JPH03118449A - ヒト血清アルブミンの検出及び測定法 - Google Patents
ヒト血清アルブミンの検出及び測定法Info
- Publication number
- JPH03118449A JPH03118449A JP2214459A JP21445990A JPH03118449A JP H03118449 A JPH03118449 A JP H03118449A JP 2214459 A JP2214459 A JP 2214459A JP 21445990 A JP21445990 A JP 21445990A JP H03118449 A JPH03118449 A JP H03118449A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- aryl
- alkyl
- cyano
- alkoxy
- indicates
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 title claims abstract description 6
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 title claims abstract description 6
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 46
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 claims abstract description 33
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims abstract description 31
- 125000004093 cyano group Chemical group *C#N 0.000 claims abstract description 21
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims abstract description 14
- 125000003545 alkoxy group Chemical group 0.000 claims abstract description 12
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 claims abstract description 9
- 125000000623 heterocyclic group Chemical group 0.000 claims abstract description 6
- 125000003917 carbamoyl group Chemical group [H]N([H])C(*)=O 0.000 claims abstract description 5
- 125000004104 aryloxy group Chemical group 0.000 claims abstract description 3
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 claims abstract description 3
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 claims abstract description 3
- 150000002367 halogens Chemical class 0.000 claims abstract description 3
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 claims abstract description 3
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims description 17
- 230000005284 excitation Effects 0.000 claims description 14
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 claims description 12
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 10
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- -1 2-benzoxazolyl group Chemical group 0.000 claims description 5
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 claims description 5
- CPBQJMYROZQQJC-UHFFFAOYSA-N helium neon Chemical compound [He].[Ne] CPBQJMYROZQQJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 150000002431 hydrogen Chemical class 0.000 claims description 4
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 claims description 4
- VGGSQFUCUMXWEO-UHFFFAOYSA-N Ethene Chemical group C=C VGGSQFUCUMXWEO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000005977 Ethylene Substances 0.000 claims description 2
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 claims description 2
- 230000028161 membrane depolarization Effects 0.000 claims description 2
- QQONPFPTGQHPMA-UHFFFAOYSA-N propylene Chemical group CC=C QQONPFPTGQHPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 2
- ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N Chlorine atom Chemical compound [Cl] ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- ANRHNWWPFJCPAZ-UHFFFAOYSA-M thionine Chemical compound [Cl-].C1=CC(N)=CC2=[S+]C3=CC(N)=CC=C3N=C21 ANRHNWWPFJCPAZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 abstract description 2
- RDFLLVCQYHQOBU-GPGGJFNDSA-O Cyanin Natural products O([C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)c1c(-c2cc(O)c(O)cc2)[o+]c2c(c(O[C@H]3[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O3)cc(O)c2)c1 RDFLLVCQYHQOBU-GPGGJFNDSA-O 0.000 abstract 2
- RDFLLVCQYHQOBU-ZOTFFYTFSA-O cyanin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC(C(=[O+]C1=CC(O)=C2)C=3C=C(O)C(O)=CC=3)=CC1=C2O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 RDFLLVCQYHQOBU-ZOTFFYTFSA-O 0.000 abstract 2
- HDCXQTPVTAIPNZ-UHFFFAOYSA-N n-({[4-(aminosulfonyl)phenyl]amino}carbonyl)-4-methylbenzenesulfonamide Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1S(=O)(=O)NC(=O)NC1=CC=C(S(N)(=O)=O)C=C1 HDCXQTPVTAIPNZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 abstract 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 23
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 20
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 15
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 13
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 13
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N diethyl ether Substances CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- QGKMIGUHVLGJBR-UHFFFAOYSA-M (4z)-1-(3-methylbutyl)-4-[[1-(3-methylbutyl)quinolin-1-ium-4-yl]methylidene]quinoline;iodide Chemical compound [I-].C12=CC=CC=C2N(CCC(C)C)C=CC1=CC1=CC=[N+](CCC(C)C)C2=CC=CC=C12 QGKMIGUHVLGJBR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 6
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000002585 base Substances 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 201000001474 proteinuria Diseases 0.000 description 5
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 4
- WGTYBPLFGIVFAS-UHFFFAOYSA-M tetramethylammonium hydroxide Chemical compound [OH-].C[N+](C)(C)C WGTYBPLFGIVFAS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 3
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 3
- ZNZYKNKBJPZETN-WELNAUFTSA-N Dialdehyde 11678 Chemical class N1C2=CC=CC=C2C2=C1[C@H](C[C@H](/C(=C/O)C(=O)OC)[C@@H](C=C)C=O)NCC2 ZNZYKNKBJPZETN-WELNAUFTSA-N 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- CUONGYYJJVDODC-UHFFFAOYSA-N malononitrile Chemical compound N#CCC#N CUONGYYJJVDODC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 3
- 125000001570 methylene group Chemical group [H]C([H])([*:1])[*:2] 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 3
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000017858 Laurus nobilis Nutrition 0.000 description 2
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 2
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 244000125380 Terminalia tomentosa Species 0.000 description 2
- 235000005212 Terminalia tomentosa Nutrition 0.000 description 2
- 230000009102 absorption Effects 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 2
- 238000012921 fluorescence analysis Methods 0.000 description 2
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 2
- 238000000760 immunoelectrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 2
- 235000019626 lipase activity Nutrition 0.000 description 2
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 2
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 238000011158 quantitative evaluation Methods 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 2
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 2
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- LKTSKEJXPTXZCL-UHFFFAOYSA-N 2-(5-chloro-3h-1,3-benzoxazol-2-ylidene)acetonitrile Chemical compound ClC1=CC=C2OC(=CC#N)NC2=C1 LKTSKEJXPTXZCL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- USVZHTBPMMSRHY-UHFFFAOYSA-N 8-[(6-bromo-1,3-benzodioxol-5-yl)sulfanyl]-9-[2-(2-chlorophenyl)ethyl]purin-6-amine Chemical compound C=1C=2OCOC=2C=C(Br)C=1SC1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1CCC1=CC=CC=C1Cl USVZHTBPMMSRHY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SGHZXLIDFTYFHQ-UHFFFAOYSA-L Brilliant Blue Chemical compound [Na+].[Na+].C=1C=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C(=CC=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=CC=1N(CC)CC1=CC=CC(S([O-])(=O)=O)=C1 SGHZXLIDFTYFHQ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 102100035861 Cytosolic 5'-nucleotidase 1A Human genes 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000802744 Homo sapiens Cytosolic 5'-nucleotidase 1A Proteins 0.000 description 1
- 238000005684 Liebig rearrangement reaction Methods 0.000 description 1
- 102000004882 Lipase Human genes 0.000 description 1
- 108090001060 Lipase Proteins 0.000 description 1
- 239000004367 Lipase Substances 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 229910000272 alkali metal oxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001340 alkali metals Chemical class 0.000 description 1
- 229910001860 alkaline earth metal hydroxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical group 0.000 description 1
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001164 benzothiazolyl group Chemical group S1C(=NC2=C1C=CC=C2)* 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 125000001309 chloro group Chemical group Cl* 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000009585 enzyme analysis Methods 0.000 description 1
- 238000000695 excitation spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000004401 flow injection analysis Methods 0.000 description 1
- 108010074605 gamma-Globulins Proteins 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-M hydroxide Chemical compound [OH-] XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 239000013067 intermediate product Substances 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 208000017169 kidney disease Diseases 0.000 description 1
- 238000003367 kinetic assay Methods 0.000 description 1
- 235000019421 lipase Nutrition 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000004848 nephelometry Methods 0.000 description 1
- 210000000885 nephron Anatomy 0.000 description 1
- 238000005580 one pot reaction Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 150000007530 organic bases Chemical class 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-M perchlorate Inorganic materials [O-]Cl(=O)(=O)=O VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-N perchloric acid Chemical compound OCl(=O)(=O)=O VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003208 petroleum Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 125000004805 propylene group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([*:1])C([H])([H])[*:2] 0.000 description 1
- 239000011546 protein dye Substances 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 239000004065 semiconductor Substances 0.000 description 1
- 238000007086 side reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 150000003510 tertiary aliphatic amines Chemical class 0.000 description 1
- 108010094139 tumor-globulin Proteins 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
- G01N33/6827—Total protein determination, e.g. albumin in urine
- G01N33/6839—Total protein determination, e.g. albumin in urine involving dyes, e.g. Coomassie blue, bromcresol green
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N31/00—Investigating or analysing non-biological materials by the use of the chemical methods specified in the subgroup; Apparatus specially adapted for such methods
- G01N31/22—Investigating or analysing non-biological materials by the use of the chemical methods specified in the subgroup; Apparatus specially adapted for such methods using chemical indicators
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/52—Use of compounds or compositions for colorimetric, spectrophotometric or fluorometric investigation, e.g. use of reagent paper and including single- and multilayer analytical elements
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〈産業上の利用分野〉
本発明は、生体液体中のヒト血清アルブミンの定量的測
定のための新規蛍光分析法に関する。この方法は、特定
のアニオン性シアニン染料の蛍光強度を、ヒト血清アル
ブミンの存在下に同定し。
定のための新規蛍光分析法に関する。この方法は、特定
のアニオン性シアニン染料の蛍光強度を、ヒト血清アル
ブミンの存在下に同定し。
その結果ヒト血清アルブミンの測定に関する光学的パラ
メーターを提供するという観測に基づく。
メーターを提供するという観測に基づく。
〈従来の技術〉
生体液体中のアルブミンの特異的測定に関する多くの方
法は1文献中に記載されている:1)酵素結合性免疫分
析法(ELISA)は、極めて敏感であり1選択的免疫
酵素法である:ベルグメイヤー(Bergmeyer)
+酵素分析の方法、第三版。
法は1文献中に記載されている:1)酵素結合性免疫分
析法(ELISA)は、極めて敏感であり1選択的免疫
酵素法である:ベルグメイヤー(Bergmeyer)
+酵素分析の方法、第三版。
1986年、第■巻、第57頁。酵素活性の検出は。
光学的方法又は他の方法によって行われる。
2)放射性免疫分析法(RIA)は敏感であり、かつ選
択的方法である:J、ヴオー(Woo) 、 M、フロ
イド(Floyd)、 D、 C,キャノン(Cann
on)、 B、 カーノ(Kahn) +尿アルブミ
ンの放射免疫分析法、 C11n。
択的方法である:J、ヴオー(Woo) 、 M、フロ
イド(Floyd)、 D、 C,キャノン(Cann
on)、 B、 カーノ(Kahn) +尿アルブミ
ンの放射免疫分析法、 C11n。
Chem、24.1464−7(I978)。
3)免疫電気泳動は、敏感であり2選択的電気泳動免疫
法(C,B、ローレル(Laurell) 、アガロー
スゲル含有抗体中で電気泳動によるタンパク質の定量評
価、Anal、 Bioche+w、15.第45頁−
第52頁、 (I966))。
法(C,B、ローレル(Laurell) 、アガロー
スゲル含有抗体中で電気泳動によるタンパク質の定量評
価、Anal、 Bioche+w、15.第45頁−
第52頁、 (I966))。
4)速度測定法は、 tlsAの内的リパーゼ活性に基
づく。この方法で酵素基質として作用する合成脂肪酸エ
ステルの開裂を9時間の関数として光度測定で又は蛍光
分析で観察する: A、R,ギュラカー(Guraka
r)、 O、S、ウオルフバイス(Wolfbeis)
、 新しい色素原の及び蛍光原の基質を用で、血清ア
ルブミン酵素に似た加水分解活性に基づく、敏感な血清
アルブミン速度分析法。
づく。この方法で酵素基質として作用する合成脂肪酸エ
ステルの開裂を9時間の関数として光度測定で又は蛍光
分析で観察する: A、R,ギュラカー(Guraka
r)、 O、S、ウオルフバイス(Wolfbeis)
、 新しい色素原の及び蛍光原の基質を用で、血清ア
ルブミン酵素に似た加水分解活性に基づく、敏感な血清
アルブミン速度分析法。
Cl1n、 China、 Acta 172. 3
5−46(I988)。
5−46(I988)。
5)最後に、アルブミンに結合する染料のスペクトル変
化に基づく方法がある:LV、ワルラー(Waller
)、 K、 M、ワード(Ward)、 J、 D、マ
ハン(Mahan)、 o、 K、ヴイスマット(Wi
s+*att) + タンパク質尿症の現在の概念+
Cl1n、 Chew、 35 (5L775−65
(I989)。このうち、最もよく知られているのはC
BB法である:染料コオマシー(Coomass ie
)ブリリアントブルーはISAに結合し、その色を黄色
から青色に変える。この色変化は、 ISAに結合する
に従って染料のpK値が変化することによる。結果とし
て染料は、青色の共役塩基形に変わる:l’1.M、ブ
ラッドホード(Bradford) 、タンパク質−染
料結合の原則を利用して、タンパク質のマイクログラム
量の急速かつ敏感な定量法、 Anal、 Bioch
e+w、72.248−54(I976)。
化に基づく方法がある:LV、ワルラー(Waller
)、 K、 M、ワード(Ward)、 J、 D、マ
ハン(Mahan)、 o、 K、ヴイスマット(Wi
s+*att) + タンパク質尿症の現在の概念+
Cl1n、 Chew、 35 (5L775−65
(I989)。このうち、最もよく知られているのはC
BB法である:染料コオマシー(Coomass ie
)ブリリアントブルーはISAに結合し、その色を黄色
から青色に変える。この色変化は、 ISAに結合する
に従って染料のpK値が変化することによる。結果とし
て染料は、青色の共役塩基形に変わる:l’1.M、ブ
ラッドホード(Bradford) 、タンパク質−染
料結合の原則を利用して、タンパク質のマイクログラム
量の急速かつ敏感な定量法、 Anal、 Bioch
e+w、72.248−54(I976)。
〈発明が解決しようとする課題〉
公知方法が、なぜ完全に満足されないかいくつかの理由
がある。tlsAの存在下で染料のスペクトル変化に基
づく方法は、極めて敏感でなく (検出限界10−10
0mg八〇かつへた方法の精度を制限する特異性がない
。タンパク質尿症の早期発見のために、1mg/lの検
出限界が望まれる。
がある。tlsAの存在下で染料のスペクトル変化に基
づく方法は、極めて敏感でなく (検出限界10−10
0mg八〇かつへた方法の精度を制限する特異性がない
。タンパク質尿症の早期発見のために、1mg/lの検
出限界が望まれる。
電気泳動法は2時間を消費する。更に結果の定量化は、
しばしば困難となる。というのは多(の場合大多数の誤
りを引き起す他のタンパク質分画からISAは完全に分
離されないからである。分離の技術を改良するためにい
くつか試みられている。
しばしば困難となる。というのは多(の場合大多数の誤
りを引き起す他のタンパク質分画からISAは完全に分
離されないからである。分離の技術を改良するためにい
くつか試みられている。
たとえば等電点電気泳動(E、 マイジンガー(Me
isinger) 、N 、ブレラ(Gretz)、
M、ストラウヒ(Strauch) 、尿タンパクを分
析する新しい可能性;固定化p)l勾配による等電点電
気泳動、ネフロン弧(I)、 67−9(I986)
;免疫電気泳動(C,B、ローレル、アガロースゲル含
有抗体中で電気泳動によってタンパク質の定量評価、
Anal、 Biochem、15゜45−52(I9
66)) 、この高価な方法は、特別な通用に限定され
る。
isinger) 、N 、ブレラ(Gretz)、
M、ストラウヒ(Strauch) 、尿タンパクを分
析する新しい可能性;固定化p)l勾配による等電点電
気泳動、ネフロン弧(I)、 67−9(I986)
;免疫電気泳動(C,B、ローレル、アガロースゲル含
有抗体中で電気泳動によってタンパク質の定量評価、
Anal、 Biochem、15゜45−52(I9
66)) 、この高価な方法は、特別な通用に限定され
る。
ISAの内的リパーゼ活性に基づく速度法も、あまり敏
感でなく2選択的でない。限定的事実は。
感でなく2選択的でない。限定的事実は。
はとんどのタンパク質分画、特にリパーゼの妨害である
。
。
現在の技術水準の免疫法は、極めて敏感で9選択である
と考えられるが、それは高価であり2作業が困難である
。酵素結合免疫分析法(今までのところもっとも精巧な
、公知免疫法)は、約210分の培養時間を必要とする
。
と考えられるが、それは高価であり2作業が困難である
。酵素結合免疫分析法(今までのところもっとも精巧な
、公知免疫法)は、約210分の培養時間を必要とする
。
〈課題を解決するための手段〉
本発明は、上記欠点を排除する。 ISAの新規測定法
を提供する。敏感な)ISA法を、 ISAの適切な蛍
光分析測定の手段によって達成する。
を提供する。敏感な)ISA法を、 ISAの適切な蛍
光分析測定の手段によって達成する。
本発明は一般式(I)
(式中nは0又は1を示し。
M9は一価のカチオンであり。
ROはシアノ、アリール又はCOR(Rはアルコキシ。
アルキル又はアリールを示す、)であり。
9重はシアノ、アリール又はCOI? (Rはアルコキ
シ。
シ。
アルキル又は了り−ルを示す、)であり。
R2,R1は水素、アルキル又はシアノを示し。
Hff、 R5,R6,R?は水素又はアルキルを示し
。
。
R4は水素、ハロゲン、アルキル、アリール、アリール
オキシ、アルコキシ又はNR,(Rはアルキル又はアリ
ールを示す。)を示し。
オキシ、アルコキシ又はNR,(Rはアルキル又はアリ
ールを示す。)を示し。
R9はシアノ、アリール、 COR(Rはアルコキシ。
アルキル、又は了り−ルを示す。)、 Co−NAB(
Aはアルキル、アリール又はカルバモイル。
Aはアルキル、アリール又はカルバモイル。
Bはアルキル又はアリールを示す。)、 水素又はヘテ
ロサイクリルを示し。
ロサイクリルを示し。
R10はシアノ、アリール、 COR(Rはアルコキシ
。
。
アルキル又は了り−ルを示す。)、 C0−NAB (
Aはアルキル、アリール又はカルバモイル、Bはアルキ
ル又はアリールを示す。)、 水素又はヘテロサイクリ
ルを示し。
Aはアルキル、アリール又はカルバモイル、Bはアルキ
ル又はアリールを示す。)、 水素又はヘテロサイクリ
ルを示し。
R(I,R1,R9又はR111の少なくとも1個の置
換基はシアノを示し、またR3 R5は環の構成員。
換基はシアノを示し、またR3 R5は環の構成員。
たとえば−(CUz) Z−又は−(CL)x−を示す
。)なるアニオン性シアニン染料を使用することに基づ
く。
。)なるアニオン性シアニン染料を使用することに基づ
く。
特に有用な化合物は3式中
nは09
R2及びR8は水素。
R3R5はエチレン又はプロピレン
R4は塩素である化合物を包含する。
特別な配慮が式(I)(式中
RO,pl、R9はシアノ。
11710はシアノ又はベンゾアゾール−2−イル−置
換基、たとえばベンズオキサシリル、ベンゾチアゾリル
、又はそのクロロ誘導体を示す。)なる化合物に払われ
る。
換基、たとえばベンズオキサシリル、ベンゾチアゾリル
、又はそのクロロ誘導体を示す。)なる化合物に払われ
る。
次表に3選択されたアニオン性シアニン染料を示すが、
それによって本性に適する蛍光染料の数は限定されない
。夫々の最大吸収を最右欄に示す。
それによって本性に適する蛍光染料の数は限定されない
。夫々の最大吸収を最右欄に示す。
表1゜
ISAの蛍光測定に適用できる。與
シアニン染料の置換パターン及び
No。
0
1
2
3−R5
4
OCNCN H
OCNCN H
OCNCN H
OCNCN H
OCNCN H
OCNCN H
OCN C00Et H
OCNCN H
OCNCN H
OCN C00Et H
OCNCN H
OCN CN I(
OCN CN II
OCN CN CN
OCN CN CN
0CNCN H
(CHz) z−
−(CH2)!−
(CHz)z
(Ctb)z−
−(CHz) z
(CHz)z
−(CH2)2−
(CHz)x
(CHz) 3
(C1h)3
−CHzOCHz−
11、H
H,H
H,H
−CH=CH
H,H
1型的な一般式(I)のアニオン性
;最大吸収(nm)
R6R? R11R9R16λmax (nm)84
94
78
40
93
99
08
64
80
88
47
38
64
32
74
42
表1. (続き)
No、 n R’ R’
2
3
5
7
8
CN
CN
CN
CN
CH3
■
H,H
H,H
9
CN CN
■
(CH2)Z
0
CN
CN
1
(CH2)2
1
CN
CN
■
−(CHz) z
2
3
CN
CN
CN
CN
)! −(CHz) z
H−(CHz)z
4
R&
7
11
9
IG
λ0Iax (nn+)
■
CH。
CN
CH3
72
■
■
CN
CN
32
l
I
I
I
CN
0
h
97
I
CN
C0NlCONH2
00
く作用〉
本発明のシアニン染料は水溶性紫色、青色又と緑色化合
物である。その蛍光は、橙色又は赤色である。水性溶液
中での蛍光は、むしろ弱い。
物である。その蛍光は、橙色又は赤色である。水性溶液
中での蛍光は、むしろ弱い。
ISAを、一般式(I)の染料の1つを有する溶液に加
えた場合、最大蛍光はより長い波長の方へずれ、そして
蛍光強度は著しく増加する。この作用は極めて強い、
ISAの極めて少量でさえ著しいシグナルの変化を生じ
る。驚くべきことに生体液体中でISAの他のタンパク
質分画によって生じる。
えた場合、最大蛍光はより長い波長の方へずれ、そして
蛍光強度は著しく増加する。この作用は極めて強い、
ISAの極めて少量でさえ著しいシグナルの変化を生じ
る。驚くべきことに生体液体中でISAの他のタンパク
質分画によって生じる。
この様な作用はない。たとえばγ−グロブリンは。
殆んどの腎疾患でその分泌量に関していえば第二の最も
大きい分画である。驚くべきことにこれは等量のISA
のシグナル変化の0.1%以下を生じるにすぎない。か
くてISAのこの特異的測定法を。
大きい分画である。驚くべきことにこれは等量のISA
のシグナル変化の0.1%以下を生じるにすぎない。か
くてISAのこの特異的測定法を。
他のタンパク質分画からISAを前もって分離すること
なく適用することができる。
なく適用することができる。
広い範囲にわたる励起エネルギーと蛍光強度の間の線状
関係のゆえに、シグナル(すなわちしたがってこの方法
の敏感度)を、レーザー励起によって極めて増加するこ
とができる。更に雑音割合に対する極めて良好なシグナ
ルは、 ISAへの結合に基づき蛍光染料の最大励起の
赤シフトを使用することによって得ることができる。
関係のゆえに、シグナル(すなわちしたがってこの方法
の敏感度)を、レーザー励起によって極めて増加するこ
とができる。更に雑音割合に対する極めて良好なシグナ
ルは、 ISAへの結合に基づき蛍光染料の最大励起の
赤シフトを使用することによって得ることができる。
表1の染料No、6の励起スペクトルを第1図に示す(
発光波長640nmで測定)。ISAの不在下(曲線1
)、蛍光強度は極めて低い。しかしll5Aの添加によ
って(曲線2)、蛍光強度は増加し、最大励起はより一
層長い波長へずれる。第1図から明らかな様に、 He
Neレーザーを励起源として利用した場合、 ISAに
結合しない染料分子は633nmで非能率的にしか励起
されない。かくて本来の蛍光を、かなり減少する。H5
^への結合に基づき、最大励起は長波にずれ、染料をレ
ーザー光線によってより能率的に励起する。結果として
l5A−結合形の高度に選択的励起が高い程度まであり
、蛍光染料の弱く蛍光する非結合形の本来の蛍光を実質
上無視することができる。
発光波長640nmで測定)。ISAの不在下(曲線1
)、蛍光強度は極めて低い。しかしll5Aの添加によ
って(曲線2)、蛍光強度は増加し、最大励起はより一
層長い波長へずれる。第1図から明らかな様に、 He
Neレーザーを励起源として利用した場合、 ISAに
結合しない染料分子は633nmで非能率的にしか励起
されない。かくて本来の蛍光を、かなり減少する。H5
^への結合に基づき、最大励起は長波にずれ、染料をレ
ーザー光線によってより能率的に励起する。結果として
l5A−結合形の高度に選択的励起が高い程度まであり
、蛍光染料の弱く蛍光する非結合形の本来の蛍光を実質
上無視することができる。
他の一般式(I)の蛍光染料を、同一方法で適用するこ
とができ、かくて通常の励起源、たとえばレーザーダイ
オード(LD)又は発光ダイオード(LED)によって
励起することができる。
とができ、かくて通常の励起源、たとえばレーザーダイ
オード(LD)又は発光ダイオード(LED)によって
励起することができる。
この方法で、 ISAの検出限界は2表面上での吸着処
理のために高度に希釈されたISA検出溶液の乏しい安
定性及び困難な取り扱いによってしか限定されない。し
たがってその感度は従来技術の最も敏感な方法に匹敵す
るか又はそれよりも良好でさえある。
理のために高度に希釈されたISA検出溶液の乏しい安
定性及び困難な取り扱いによってしか限定されない。し
たがってその感度は従来技術の最も敏感な方法に匹敵す
るか又はそれよりも良好でさえある。
本発明を更に説明すると、蛍光偏光解消又は崩壊時間の
変化を、蛍光染料のISAへの結合の結果として、蛍光
強度の変化の代りにパラメーターとして使用する。pH
7,40の水性溶液中での適当な蛍光染料の蛍光は完全
に偏光解消されるが、 ISAに結合した時に偏光する
のを観察する。したがって偏光された蛍光の測定は、
ISAの定性及び定量検出の他の可能性を提供する。ま
た蛍光染料の蛍光崩壊時間は、 ISAに結合した時に
変化する。この事実から時間分割された蛍光分析を用い
て)ISAの定性及び定量検出に関する他の方法が提供
される。
変化を、蛍光染料のISAへの結合の結果として、蛍光
強度の変化の代りにパラメーターとして使用する。pH
7,40の水性溶液中での適当な蛍光染料の蛍光は完全
に偏光解消されるが、 ISAに結合した時に偏光する
のを観察する。したがって偏光された蛍光の測定は、
ISAの定性及び定量検出の他の可能性を提供する。ま
た蛍光染料の蛍光崩壊時間は、 ISAに結合した時に
変化する。この事実から時間分割された蛍光分析を用い
て)ISAの定性及び定量検出に関する他の方法が提供
される。
〈発明の効果〉
H3^測定の従来法に比して、新規方法はいくつかの決
定的利点を提供する; 1、この測定は、試薬液を試料液に加え1次いで蛍光強
度、偏光又は寿命を測定することに基づ(ので、この方
法の必要な時間及び価格を低く維持することができる。
定的利点を提供する; 1、この測定は、試薬液を試料液に加え1次いで蛍光強
度、偏光又は寿命を測定することに基づ(ので、この方
法の必要な時間及び価格を低く維持することができる。
2、この方法の感度を、染料の濃度及び機器パラメータ
ーの変化によって、すべての検査に11節することがで
きる。これは前からある方法と少なくとも同じ様に敏感
である。
ーの変化によって、すべての検査に11節することがで
きる。これは前からある方法と少なくとも同じ様に敏感
である。
3、この方法は極めて選択的である。大過剰の他のタン
パク質分画でさえ、たとえば生体液体中に生じるその分
画さえ妨害しない。かくて分離工程は、不必要である。
パク質分画でさえ、たとえば生体液体中に生じるその分
画さえ妨害しない。かくて分離工程は、不必要である。
4、適当な蛍光染料と固体光成分、たとえば発光ダイオ
ード又はレーザーダイオード(励起源として使用)及び
ホトダイオード(検出器として使用)との適合性のため
に、半導体工学のすべての利点(たとえば低い電圧供給
、小型、低い電流消費、高い寿命及び信頼性)を含んで
いる。
ード又はレーザーダイオード(励起源として使用)及び
ホトダイオード(検出器として使用)との適合性のため
に、半導体工学のすべての利点(たとえば低い電圧供給
、小型、低い電流消費、高い寿命及び信頼性)を含んで
いる。
5、長波蛍光励起及び発光のために、連体材料の潜在的
に妨害する短波の本来の蛍光を取り除く。
に妨害する短波の本来の蛍光を取り除く。
したがって十分に蛍光分析の固有の感度を使用ることが
できる。
できる。
適当な蛍光染料は、後記の方法によって得られる。すな
わちJ、L、スロミンスキ−(Slominski i
) +S、V、ポポフ(Popov)、 A、イルチ
ェンコ(I 1chenko)八、■、トルマチョフ(
Tolmachev)、 Zh、 Organ。
わちJ、L、スロミンスキ−(Slominski i
) +S、V、ポポフ(Popov)、 A、イルチ
ェンコ(I 1chenko)八、■、トルマチョフ(
Tolmachev)、 Zh、 Organ。
Khimii、 21.1294(I985)及び門、
ストレル(Strell)。
ストレル(Strell)。
−0B、ブラウンブルク(Braunbruck)、
W、F、フユラー(Fuhler)、 o、ツーバー(
Huber)、 Liebigs Ann。
W、F、フユラー(Fuhler)、 o、ツーバー(
Huber)、 Liebigs Ann。
Chem、 587.177(I954)である。
式(I)のアニオン性シアニン染料の製造に関して、弐
(II) HR’ H へ工C−C,C−C=C−8 R3RS (II) (式中へ は 〔 1N(CH3)! 〕 又は酸素を示し。
(II) HR’ H へ工C−C,C−C=C−8 R3RS (II) (式中へ は 〔 1N(CH3)! 〕 又は酸素を示し。
Xはアニオン(特にパークロラート)を示し。
Bは−N(CH:I)!、−OCH:l又は−OHを示
し。
し。
R3,R4,RSは上述(式(■))の意味を有する。
)なるジアルデヒド誘導体と一般式(III)Ro−(
:)1g−CN (III)(式中R0は
上述(式(■))の意味ををする。)なる活性メチレン
化合物とを塩基性縮合剤の存在下に反応させて5式(I
V) (IV) (式中Bは−N(C:tb) z、−0CL又は−OH
を示し。
:)1g−CN (III)(式中R0は
上述(式(■))の意味ををする。)なる活性メチレン
化合物とを塩基性縮合剤の存在下に反応させて5式(I
V) (IV) (式中Bは−N(C:tb) z、−0CL又は−OH
を示し。
RO,R3,R4,R5は上述(式(I))の意味を有
する。
する。
なる中間体が得られ、これを単離する。
第二段階で式(IV)の中間体と式(V)R9−CHz
−R10(V) (式中R9,RIGは上述(式(■))の意味を有する
。)なる付加的な活性メチレン化合物とを反応させて。
−R10(V) (式中R9,RIGは上述(式(■))の意味を有する
。)なる付加的な活性メチレン化合物とを反応させて。
)
式(I)のアニオン性シアニン染料が得られる。
この反応もまた塩基の存在下に実施する。
このメチレン化合物(III)と(V)が同一である場
合1式(IV)の中間体生成物の単離は不必要であり1
反応を一槽反応として実施することができる。
合1式(IV)の中間体生成物の単離は不必要であり1
反応を一槽反応として実施することができる。
適する触媒塩基として、ピリジン、第三脂肪族アミン並
びに第四級アミンの、アルカリ金属の及びアルカリ土類
金属の水酸化物が挙げられる。高活性メチレン化合物(
たとえばマロノニトリル)の場合1反応をピリジン中で
実施するのが好ましい。より小さい活性のメチレン化合
物をピリジン/トリエチルアミン中で又は塩基として水
酸化テトラメチルアンモニウムを用いて反応させるのが
好ましい。
びに第四級アミンの、アルカリ金属の及びアルカリ土類
金属の水酸化物が挙げられる。高活性メチレン化合物(
たとえばマロノニトリル)の場合1反応をピリジン中で
実施するのが好ましい。より小さい活性のメチレン化合
物をピリジン/トリエチルアミン中で又は塩基として水
酸化テトラメチルアンモニウムを用いて反応させるのが
好ましい。
2つの反応工程を、溶剤又は希釈剤の存在下に20〜1
00℃の温度範囲で実施するのが好ましい。
00℃の温度範囲で実施するのが好ましい。
適する溶剤は上記液状有機塩基、好ましくはピリジンで
ある。水酸化物を塩基成分として使用する場合、無水エ
タノール又はメタノールが好ましい。
ある。水酸化物を塩基成分として使用する場合、無水エ
タノール又はメタノールが好ましい。
第一段階でジアルデヒド誘導体(n)と2つの分子(I
I[)との反応(所望されない副反応である。
I[)との反応(所望されない副反応である。
)を回避するために、過剰の(n)を使用し、上記溶剤
の1つ中で予め希釈することができる成分(I[)を徐
々に加える。
の1つ中で予め希釈することができる成分(I[)を徐
々に加える。
式(II)の出発化合物は公知である;L、ベルリン(
Berlin)及び0.リースター(Riester)
;ホウベンヴエイル、有機化学の方法、第4版、第5
71d巻。
Berlin)及び0.リースター(Riester)
;ホウベンヴエイル、有機化学の方法、第4版、第5
71d巻。
ゲオルグチーメ出版、シュツットガルト1972. G
。
。
八、レイノルズ(Reynolds) +及びに、H,
ドレキサージ(Drexhage)、 J、 Org、
Chen+、 42.885(I977)。
ドレキサージ(Drexhage)、 J、 Org、
Chen+、 42.885(I977)。
次の例中に、2つの蛍光染料(表1の中から)の合成及
び尿中のISA測定にこれを使用することを示す。しか
しこの方法を変化させることができる。特に改良された
試料調製物を用いる方法、たとえば自動化学分析装置及
びフローインジェクションマニホルド中で、自動化臨床
分析装置又はディスポーザルプローベ中で行うことがで
きる。
び尿中のISA測定にこれを使用することを示す。しか
しこの方法を変化させることができる。特に改良された
試料調製物を用いる方法、たとえば自動化学分析装置及
びフローインジェクションマニホルド中で、自動化臨床
分析装置又はディスポーザルプローベ中で行うことがで
きる。
例1
ヘリウム−ネオンレーザ−で励起しうる。 ISA敏感
な蛍光染料(表1中のNo、6)の合成ピリジン5iを
、 N−((2−クロロ−3−(ジメチルアミノ)−メ
チレン)−1−シクロペンテン−1−イル〕−メチレン
ーN、N−ジメチルアンモニウムバークロラ − ト
(I[) 6.3g (20mmol) (八
: ClO4−” N(CHz)z;B : −
N(CH3)z; R’ : C1; R’ R’;
−(CHI)2−) とマロノジニトリル3.3g
(50mmol) との混合物に加える。混合物は直ち
に暗青色に変り、まもなく固化し、結晶性ケーキを形成
する。懸濁液を1時間7〇−80℃に加熱し、最後に冷
蔵庫中で一晩保つ。次いでジエチルエーテル20−を加
え、混合物を濾過する。沈殿をジエチルエーテルで洗滌
し、デシケータ−中でP4O10を介して乾燥し、残存
するピリジンを除去する。
な蛍光染料(表1中のNo、6)の合成ピリジン5iを
、 N−((2−クロロ−3−(ジメチルアミノ)−メ
チレン)−1−シクロペンテン−1−イル〕−メチレン
ーN、N−ジメチルアンモニウムバークロラ − ト
(I[) 6.3g (20mmol) (八
: ClO4−” N(CHz)z;B : −
N(CH3)z; R’ : C1; R’ R’;
−(CHI)2−) とマロノジニトリル3.3g
(50mmol) との混合物に加える。混合物は直ち
に暗青色に変り、まもなく固化し、結晶性ケーキを形成
する。懸濁液を1時間7〇−80℃に加熱し、最後に冷
蔵庫中で一晩保つ。次いでジエチルエーテル20−を加
え、混合物を濾過する。沈殿をジエチルエーテルで洗滌
し、デシケータ−中でP4O10を介して乾燥し、残存
するピリジンを除去する。
収率: 6.7g (68%)。染料を、更に精製する
ことなく HSA測定に関するこの方法に適用すること
ができる。
ことなく HSA測定に関するこの方法に適用すること
ができる。
例2
670nmダイオードレーザーで励起しうるll5A−
敏感な蛍光染料(表1中のNo、19)の合成(a)ピ
リジン5−中にマロノジニトリル1.2g (I8mm
ol)を有する溶液を、 N−(2−クロロ−3−(ジ
メチルアミノ)−メチレン−1−シグロペンテンー1−
イル〕−メチレン−N、N−ジメチル−アンモニウムバ
ークロラート (If)7.0g(22,3mmol)
(^ : ClO4−”N(CHz)z; B :
N(CH3)z; R’、 C1,R’−R’。
敏感な蛍光染料(表1中のNo、19)の合成(a)ピ
リジン5−中にマロノジニトリル1.2g (I8mm
ol)を有する溶液を、 N−(2−クロロ−3−(ジ
メチルアミノ)−メチレン−1−シグロペンテンー1−
イル〕−メチレン−N、N−ジメチル−アンモニウムバ
ークロラート (If)7.0g(22,3mmol)
(^ : ClO4−”N(CHz)z; B :
N(CH3)z; R’、 C1,R’−R’。
C(CL)z−)7.0g(22,3mnolの溶液に
10分間かけて攪拌下に加える。次いで溶液を70℃で
15分間保ち放冷する。石油エーテルの添加によって得
られた沈殿を吸引濾取し、全部で500−のメタノール
/水1:4(v/いで洗滌して、紫色針状晶3.6gが
得られる。精製のために、生成物をトルエンから再結晶
する。融点:212℃。
10分間かけて攪拌下に加える。次いで溶液を70℃で
15分間保ち放冷する。石油エーテルの添加によって得
られた沈殿を吸引濾取し、全部で500−のメタノール
/水1:4(v/いで洗滌して、紫色針状晶3.6gが
得られる。精製のために、生成物をトルエンから再結晶
する。融点:212℃。
(b)第二段階で、この生成物0.16g(0,69m
mo+)及び5−クロロ−2−シアノメチレン−ベンゾ
オキサゾール0.14g(0,73mmol)を、穏や
かな加熱下にメタノール約15−中に溶解する。次いで
水酸化テトラメチルアンモニウム(x5Hzo)0.1
3g(0,7mmol)を加え、溶液を室温でもう2時
間攪拌する。得られた懸濁液をジエチルエーテル50−
で処理し、最後に吸引濾取する。生成物を、2回りエチ
ルエーテルで洗滌する。収量: 0.15g(理論値の
49%)。
mo+)及び5−クロロ−2−シアノメチレン−ベンゾ
オキサゾール0.14g(0,73mmol)を、穏や
かな加熱下にメタノール約15−中に溶解する。次いで
水酸化テトラメチルアンモニウム(x5Hzo)0.1
3g(0,7mmol)を加え、溶液を室温でもう2時
間攪拌する。得られた懸濁液をジエチルエーテル50−
で処理し、最後に吸引濾取する。生成物を、2回りエチ
ルエーテルで洗滌する。収量: 0.15g(理論値の
49%)。
融点=221℃。染料を、更に精製することなく適用す
ることができる。しかし溶離剤としてアセトン/トルエ
ン混合物(I: 1.v/v)を用いてシリカゲル上で
クロマトグラフィーによって精製する。
ることができる。しかし溶離剤としてアセトン/トルエ
ン混合物(I: 1.v/v)を用いてシリカゲル上で
クロマトグラフィーによって精製する。
例3
例1の染料及び励起光源として2−mワット ヘリウム
−ネオンを用いて種々のタンパク質分画の存在下に病気
の尿見本中のISA測定。
−ネオンを用いて種々のタンパク質分画の存在下に病気
の尿見本中のISA測定。
a)蛍光染料の保存溶液の製造
例1の蛍光染料を無水イソプロパツール中に溶解する。
この保存溶液を安定にするために、染料の濃度を、 5
99nmで1cmにつき約1.5の吸光度に調整する。
99nmで1cmにつき約1.5の吸光度に調整する。
溶液を暗所に貯蔵しなければならない。
b)緩衝液
リン酸塩緩衝液pH=7.40. NaC1で生理的イ
オン強度(I= 160nuaol)に調整。
オン強度(I= 160nuaol)に調整。
c)ISA検定ストック
親油性H5A 10mgを緩衝液100i中に溶解する
。
。
d)検定曲線の作成
ISA検定ストック0.0.0.5.1.2.3及び4
−を、緩衝液で最終容量9.5−に満たす。染料保存溶
i 0.5dを、夫々の溶液に加える。混合の後。
−を、緩衝液で最終容量9.5−に満たす。染料保存溶
i 0.5dを、夫々の溶液に加える。混合の後。
溶液を直ちに蛍光光度計でヘリウム−ネオンレーザ−励
起下に測定する。使用される分析シグナルは、 630
nmで蛍光強度である(いわゆる非−ストークス蛍光)
。この方法で得られた検定曲線を第2図に示す。その範
囲は、0〜40mg/ I HSAである。
起下に測定する。使用される分析シグナルは、 630
nmで蛍光強度である(いわゆる非−ストークス蛍光)
。この方法で得られた検定曲線を第2図に示す。その範
囲は、0〜40mg/ I HSAである。
e)尿中のISA測定
尿中のISA測定を、検定曲線に関する上記方法に従っ
て実施する。沈降物を有する又は混濁を示す尿を1分析
前に濾過するか又は遠心分離することを保証することが
重要である。測定に使用される尿の量は、主にUSAの
夫々の量による。希釈を。
て実施する。沈降物を有する又は混濁を示す尿を1分析
前に濾過するか又は遠心分離することを保証することが
重要である。測定に使用される尿の量は、主にUSAの
夫々の量による。希釈を。
夫々の量が検定曲線の範囲内(O〜40mg/ e H
SA)にある様に行う。
SA)にある様に行う。
結果
次にいくつかの尿見本のl5A−測定で得られた結果の
選択、及び免疫ネフエロ及び免疫比濁方法によって得ら
れたデータとの比較を示ず:尿1:極めて混濁し、高度
に病気の尿;タンパク質を伴う;ベンスージョーンズ3
200mg/ 1 ; この方法によるHSA :
60mg/ l−;免疫−ネフェロ分析法: 65mg
/ 1゜ 尿2:澄明な尿、僅かに微小タンパク尿検出;この方法
によるHSA ; 30mg/ /l ;免疫−ネフェ
ロ分析法: 32.5mg/ I!。
選択、及び免疫ネフエロ及び免疫比濁方法によって得ら
れたデータとの比較を示ず:尿1:極めて混濁し、高度
に病気の尿;タンパク質を伴う;ベンスージョーンズ3
200mg/ 1 ; この方法によるHSA :
60mg/ l−;免疫−ネフェロ分析法: 65mg
/ 1゜ 尿2:澄明な尿、僅かに微小タンパク尿検出;この方法
によるHSA ; 30mg/ /l ;免疫−ネフェ
ロ分析法: 32.5mg/ I!。
尿3:沈降物含有、病気のタンパク尿検出されず;この
方法によるHSA ; 18mg/ 1 ;免疫−ネフ
ェロ分析法; 15Z5mg/ A’ 0 尿4:澄明な尿、病気のタンパク尿検出されず;この方
法によるHSA ; 10mg/ 1 ;比濁分析法:
検出限界以下のISA。
方法によるHSA ; 18mg/ 1 ;免疫−ネフ
ェロ分析法; 15Z5mg/ A’ 0 尿4:澄明な尿、病気のタンパク尿検出されず;この方
法によるHSA ; 10mg/ 1 ;比濁分析法:
検出限界以下のISA。
尿5:澄明な尿、高い病気(タンパク尿);タンパク質
を伴うニゲロブリン;この方法によるISA 。
を伴うニゲロブリン;この方法によるISA 。
3100mg/ 1 ;免疫−ネフェロ分析法: 30
25mg/ l 。
25mg/ l 。
尿6:T−グロブリン5釦g/!!を含有する合成尿ス
タンダード:この方法によるHSA : Omg/
1゜
タンダード:この方法によるHSA : Omg/
1゜
第1図は1本発明による1表1に挙げた染料No。
6の励起スペクトル(発光波長640nm)であり、第
2図はへリウムーネオンレーザー励起下に蛍光光度計で
測定されたll5A検定曲線である。
2図はへリウムーネオンレーザー励起下に蛍光光度計で
測定されたll5A検定曲線である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1)a)一般式( I ) ▲数式、化学式、表等があります▼( I ) (式中nは0又は1を示し、 M^+は一価のカチオンであり、 R^0はシアノ、アリール又はCOR(Rはアルコキシ
、アルキル又はアリールを示す。)であり、 R^1はシアノ、アリール又はCOR(Rはアルコキシ
、アルキル又はアリールを示す。)であり、 R^2、R^8は水素、アルキル又はシアノを示し、R
^3、R^5、R^6、R^7は水素又はアルキルを示
し、R^4は水素、ハロゲン、アルキル、アリール、ア
リールオキシ、アルコキシ又はNR_z(Rはアルキル
又はアリールを示す。)を示し、 R^9はシアノ、アリール、COR(Rはアルコキシ、
アルキル、又はアリールを示す。)、CO−NAB(A
はアルキル、アリール又はカルバモイル、Bはアルキル
又はアリールを示す。)、水素又はヘテロサイクリルを
示し、 R^1^0はシアノ、アリール、COR(Rはアルコキ
シ、アルキル又はアリールを示す。)、 CO−NAB(Aはアルキル、アリール又はカルバモイ
ル、Bはアルキル又はアリールを示す。)、水素又はヘ
テロサイクリルを示し、R^0、R^1、R^9又はR
^1^0の少なくとも1個の置換基はシアノを示し、R
^3−R^5は環の構成員、たとえば−(CH_2)_
2−又は−(CH_2)_3−を示す。)なるアニオン
性シアニン染料を、試料に加え、b)蛍光強度の増加又
は蛍光偏光解消の変化、又はHSAの染料への結合の結
果として染料の蛍光寿命の変化を測定し、 c)蛍光の変化を試料中のHSAの実際の量に関連づけ
る工程から成る、生体液体中のヒト血清アルブミンの光
学的検出及び定量的測定法。 2)一般式( I ) (式中nは0、 R^2、R^8は水素、 R^3及びR^5はエチレン又はプロピレン架橋、R^
4は塩素、 R^0、R^1、R^9はシアノ、 R^1^0はシアノ、又は場合により置換された2−ベ
ンゾオキサゾリル基である。) なるアニオン性染料を使用する請求項1記載の方法。 3)励起光源としてヘリウム−ネオンレーザー又はレー
ザーダイオードを使用する請求項1又は2記載の方法。 4)試料を予め希釈するか又はキャリヤースチーム中に
注入するか又は自動化分析装置に入れる請求項1又は2
記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
AT1949/89 | 1989-08-17 | ||
AT0194989A ATA194989A (de) | 1989-08-17 | 1989-08-17 | Verfahren zum nachweis und zur bestimmung von humanserumalbumin in biologischen fluessigkeiten mit hilfe fluorogener cyanin-farbstoffe |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH03118449A true JPH03118449A (ja) | 1991-05-21 |
Family
ID=3524527
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2214459A Pending JPH03118449A (ja) | 1989-08-17 | 1990-08-15 | ヒト血清アルブミンの検出及び測定法 |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US5182214A (ja) |
EP (1) | EP0413678B1 (ja) |
JP (1) | JPH03118449A (ja) |
AT (1) | ATA194989A (ja) |
DE (1) | DE59007613D1 (ja) |
Families Citing this family (25)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB9211980D0 (en) * | 1992-06-05 | 1992-07-15 | Int Murex Tech Corp | Immunoassay method |
US5616502A (en) * | 1995-05-19 | 1997-04-01 | Molecular Probes, Inc. | Non-specific protein staining using merocyanine dyes |
US5870188A (en) * | 1995-09-20 | 1999-02-09 | Kyoto Dei-Ichi, Kagaku Co. Ltd. | Measuring method and measuring apparatus by light scattering |
US6766183B2 (en) | 1995-11-22 | 2004-07-20 | Medtronic Minimed, Inc. | Long wave fluorophore sensor compounds and other fluorescent sensor compounds in polymers |
US7070937B1 (en) | 1998-10-02 | 2006-07-04 | Ischemia Technologies, Inc. | Marker useful for detection and measurement of free radical damage and method |
US20050142613A1 (en) * | 1998-10-02 | 2005-06-30 | David Bar-Or | Test for the rapid evaluation of ischemic states and kits |
US7297544B2 (en) * | 1998-10-02 | 2007-11-20 | Ischemia Technologies, Inc. | Tests for the rapid evaluation of ischemic states and kits |
US6475743B1 (en) | 1998-10-02 | 2002-11-05 | Ischemia Technologies, Inc. | Marker useful for detection and measurement of free radical damage and method |
US7449338B2 (en) * | 1998-10-02 | 2008-11-11 | Ischemia Technologies, Inc. | Tests for the rapid evaluation of ischemic states and kits |
US20030215359A1 (en) * | 1998-10-02 | 2003-11-20 | Ischemia Technologies, Inc. | Tests for the rapid evaluation of ischemic states and kits |
EP1290428A1 (en) * | 2000-06-02 | 2003-03-12 | Medicometrics APS | Method and system for classifying a biological sample |
WO2002066986A2 (en) * | 2001-02-15 | 2002-08-29 | Medtronic Minimed, Inc. | Polymers functionalized with fluorescent boronate motifs |
US7045361B2 (en) | 2001-09-12 | 2006-05-16 | Medtronic Minimed, Inc. | Analyte sensing via acridine-based boronate biosensors |
US7345150B2 (en) * | 2002-03-26 | 2008-03-18 | Medical University Of Toledo | Albumin-based colloid composition having at least one protected thiol region, methods of making, and methods of use |
WO2004024191A2 (en) * | 2002-09-10 | 2004-03-25 | University Of Maryland, Baltimore | Use of metallic particles to improve fluorescence imaging |
US7074194B2 (en) * | 2003-05-19 | 2006-07-11 | Ischemia Technologies, Inc. | Apparatus and method for risk stratification of patients with chest pain of suspected cardiac origin |
US7776529B2 (en) | 2003-12-05 | 2010-08-17 | Life Technologies Corporation | Methine-substituted cyanine dye compounds |
DE102005004745A1 (de) * | 2005-01-31 | 2006-08-10 | Dyomics Gmbh | Verfahren zu Nachweis und Quantifizierung von Proteinen |
JP5306811B2 (ja) * | 2005-05-11 | 2013-10-02 | ライフ テクノロジーズ コーポレーション | 2本鎖dnaへの高い選択性を有する蛍光化学物質及びそれらの使用 |
DE112006003967B4 (de) | 2006-07-28 | 2017-09-21 | Pierce Biotechnology, Inc. | Farbstoffe, Farbstoffzusammensetzungen und Verfahren zum Anfärben von Proteinen |
MD4054C1 (ro) * | 2009-11-06 | 2011-02-28 | Государственный Медицинский И Фармацевтический Университет "Nicolae Testemitanu" Республики Молдова | Metodă de determinare a capacităţii albuminei ischemic modificate de legare a cobaltului |
CN103115904B (zh) * | 2013-01-24 | 2016-12-28 | 中国科学院化学研究所 | 尿微量白蛋白检测方法、系统和试剂盒 |
US9804154B2 (en) | 2013-03-12 | 2017-10-31 | Epinex Diagnostics, Inc. | Rapid test for urine albumin and urine creatinine |
JP7068822B2 (ja) | 2014-09-08 | 2022-05-17 | インディアン インスティテゥート オブ サイエンス | 電気化学的バイオセンサ及びアルブミンとその複合体の検出方法 |
CN105203518A (zh) * | 2015-10-08 | 2015-12-30 | 三峡大学 | 一类荧光试剂,制备方法及其应用 |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4568647A (en) * | 1983-10-11 | 1986-02-04 | Eastman Kodak Company | Method and element for albumin assay |
DE3774570D1 (ja) * | 1987-04-22 | 1991-12-19 | Pharmacia Diagnostics Inc., Fairfield, N.J., Us |
-
1989
- 1989-08-17 AT AT0194989A patent/ATA194989A/de not_active IP Right Cessation
-
1990
- 1990-07-20 US US07/556,268 patent/US5182214A/en not_active Expired - Fee Related
- 1990-07-26 EP EP90890229A patent/EP0413678B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-07-26 DE DE59007613T patent/DE59007613D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1990-08-15 JP JP2214459A patent/JPH03118449A/ja active Pending
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP0413678A2 (de) | 1991-02-20 |
DE59007613D1 (de) | 1994-12-08 |
ATA194989A (de) | 1990-04-15 |
EP0413678B1 (de) | 1994-11-02 |
US5182214A (en) | 1993-01-26 |
EP0413678A3 (en) | 1991-07-24 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JPH03118449A (ja) | ヒト血清アルブミンの検出及び測定法 | |
EP1928822B1 (en) | Violet laser excitable dyes and their method of use | |
SU1621811A3 (ru) | Способ получени производных резоруфина | |
ITMI952049A1 (it) | Coloranti fluorescenti della famiglia della solfo benz e indocianina | |
JPH03172196A (ja) | 蛍光発生基質およびそれを用いたタンパク質分解酵素の検出方法 | |
JP3984475B2 (ja) | 蛍光検出法および試薬 | |
Kessler et al. | Laser-induced fluorometric determination of albumin using longwave absorbing molecular probes | |
EP0078477A2 (en) | Fenclofenac as TBP blocking agent in iodothyronine immunoassays | |
JP4893964B2 (ja) | 新規化合物、該化合物を含むペプチド又はタンパク質の分析用試薬、及び該分析試薬を使用する分析方法 | |
US3871825A (en) | Fluorometric reagents and methods | |
Fu et al. | Quinolone-based fluorescent probes for distinguished detection of Cys and GSH through different fluorescence channels | |
JPH02227098A (ja) | マレイミド基を測定する方法および測定剤 | |
WO2007030521A1 (en) | Control of chemical modification | |
JPH01305069A (ja) | ベンゾトリアゾール誘導体およびそれを含有する発螢光試薬 | |
US7282339B2 (en) | Competitive immunoassay | |
CN103435625B (zh) | 红光发射罗丹明类离子荧光探针及其应用 | |
CN112876426B (zh) | 检测人血清白蛋白的苯并噻唑类荧光探针及制备和试剂盒 | |
Chen | Fluorescence properties of fluorescamine-protein conjugates | |
JPS61234797A (ja) | マクロ分子ヒドロラ−ゼ用螢光偏光アツセイ、このアツセイに使用する試薬及びこれら試薬の製法 | |
JPH08271430A (ja) | 新規蛍光色素 | |
JPH0133781B2 (ja) | ||
CN109824571A (zh) | 一种荧光探针及其制备方法与应用 | |
JP2008180588A (ja) | アクロレイン及び/又はアクロレイン付加物を検出するための試薬及び方法 | |
JP3551984B2 (ja) | アクリジン誘導体 | |
JPH04120058A (ja) | モノエチルグリシンキシリジド誘導体および類似体およびその製法および用途 |