，７３ｍｍｏｌ）を、穏や
かな加熱下にメタノール約１５−中に溶解する。次いで
水酸化テトラメチルアンモニウム（ｘ５Ｈｚｏ）０．１
３ｇ（０，７ｍｍｏｌ）を加え、溶液を室温でもう２時
間攪拌する。得られた懸濁液をジエチルエーテル５０−
で処理し、最後に吸引濾取する。生成物を、２回りエチ
ルエーテルで洗滌する。収量：　０．１５ｇ（理論値の
４９％）。
融点＝２２１℃。染料を、更に精製することなく適用す
ることができる。しかし溶離剤としてアセトン／トルエ
ン混合物（Ｉ：　１．ｖ／ｖ）を用いてシリカゲル上で
クロマトグラフィーによって精製する。
例３ 例１の染料及び励起光源として２−ｍワット　ヘリウム
−ネオンを用いて種々のタンパク質分画の存在下に病気
の尿見本中のＩＳＡ測定。
ａ）蛍光染料の保存溶液の製造 例１の蛍光染料を無水イソプロパツール中に溶解する。
この保存溶液を安定にするために、染料の濃度を、　５
９９ｎｍで１ｃｍにつき約１．５の吸光度に調整する。
溶液を暗所に貯蔵しなければならない。
ｂ）緩衝液 リン酸塩緩衝液ｐＨ＝７．４０．　ＮａＣ１で生理的イ
オン強度（Ｉ＝　１６０ｎｕａｏｌ）に調整。
ｃ）ＩＳＡ検定ストック 親油性Ｈ５Ａ　１０ｍｇを緩衝液１００ｉ中に溶解する
。
ｄ）検定曲線の作成 ＩＳＡ検定ストック０．０．０．５．１．２．３及び４
−を、緩衝液で最終容量９．５−に満たす。染料保存溶
ｉ　０．５ｄを、夫々の溶液に加える。混合の後。
溶液を直ちに蛍光光度計でヘリウム−ネオンレーザ−励
起下に測定する。使用される分析シグナルは、　６３０
ｎｍで蛍光強度である（いわゆる非−ストークス蛍光）
。この方法で得られた検定曲線を第２図に示す。その範
囲は、０〜４０ｍｇ／　Ｉ　ＨＳＡである。
ｅ）尿中のＩＳＡ測定 尿中のＩＳＡ測定を、検定曲線に関する上記方法に従っ
て実施する。沈降物を有する又は混濁を示す尿を１分析
前に濾過するか又は遠心分離することを保証することが
重要である。測定に使用される尿の量は、主にＵＳＡの
夫々の量による。希釈を。
夫々の量が検定曲線の範囲内（Ｏ〜４０ｍｇ／　ｅ　Ｈ
ＳＡ）にある様に行う。
結果 次にいくつかの尿見本のｌ５Ａ−測定で得られた結果の
選択、及び免疫ネフエロ及び免疫比濁方法によって得ら
れたデータとの比較を示ず：尿１：極めて混濁し、高度
に病気の尿；タンパク質を伴う；ベンスージョーンズ３
２００ｍｇ／　１　；　この方法によるＨＳＡ　　：　
６０ｍｇ／　ｌ−；免疫−ネフェロ分析法：　６５ｍｇ
／　１゜ 尿２：澄明な尿、僅かに微小タンパク尿検出；この方法
によるＨＳＡ　；　３０ｍｇ／　／ｌ　；免疫−ネフェ
ロ分析法：　３２．５ｍｇ／　Ｉ！。
尿３：沈降物含有、病気のタンパク尿検出されず；この
方法によるＨＳＡ　；　１８ｍｇ／　１　；免疫−ネフ
ェロ分析法；　１５Ｚ５ｍｇ／　Ａ’　０ 尿４：澄明な尿、病気のタンパク尿検出されず；この方
法によるＨＳＡ　；　１０ｍｇ／　１　；比濁分析法：
検出限界以下のＩＳＡ。
尿５：澄明な尿、高い病気（タンパク尿）；タンパク質
を伴うニゲロブリン；この方法によるＩＳＡ　。
３１００ｍｇ／　１　；免疫−ネフェロ分析法：　３０
２５ｍｇ／　ｌ　。
尿６：Ｔ−グロブリン５釦ｇ／！！を含有する合成尿ス
タンダード：この方法によるＨＳＡ　　：　Ｏｍｇ／　
１゜
【図面の簡単な説明】
第１図は１本発明による１表１に挙げた染料Ｎｏ。 ６の励起スペクトル（発光波長６４０ｎｍ）であり、第
２図はへリウムーネオンレーザー励起下に蛍光光度計で
測定されたｌｌ５Ａ検定曲線である。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １）ａ）一般式（ I ） ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ） （式中ｎは０又は１を示し、 Ｍ＾＋は一価のカチオンであり、 Ｒ＾０はシアノ、アリール又はＣＯＲ（Ｒはアルコキシ
    、アルキル又はアリールを示す。）であり、 Ｒ＾１はシアノ、アリール又はＣＯＲ（Ｒはアルコキシ
    、アルキル又はアリールを示す。）であり、 Ｒ＾２、Ｒ＾８は水素、アルキル又はシアノを示し、Ｒ
    ＾３、Ｒ＾５、Ｒ＾６、Ｒ＾７は水素又はアルキルを示
    し、Ｒ＾４は水素、ハロゲン、アルキル、アリール、ア
    リールオキシ、アルコキシ又はＮＲ＿ｚ（Ｒはアルキル
    又はアリールを示す。）を示し、 Ｒ＾９はシアノ、アリール、ＣＯＲ（Ｒはアルコキシ、
    アルキル、又はアリールを示す。）、ＣＯ−ＮＡＢ（Ａ
    はアルキル、アリール又はカルバモイル、Ｂはアルキル
    又はアリールを示す。）、水素又はヘテロサイクリルを
    示し、 Ｒ＾１＾０はシアノ、アリール、ＣＯＲ（Ｒはアルコキ
    シ、アルキル又はアリールを示す。）、 ＣＯ−ＮＡＢ（Ａはアルキル、アリール又はカルバモイ
    ル、Ｂはアルキル又はアリールを示す。）、水素又はヘ
    テロサイクリルを示し、Ｒ＾０、Ｒ＾１、Ｒ＾９又はＲ
    ＾１＾０の少なくとも１個の置換基はシアノを示し、Ｒ
    ＾３−Ｒ＾５は環の構成員、たとえば−（ＣＨ＿２）＿
    ２−又は−（ＣＨ＿２）＿３−を示す。）なるアニオン
    性シアニン染料を、試料に加え、ｂ）蛍光強度の増加又
    は蛍光偏光解消の変化、又はＨＳＡの染料への結合の結
    果として染料の蛍光寿命の変化を測定し、 ｃ）蛍光の変化を試料中のＨＳＡの実際の量に関連づけ
    る工程から成る、生体液体中のヒト血清アルブミンの光
    学的検出及び定量的測定法。 ２）一般式（ I ） （式中ｎは０、 Ｒ＾２、Ｒ＾８は水素、 Ｒ＾３及びＲ＾５はエチレン又はプロピレン架橋、Ｒ＾
    ４は塩素、 Ｒ＾０、Ｒ＾１、Ｒ＾９はシアノ、 Ｒ＾１＾０はシアノ、又は場合により置換された２−ベ
    ンゾオキサゾリル基である。） なるアニオン性染料を使用する請求項１記載の方法。 ３）励起光源としてヘリウム−ネオンレーザー又はレー
    ザーダイオードを使用する請求項１又は２記載の方法。 ４）試料を予め希釈するか又はキャリヤースチーム中に
    注入するか又は自動化分析装置に入れる請求項１又は２
    記載の方法。
JP2214459A 1989-08-17 1990-08-15 ヒト血清アルブミンの検出及び測定法 Pending JPH03118449A (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AT1949/89 1989-08-17
AT0194989A ATA194989A (de) 1989-08-17 1989-08-17 Verfahren zum nachweis und zur bestimmung von humanserumalbumin in biologischen fluessigkeiten mit hilfe fluorogener cyanin-farbstoffe

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JPH03118449A true JPH03118449A (ja) 1991-05-21

Family

ID=3524527

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2214459A Pending JPH03118449A (ja) 1989-08-17 1990-08-15 ヒト血清アルブミンの検出及び測定法

Country Status (5)

Country Link
US (1) US5182214A (ja)
EP (1) EP0413678B1 (ja)
JP (1) JPH03118449A (ja)
AT (1) ATA194989A (ja)
DE (1) DE59007613D1 (ja)

Families Citing this family (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9211980D0 (en) * 1992-06-05 1992-07-15 Int Murex Tech Corp Immunoassay method
US5616502A (en) * 1995-05-19 1997-04-01 Molecular Probes, Inc. Non-specific protein staining using merocyanine dyes
US5870188A (en) * 1995-09-20 1999-02-09 Kyoto Dei-Ichi, Kagaku Co. Ltd. Measuring method and measuring apparatus by light scattering
US6766183B2 (en) 1995-11-22 2004-07-20 Medtronic Minimed, Inc. Long wave fluorophore sensor compounds and other fluorescent sensor compounds in polymers
US7070937B1 (en) 1998-10-02 2006-07-04 Ischemia Technologies, Inc. Marker useful for detection and measurement of free radical damage and method
US20050142613A1 (en) * 1998-10-02 2005-06-30 David Bar-Or Test for the rapid evaluation of ischemic states and kits
US7297544B2 (en) * 1998-10-02 2007-11-20 Ischemia Technologies, Inc. Tests for the rapid evaluation of ischemic states and kits
US6475743B1 (en) 1998-10-02 2002-11-05 Ischemia Technologies, Inc. Marker useful for detection and measurement of free radical damage and method
US7449338B2 (en) * 1998-10-02 2008-11-11 Ischemia Technologies, Inc. Tests for the rapid evaluation of ischemic states and kits
US20030215359A1 (en) * 1998-10-02 2003-11-20 Ischemia Technologies, Inc. Tests for the rapid evaluation of ischemic states and kits
EP1290428A1 (en) * 2000-06-02 2003-03-12 Medicometrics APS Method and system for classifying a biological sample
WO2002066986A2 (en) * 2001-02-15 2002-08-29 Medtronic Minimed, Inc. Polymers functionalized with fluorescent boronate motifs
US7045361B2 (en) 2001-09-12 2006-05-16 Medtronic Minimed, Inc. Analyte sensing via acridine-based boronate biosensors
US7345150B2 (en) * 2002-03-26 2008-03-18 Medical University Of Toledo Albumin-based colloid composition having at least one protected thiol region, methods of making, and methods of use
WO2004024191A2 (en) * 2002-09-10 2004-03-25 University Of Maryland, Baltimore Use of metallic particles to improve fluorescence imaging
US7074194B2 (en) * 2003-05-19 2006-07-11 Ischemia Technologies, Inc. Apparatus and method for risk stratification of patients with chest pain of suspected cardiac origin
US7776529B2 (en) 2003-12-05 2010-08-17 Life Technologies Corporation Methine-substituted cyanine dye compounds
DE102005004745A1 (de) * 2005-01-31 2006-08-10 Dyomics Gmbh Verfahren zu Nachweis und Quantifizierung von Proteinen
JP5306811B2 (ja) * 2005-05-11 2013-10-02 ライフ テクノロジーズ コーポレーション ２本鎖ｄｎａへの高い選択性を有する蛍光化学物質及びそれらの使用
DE112006003967B4 (de) 2006-07-28 2017-09-21 Pierce Biotechnology, Inc. Farbstoffe, Farbstoffzusammensetzungen und Verfahren zum Anfärben von Proteinen
MD4054C1 (ro) * 2009-11-06 2011-02-28 Государственный Медицинский И Фармацевтический Университет "Nicolae Testemitanu" Республики Молдова Metodă de determinare a capacităţii albuminei ischemic modificate de legare a cobaltului
CN103115904B (zh) * 2013-01-24 2016-12-28 中国科学院化学研究所 尿微量白蛋白检测方法、系统和试剂盒
US9804154B2 (en) 2013-03-12 2017-10-31 Epinex Diagnostics, Inc. Rapid test for urine albumin and urine creatinine
JP7068822B2 (ja) 2014-09-08 2022-05-17 インディアン インスティテゥート オブ サイエンス 電気化学的バイオセンサ及びアルブミンとその複合体の検出方法
CN105203518A (zh) * 2015-10-08 2015-12-30 三峡大学 一类荧光试剂，制备方法及其应用

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4568647A (en) * 1983-10-11 1986-02-04 Eastman Kodak Company Method and element for albumin assay
DE3774570D1 (ja) * 1987-04-22 1991-12-19 Pharmacia Diagnostics Inc., Fairfield, N.J., Us

Also Published As

Publication number Publication date
EP0413678A2 (de) 1991-02-20
DE59007613D1 (de) 1994-12-08
ATA194989A (de) 1990-04-15
EP0413678B1 (de) 1994-11-02
US5182214A (en) 1993-01-26
EP0413678A3 (en) 1991-07-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JPH03118449A (ja) ヒト血清アルブミンの検出及び測定法
EP1928822B1 (en) Violet laser excitable dyes and their method of use
SU1621811A3 (ru) Способ получени производных резоруфина
ITMI952049A1 (it) Coloranti fluorescenti della famiglia della solfo benz e indocianina
JPH03172196A (ja) 蛍光発生基質およびそれを用いたタンパク質分解酵素の検出方法
JP3984475B2 (ja) 蛍光検出法および試薬
Kessler et al. Laser-induced fluorometric determination of albumin using longwave absorbing molecular probes
EP0078477A2 (en) Fenclofenac as TBP blocking agent in iodothyronine immunoassays
JP4893964B2 (ja) 新規化合物、該化合物を含むペプチド又はタンパク質の分析用試薬、及び該分析試薬を使用する分析方法
US3871825A (en) Fluorometric reagents and methods
Fu et al. Quinolone-based fluorescent probes for distinguished detection of Cys and GSH through different fluorescence channels
JPH02227098A (ja) マレイミド基を測定する方法および測定剤
WO2007030521A1 (en) Control of chemical modification
JPH01305069A (ja) ベンゾトリアゾール誘導体およびそれを含有する発螢光試薬
US7282339B2 (en) Competitive immunoassay
CN103435625B (zh) 红光发射罗丹明类离子荧光探针及其应用
CN112876426B (zh) 检测人血清白蛋白的苯并噻唑类荧光探针及制备和试剂盒
Chen Fluorescence properties of fluorescamine-protein conjugates
JPS61234797A (ja) マクロ分子ヒドロラ−ゼ用螢光偏光アツセイ、このアツセイに使用する試薬及びこれら試薬の製法
JPH08271430A (ja) 新規蛍光色素
JPH0133781B2 (ja)
CN109824571A (zh) 一种荧光探针及其制备方法与应用
JP2008180588A (ja) アクロレイン及び／又はアクロレイン付加物を検出するための試薬及び方法
JP3551984B2 (ja) アクリジン誘導体
JPH04120058A (ja) モノエチルグリシンキシリジド誘導体および類似体およびその製法および用途