CN103115904B - 尿微量白蛋白检测方法、系统和试剂盒 - Google Patents

尿微量白蛋白检测方法、系统和试剂盒 Download PDF

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    • C09B23/0008—Methine or polymethine dyes, e.g. cyanine dyes substituted on the polymethine chain

Abstract

本发明涉及尿微量白蛋白检测方法、系统和试剂盒。一种检测溶液中尿微量白蛋白浓度的方法，包括：（1）配制尿微量白蛋白浓度不同的多个溶液样本，其中每个所述溶液样本中含有相同浓度的菁染料；（2）检测采集波长处的荧光强度值；（3）获得尿微量白蛋白浓度的标准曲线；（4）在待测液体样品中加入菁染料、含有钾离子或钠离子的缓冲溶液，以使待测液体样品中的菁染料的浓度以及pH值与步骤（1）中的溶液样本一致，从而得到测试溶液，并记录待测液体样品被稀释的比例；（5）检测所述采集波长处的荧光强度值；（6）在标准曲线中找到对应的测试溶液的尿微量白蛋白浓度值，计算出待测样品的尿微量白蛋白浓度；其中所述采集波长在550nm至650nm的范围。

Description

尿微量白蛋白检测方法、系统和试剂盒
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体而言涉及一种尿微量白蛋白检测方法、系统和试剂盒。
背景技术
微量白蛋白尿是指在尿中出现微量白蛋白。白蛋白是一种血液中的正常蛋白质，但在生理条件下尿液中仅出现极少量白蛋白。微量白蛋白尿反映肾脏异常渗漏蛋白质。尿微量白蛋白的增高多见于糖尿病肾病、高血压、妊娠子痫前期，是肾损伤的早期敏感指标。通常应用尿微量蛋白指标来监测肾病的发生。尿微量蛋白的检测是早期发现肾病最敏感、最可靠的诊断指标。
尿微量白蛋白是评估肾脏受损程度：当发现尿微量白蛋白在20mg/L-200mg/L范围内，尿常规尿蛋白的显示为阴性(-)或(+-)，就属于微量白蛋白尿，这个时候说明肾脏已经损伤，如果患者能够经过规范的修复肾单位，逆转纤维化治疗，尚可彻底修复肾小球，消除蛋白尿。而当尿中微量白蛋白超过200mg/L时，尿常规测试尿蛋白阳性(+)~(+++)，此时证明机体已有大量白蛋白漏出，可能出现低蛋白血症，如果不及时进行医治，就会进入尿毒症期。
微量白蛋白尿也是整个血管系统改变的征象，并可认为是动脉病变的“窗口”，因为它是肾脏和心血管系统改变的早期指征。
通过尿微量白蛋白的数值，结合发病情况、症状以及病史陈述就可以较为准确的诊断病情。判断病情进入了纤维化那个阶段。所以，定期检测尿微量白蛋白（U-MA），普通人应当每年一次，而已增高的患者应每3个月测试一次。这样，对于肾病的预防及早期治疗都起的了积极作用。
现有技术中测定尿微量白蛋白的方法主要有：放射免疫法、ELASA法等。放射免疫法最早用于测定尿微量白蛋白，随后免疫透射比浊法、酶联免疫测定等方法相继应用。但是，放射免疫利用放射性同位素作为示踪剂，影响操作人员的身体健康，并严重污染环境。其它的检测方法也具有仪器试剂条件等限制而难以推广的特点。
发明内容
本发明的目的：提供一种利用菁染料超分子体系检测尿微量白蛋白浓度的新方法，以及应用该方法配制而成的尿微量白蛋白浓度检测试剂盒。利用该试剂盒中的试剂，可通过检测溶液样本的荧光强度值测定样品中的尿微量白蛋白浓度。
本发明的总体技术路线为：通过在样品中加入菁染料超分子体系使之与尿微量白蛋白作用，随之菁染料超分子体系的聚集形态发生转变，从而发生荧光强度变化，反映出尿微量白蛋白的浓度水平。
本发明提供一种检测溶液中尿微量白蛋白浓度范围的方法，所述方法包括以下步骤：
（1）用pH5.0～8.2的含有钾离子或钠离子的缓冲溶液、尿微量白蛋白和菁染料配制尿微量白蛋白浓度不同的多个溶液样本，其中每个所述溶液样本中含有相同浓度的菁染料；
（2）将所述多个溶液样本置于荧光光谱仪下，采用540至570nm的激发波长，检测采集波长处的荧光强度值；
（3）以各个所述溶液样本的尿微量白蛋白浓度作为横坐标或纵坐标，以步骤（2）中测得的采集波长处的荧光强度值为纵坐标或横坐标作图，从而获得尿微量白蛋白浓度的标准曲线；
（4）在待测液体样品中加入菁染料和含有钠离子或钾离子的缓冲溶液，以使待测液体样品中的菁染料浓度以及pH值与步骤（1）中的溶液样本一致，从而得到测试溶液，并记录待测液体样品被稀释的比例；
（5）将步骤（4）中获得的测试溶液置于荧光光谱仪下，采用与步骤（2）相同的激发波长，检测所述采集波长处的荧光强度值；
（6）利用步骤（5）中测得荧光强度值在步骤（3）中获得的尿微量白蛋白浓度标准曲线中找到对应的测试溶液的尿微量白蛋白浓度值，然后通过待测样品被的稀释比例计算出待测样品的尿微量白蛋白浓度；
其中所述采集波长在550nm至650nm的范围。
根据本发明的方法，其中所述含有钾离子或钠离子的缓冲液选自添加有水溶性钠盐或钾盐的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液、硼酸-硼砂缓冲液、三乙醇胺缓冲液、咪唑-盐酸缓冲液、双甘氨肽缓冲液、2-氨基-2-甲基-1-丙醇缓冲液、磷酸钾-磷酸氢钾缓冲液、磷酸钠-磷酸氢钠缓冲液、巴比妥钠-盐酸缓冲液、巴比妥钾-盐酸缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钾缓冲液、甘氨酸-氢氧化钠缓冲液、硼砂-氢氧化钠缓冲液、磷酸钠缓冲液或者；所述缓冲液中缓冲剂的浓度范围在1～50mmol/L，优选10～30mmol/L。
根据本发明的方法，其中所述水溶性钾盐或钠盐可选自氯化钾、溴化钾、碘化钾、硫酸钾、硝酸钾、氯化钠、溴化钠、碘化钠、硫酸钠或硝酸钠等，但可用于本发明的可溶性钠盐或钾盐不限于此，还要能够在水溶液中解离出钠离子或钾离子的盐都可以在本发明的方法中使用。
根据本发明的方法，其中所述菁染料为下式I的化合物
式I
其中：R1为C1-C6的烷基、苯基、烷基取代的苯基；R2、R3、R4和R5独立地选自H或C1-C6的烷基，或者R2和R3与它们所连接的碳原子一起形成5元至7元的环结构，或者R4和R5与它们所连接的碳原子一起形成5元至7元的环结构；R6和R7为C1-C6烷基或者磺酸基取代的C1-C6烷基；Y为反离子，根据R6和R7所带电荷的不同而不同，若R6和R7为烷基，则Y为卤素阴离子；若R6和R7只有一个带有磺酸根，则无需Y作为反离子；若R6和R7均带有磺酸根，则Y为三乙胺阳离子；X1，X2独立地选自碳（C）、氧（O）、硫（S）、硒（Se）或碲（Te）。
根据本发明的方法，其中C1-C6的烷基为碳原子数为1-6的直链或支链的烷基，包括但不限于，甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊基、异戊基、正己基或异己基等。
根据本发明的方法，其中R1选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊基、异戊基、正己基、异己基、苯基、甲基苯基或二甲基苯基。
根据本发明的方法，其中R2、R3、R4和R5独立地选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊基、异戊基、正己基或异己基。
根据本发明的方法，其中R2和R3与它们所连接的碳原子可以形成5元至7元的饱和环结构或不饱和环结构，所述环结构可以含或不含有氮（N）或硫（S）原子。
根据本发明的方法，其中R4和R5与它们所连接的碳原子可以形成5元至7元的饱和或不饱和环结构，所述环结构可以含或不含有N或S原子。
根据本发明的方法，其中Y优选为氟、氯、溴、碘阴离子或三乙胺阳离子。
根据本发明所述的方法，各溶液样本中尿微量白蛋白浓度的范围优选0~1000mg/L的范围，优选在0~600mg/L的范围，进一步优选在0~400mg/L的范围。
根据本发明的方法，其中所述菁染料在溶液样本中的浓度在1~35μmol/L的范围，优选在3~20μmol/L的范围。
根据本发明的方法，其中所述水溶性钠盐或钾盐在溶液样本中的浓度在1~300mmol/L的范围，优选在50～150mmol/L范围。
本发明还提供一种用于检测溶液中尿微量白蛋白浓度的试剂盒和系统，所述试剂盒包括：pH5.0~8.2的含有钠离子或钾离子的缓冲液、尿微量白蛋白和菁染料；所述系统包括所述试剂盒和荧光光谱仪。
根据本发明的试剂盒和系统，其中所述含有钾离子或钠离子的缓冲液选自磷酸钠-磷酸氢钠缓冲液、巴比妥钠-盐酸缓冲液、巴比妥钾-盐酸缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钾缓冲液、甘氨酸-氢氧化钠缓冲液、硼砂-氢氧化钠缓冲液、磷酸钠缓冲液或者添加有水溶性钠盐或钾盐的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液、硼酸-硼砂缓冲液、三乙醇胺缓冲液、咪唑-盐酸缓冲液、双甘氨肽缓冲液、2-氨基-2-甲基-1-丙醇缓冲液、磷酸钾-磷酸氢钾缓冲液；所述缓冲液中缓冲剂的浓度在1～50mmol/L的范围，优选在10～30mmol/L的范围。
根据本发明的试剂盒和系统，其中所述水溶性钠盐或钾盐可选自氯化钾、溴化钾、碘化钾、硫酸钾、硝酸钾、氯化钠、溴化钠、碘化钠、硫酸钠或硝酸钠等，但可用于本发明的可溶性钠盐或钾盐不限于此，还要能够在水溶液中解离出钠离子或钾离子的盐都可以在本发明的试剂盒中使用。
根据本发明的试剂盒和系统，其中所述菁染料为下式I的化合物
式I
其中：R1为C1-C6的烷基、苯基、烷基取代的苯基；R2、R3、R4和R5独立地选自H或C1-C6的烷基，或者R2和R3与它们所连接的碳原子一起形成5元至7元的环结构，或者R4和R5与它们所连接的碳原子一起形成5元至7元的环结构；R6和R7为C1-C6烷基或者磺酸基取代的C1-C6烷基；Y为反离子，根据R6和R7所带电荷的不同而不同，若R6和R7为烷基，则Y为卤素阴离子；若R6和R7只有一个带有磺酸根，则无需Y作为反离子；若R6和R7均带有磺酸根，则Y为三乙胺阳离子；X1，X2独立地选自碳（C）、氧（O）、硫（S）、硒（Se）或碲（Te）。
根据本发明的试剂盒和系统，其中C1-C6的烷基为碳原子数为1-6的直链或支链的烷基，包括但不限于，甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊基、异戊基、正己基或异己基等。
根据本发明的试剂盒和系统，其中R1选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊基、异戊基、正己基、异己基、苯基、甲基苯基或二甲基苯基。
根据本发明的试剂盒和系统，其中R2、R3、R4和R5独立地选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊基、异戊基、正己基或异己基。
根据本发明的试剂盒和系统，其中R2和R3与它们所连接的碳原子可以形成5元至7元的饱和环结构或不饱和环结构，所述环结构可以含或不含有氮（N）或硫（S）原子。
根据本发明的试剂盒和系统，其中R4和R5与它们所连接的碳原子可以形成5元至7元的饱和或不饱和环结构，所述环结构可以含或不含有N或S原子。
根据本发明的试剂盒和系统，其中Y优选为氟、氯、溴、碘阴离子或三乙胺阳离子。
在本发明的方法和试剂盒以及系统中，也可以先将菁染料、缓冲溶液等配制成一定浓度的母液，以便在配制标准溶液样本和测试溶液时使用。
需要注意的是，在本发明的方法中，当配制溶液样本制作标准曲线时，并不对溶液样本的数量进行限定，因为本领域技术人员可以根据常规的实验经验进行操作，例如可以配制2个以上的溶液样本，或5个以上，或10个以上，这对于本领域技术人员来说是显而易见的。
本发明的方法和试剂盒的主要优点在于：
1）本发明利用菁染料超分子聚集体特异识别尿微量白蛋白，可在生理条件下操作而不受影响，对尿微量白蛋白特异性高；
2）本发明使用菁染料超分子探针，对尿微量白蛋白十分敏感，伴有聚集形态的改变，同时在荧光光谱中展现出十分强烈的变化；
3）本发明所使用的菁染料超分子探针，不需要特殊或额外仪器，测试成本低廉，便于行业内推广应用；
4）本发明所用试剂成分只有1～2种，只需按比例混合就可检测，操作简单、快捷且成本低廉，该体系在缓冲液环境中操作，不会污染环境。
5）本发明所用试剂成分简单、种类少，相互之间不会产生影响，且稳定性好，可长时间储存，能很好保证应用测试效果；
6）应用本发明提供的检测方法可以制成液态试剂、干粉试剂、干试剂等多种形式的试剂。
7）应用本发明提供的检测方法，根据菁染料聚集体颜色变化的特性，可以开发成试纸的形式，使检测更为简单、便利。
附图说明
图1是根据本发明实施例1的尿微量白蛋白浓度标准曲线；
图2是根据本发明实施例2的尿微量白蛋白浓度标准曲线；
图3是根据本发明实施例3的尿微量白蛋白浓度标准曲线；
图4是根据本发明实施例4的尿微量白蛋白浓度标准曲线；
图5是根据本发明实施例5的尿微量白蛋白浓度标准曲线；
图6是根据本发明实施例6的尿微量白蛋白浓度标准曲线；
图7是根据本发明实施例7的尿微量白蛋白浓度标准曲线；
图8是根据本发明实施例8的尿微量白蛋白浓度标准曲线；
具体实施方式
下面将参照附图以具体实施例的方式来更详细地描述本发明，但是应当理解，本发明可以以不同的方式实施，提供这些实施例仅是为了使本说明书充分和完整，以使本领域技术人员能够实施本发明，本发明的范围不应当限定为本文所列的具体实施例。
实施例1
本实施例对三个尿液样本的尿微量白蛋白浓度进行验证，各尿液样本的实际尿微量白蛋白浓度如下：尿样1为5.84mg/L、尿样2为22.25mg/L、尿样3为68.17mg/L。在本实施例中所使用的菁染料为下式的化合物
1）配制标准溶液样本
将一定量的尿微量白蛋白溶解于含有150mmol/L NaCl的Tris缓冲液（pH8.0，缓冲剂1mmol/L）中，制备浓度为1g/L的尿白蛋白母液，备用。
取浓度为200μmol/L菁染料甲醇溶液200μL，加入9.8ml含有20mmol/L NaCl的Tris缓冲液（pH8.0，缓冲剂1mmol/L）。把上述样本平均分成10份，每份样本溶液为1mL。
取其中的7个样本，分别加入一定量的浓度为1g/L的尿白蛋白溶液，然后用含有150mmol/L NaCl的Tris缓冲液定容至2mL，得到尿微量白蛋白的浓度分别为0、10、20、50、100、150、200mg/L的标准样本溶液。
2）配制测试溶液
取剩余的3个样本，加入尿液样本各1mL，得到3个测试溶液。
3）检测分析
将上述样品荧光光谱仪进行分析。一切操作都在室温环境下进行，不需额外条件。荧光光谱激发波长为560nm，波长收集范围为570～650nm。
4）结果分析
以标准样本的在波长580nm处的荧光强度（FI）为纵坐标，以标准样本的尿微量白蛋白浓度为横坐标做图，得到尿微量白蛋白浓度的标准曲线，如图1所示。用测试溶液的荧光强度在标准曲线上找到对应的测试溶液的尿微量白蛋白浓度值，将其除以50%得到待测尿样的尿微量白蛋白浓度值，结果见下表1。
表1
实施例2
本实施例对三个尿液样本的尿微量白蛋白浓度进行验证，各尿液样本的实际尿微量白蛋白浓度如下：尿样1为9.18mg/L、尿样2为32.43mg/L、尿样3为149.57mg/L。在本实施例中所使用的菁染料为下式的化合物
1）配制标准溶液样本
将一定量的尿微量白蛋白溶解于含有150mmol/L NaCl的磷酸钠缓冲液（pH5.0，缓冲剂浓度45mmol）中，制备浓度为1g/L的尿白蛋白母液，备用。
取浓度为200μmol/L菁染料甲醇溶液200μL，加入9.6ml含有10mmol/L NaCl的磷酸钠缓冲液（pH5.0，45mmol）。把上述样本平均分成10份，每份样本溶液为0.98mL。
取其中的7个样本，分别加入一定量的浓度为1g/L的尿白蛋白母液，然后用含有150mmol/L NaCl的磷酸钠缓冲液（pH5.0，缓冲剂浓度45mmol）定容至2mL，得到尿微量白蛋白的浓度分别为0、1、2、5、10、15、20mg/L的标准样本溶液。
2）配制测试溶液
取剩余的3个样本，加入尿液样本各20μL，得到3个测试溶液。
3）检测分析
将上述样品荧光光谱仪进行分析。一切操作都在室温环境下进行，不需额外条件。荧光光谱激发波长为540nm，波长收集范围为570～650nm。
4）结果分析
以标准样本的在波长598nm处的荧光强度（FI）为纵坐标，以标准样本的尿微量白蛋白浓度为横坐标做图，得到尿微量白蛋白浓度的标准曲线，如图2所示。用测试溶液的荧光强度在标准曲线上找到对应的测试溶液的尿微量白蛋白浓度值，将其除以2%得到待测尿样的尿微量白蛋白浓度值，结果见下表2。
表2
实施例3
本实施例对三个尿液样本的尿微量白蛋白浓度进行验证，各尿液样本的实际尿微量白蛋白浓度如下：尿样1为9.82mg/L、尿样2为20.35mg/L、尿样3为78.26mg/L。在本实施例中所使用的菁染料为下式的化合物
1）配制标准溶液样本
将一定量的尿微量白蛋白溶解于含有150mmol/L NaCl、30mmol/L KCl的三乙醇胺缓冲液（pH7.0，缓冲剂浓度30mmol/L）中，制备浓度为1g/L的尿白蛋白母液，备用。
取浓度为200μmol/L菁染料甲醇溶液2mL，加入6ml的三乙醇胺缓冲液（pH7.0，缓冲剂浓度30mmol）。把上述样本平均分成10份，每份样本溶液为0.8mL。
取其中的7个样本，分别加入一定量的浓度为1g/L的尿白蛋白溶液，然后用含有150mmol/L NaCl、30mmol/L KCl的三乙醇胺缓冲液定容至1mL，得到尿微量白蛋白的浓度分别为0、10、20、50、100、150、200mg/L的标准样本溶液。
2）配制测试溶液
取剩余的3个样本，加入尿液样本各0.2mL，得到3个测试溶液。
3）检测分析
将上述样品荧光光谱仪进行分析。一切操作都在室温环境下进行，不需额外条件。荧光光谱激发波长为570nm，波长收集范围为580～650nm。
4）结果分析
以标准样本的在波长640nm处的荧光强度（FI）为纵坐标，以标准样本的尿微量白蛋白浓度为横坐标做图，得到尿微量白蛋白浓度的标准曲线，如图3所示。用测试溶液的荧光强度在标准曲线上找到对应的测试溶液的尿微量白蛋白浓度值，将其除以20%得到待测尿样的尿微量白蛋白浓度值，结果见下表3。
表3
实施例4
本实施例对三个尿液样本的尿微量白蛋白浓度进行验证，各尿液样本的实际尿微量白蛋白浓度如下：尿样1为42.58mg/L、尿样2为70.65mg/L、尿样3为218.34mg/L。在本实施例中所使用的菁染料为下式的化合物
1）配制标准溶液样本
将一定量的尿微量白蛋白溶解于含有150mmol/L NaCl、30mmol/L KCl的磷酸钾缓冲液（pH7.0，缓冲剂浓度10mmol）中，制备浓度为1g/L的尿白蛋白母液，备用。
取浓度为600μmol/L菁染料甲醇溶液600μL，加入9.4ml的磷酸钾缓冲液（pH7.0，缓冲剂浓度10mmol）。把上述样本平均分成10份，每份样本溶液为1mL。
取其中的7个样本，分别加入一定量的浓度为1g/L的尿白蛋白溶液，然后用含有150mmol/L NaCl、30mmol/L KNO3的磷酸钾缓冲液定容至2mL，得到尿微量白蛋白的浓度分别为0、50、100、150、200、300、400mg/L的标准样本溶液。
2）配制测试溶液
取剩余的3个样本，加入尿液样本各1mL，得到3个测试溶液。
3）检测分析
将上述样品荧光光谱仪进行分析。一切操作都在室温环境下进行，不需额外条件。荧光光谱激发波长为550nm，波长收集范围为580～650nm。
4）结果分析
以标准样本的在波长600nm处的荧光强度（FI）为纵坐标，以标准样本的尿微量白蛋白浓度为横坐标做图，得到尿微量白蛋白浓度的标准曲线，如图4所示。用测试溶液的荧光强度在标准曲线上找到对应的测试溶液的尿微量白蛋白浓度值，将其除以50%得到待测尿样的尿微量白蛋白浓度值，结果见下表4。
表4
实施例5
采用与实施例1相同的步骤对三个尿液样品进行检测，区别在于使用的菁染料为下式的化合物：
结果如下表5：
表5
实施例6
采用与实施例2相同的步骤对三个尿液样品进行检测，区别在于使用的菁染料为下式的化合物：
结果见下表6。
表6
实施例7
采用与实施例3相同的步骤对三个尿液样品进行检测，区别在于使用的菁染料为下式的化合物：
结果见下表7。
表7
实施例8
采用与实施例4相同的步骤对三个尿液样品进行检测，区别在于使用的菁染料为下式的化合物：
结果见下表8：
表8
本发明的显著特色之一是：基于尿微量白蛋白调控菁染料聚集形态的改变，从而使得溶液荧光光谱上发生改变。体系成分简单，反应也简单，保证了检测的精确度。
本发明的显著特色之二是：使用菁染料超分子探针，反应灵敏度高。
总之，实验证明本发明的测定方法，完全可以通过荧光光谱仪，测定出样本中尿微量白蛋白浓度水平，测试灵敏度高，特异性好，精确度好。此外，本发明提供的尿微量白蛋白检测试剂盒，稳定性好，长时间存放之后仍然能够准确检测样品中尿微量白蛋白的含量。
虽然已经以具体实施例的方式描述了本发明，但是对于本领域技术人员来说明显的是，在不脱离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围的情况下，可以对本发明进行各种变化和修改，这些变化和修改同样包括在本发明的范围内。

Claims (18)

1.菁染料在制备用于检测溶液中尿微量白蛋白浓度的试剂中的应用，所述检测包括以下步骤：
(1)用pH5.0～8.2的含有钾离子或钠离子的缓冲溶液、尿微量白蛋白和菁染料配制尿微量白蛋白浓度不同的多个溶液样本，其中每个所述溶液样本中含有相同浓度的菁染料；
(2)将所述多个溶液样本置于荧光光谱仪下，采用540至570nm的激发波长，检测采集波长处的荧光强度值；
(3)以各个所述溶液样本的尿微量白蛋白浓度作为横坐标或纵坐标，以步骤(2)中测得的各溶液样本在采集波长处的荧光强度值为纵坐标或横坐标作图，从而获得尿微量白蛋白浓度的标准曲线；
(4)在待测液体样品中加入菁染料、含有钾离子或钠离子的缓冲溶液，以使待测液体样品中的菁染料的浓度以及pH值与步骤(1)中的溶液样本一致，从而得到测试溶液，并记录待测液体样品被稀释的比例；
(5)将步骤(4)中获得的测试溶液置于荧光光谱仪下，采用与步骤(2)相同的激发波长，检测所述采集波长处的荧光强度值；
(6)利用步骤(5)中测得荧光强度值在步骤(3)中获得的尿微量白蛋白浓度标准曲线中找到对应的测试溶液的尿微量白蛋白浓度值，然后通过待测液体样品被稀释的比例计算出待测液体样品的尿微量白蛋白浓度；
其中所述采集波长在550nm至650nm的范围，
其中所述菁染料为式I的化合物，
2.如权利要求1所述的应用，其中所述含有钾离子或钠离子的缓冲溶液选自添加有水溶性钾盐或钠盐的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液、硼酸-硼砂缓冲液、三乙醇胺缓冲液、咪唑-盐酸缓冲液、双甘氨肽缓冲液、2-氨基-2-甲基-1-丙醇缓冲液、磷酸钾-磷酸氢钾缓冲液、磷酸钠-磷酸氢钠缓冲液、巴比妥钠-盐酸缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钾缓冲液、甘氨酸-氢氧化钠缓冲液、硼砂-氢氧化钠缓冲液、磷酸钠缓冲液。
3.如权利要求1所述的应用，其中所述缓冲溶液中缓冲剂的浓度在1～50mmol/L范围。
4.如权利要求2所述的应用，其中所述水溶性钾盐或钠盐选自氯化钾、溴化钾、碘化钾、硫酸钾、硝酸钾、氯化钠、溴化钠、碘化钠、硫酸钠、硝酸钠。
5.如权利要求2所述的应用，其中所述水溶性钾盐或钠盐在所述缓冲溶液中的浓度在1～300mmol/L的范围。
6.如权利要求2所述的应用，其中所述水溶性钾盐或钠盐在所述缓冲溶液中的浓度在50～150mmol/L范围。
7.如权利要求1所述的应用，其中所述菁染料在所述溶液样本中的浓度在1至35mol/L的范围。
8.如权利要求1所述的应用，其中所述菁染料在所述溶液样本中的浓度在3～20mol/L的范围。
9.如权利要求1所述的应用，其中所述溶液样本中尿微量白蛋白浓度在0～1000mg/L的范围。
10.如权利要求1所述的应用，其中所述溶液样本中尿微量白蛋白浓度在0～600mg/L的范围。
11.如权利要求1所述的应用，其中所述溶液样本中尿微量白蛋白浓度在0～400mg/L的范围。
12.一种用于检测溶液中尿微量白蛋白浓度的试剂盒，所述试剂盒包括：pH5.0～8.2的含有钠离子或钾离子的缓冲液、尿微量白蛋白和菁染料，其中所述菁染料为式I的化合物，
13.如权利要求12所述的试剂盒，其中所述含有钠离子或钾离子的缓冲液选自磷酸钠-磷酸氢钠缓冲液、巴比妥钠-盐酸缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钾缓冲液、甘氨酸-氢氧化钠缓冲液、硼砂-氢氧化钠缓冲液、磷酸钠缓冲液或者添加有水溶性钠盐或钾盐的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液、硼酸-硼砂缓冲液、三乙醇胺缓冲液、咪唑-盐酸缓冲液、双甘氨肽缓冲液、2-氨基-2-甲基-1-丙醇缓冲液、磷酸钾-磷酸氢钾缓冲液。
14.如权利要求12所述的试剂盒，其中所述缓冲液中缓冲剂的浓度在1～50mmol/L的范围。
15.如权利要求13所述的试剂盒，其中所述水溶性钠盐或钾盐选自氯化钾、溴化钾、碘化钾、硫酸钾、硝酸钾、氯化钠、溴化钠、碘化钠、硫酸钠或硝酸钠。
16.如权利要求13所述的试剂盒，其中所述水溶性钠盐或钾盐在所述缓冲液中的浓度在1～300mmol/L的范围。
17.如权利要求13所述的试剂盒，其中所述水溶性钠盐或钾盐在所述缓冲液中的浓度在50～150mmol/L范围。
18.一种用于检测溶液中尿微量白蛋白浓度的系统，所述系统包括根据权利要求12至17任一项所述的试剂盒和荧光光谱仪。
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