CN102735623A - 钾离子浓度检测试剂盒和系统 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及检测钾离子浓度的试剂盒和系统。该试剂盒和系统利用钾离子调控可形成G-四链体DNA结构转变的特性以及菁染料超分子聚集体识别G-四链体结构转变的特性，特异性高，不受样品中钠离子的影响。试剂成分简单，反应过程简单，可有效减少操作产生的误差，测试精确度高。通过该试剂盒和系统可实现快速检测，不需要特殊或额外仪器，检测成本低廉，便于行业内推广应用。

Description

钾离子浓度检测试剂盒和系统
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体而言涉及一种钾离子浓度检测试剂盒和系统。
背景技术
人体内的钾是维持细胞生理活动的主要阳离子，是保持机体的正常渗透压及酸碱平衡，参与糖及蛋白质代谢，保证神经肌肉的正常功能所必需，其含量是人体生理活动的重要指标。尿液、血清中钾离子的含量水平在临床上可用了诊断一些肾脏、心脏等方面的疾病。
正常情况下，人体的钾离子浓度有一个合理的参考范围，如血清中：3.5～5.5mmol/L；尿液中25～125mmol/24h。当钾离子高于参考值，表现出高钾症，其原因主要有：急性肾功能衰竭、严重溶血或组织损伤、急性酸中毒或组织缺氧、肾上腺皮质功能减退、醛固酮缺乏、长期应用利尿剂、家族性高血钾等。血清钾高还可引起严重的肌肉、心肌和呼吸功能的抑制性应激紊乱，以及特异的心电图改变。血清钾高于7mmol/L时，就有这些现象出现，超过10mmol/L时，即可发生心室纤颤，心脏停搏而导致死亡。反之当钾的摄入量不足、钾丢失严重、肾脏疾病转入多尿期等情况时则会出现低钾症。
现有技术中测定钾离子浓度的方法主要有：中子活化法、同位素稀释质谱法、化学测定法、火焰光度法、离子选择电极法、酶动力学法、原子分光光度法等。目前，临床上经常使用的方法是火焰光度法和离子选择电极法。
（1）火焰光度法：火焰光度法是一种发射光谱分析法，利用火焰中激发态原子回降至基态时发射的光谱强度进行含量分析，可检测血清、尿液、脑脊液及胸腹水的Na+和K+，该方法属于经典的标准参考法，优点是结果准确可靠，广为临床采用。
通常采用的定量方法有外标准法和内标准法。外标准法一般操作误差较大，不常采用。内标法是标本及标准液采用加进相同浓度的内部标准元素进行测定，一般是加入锂内标，测定的是锂／钾电流的比值，而不是单独钾的电流，这样，可减小燃气和火焰温度波动等因素引起的误差，因而有较好的准确性。
（2）离子选择电极法（ISE法）：在专用仪器上进行血清和尿液的钾、钠离子测定。因其具有标本用量少，快速准确，操作简便等优点，是目前所有方法中最为简便准确的方法，几乎有取代其他方法的趋势。其原理是：离子选择电极是一种电化学传感器，其结构中有一个对特定离子具有选择性响应的敏感膜电极，将离子活度转换成电位信号，在一定范围内，其电位与溶液中特定离子活度的对数呈线性关系，通过与已知离子浓度的溶液比较可求得未知溶液的离子活度，按其测定过程又分为直接测定法和间接测定法，目前大部分采用间接测定法，由于间接测定法将待测样本稀释后测定，所测离子活度更接近离子浓度。
目前主要的电极种类有：玻璃膜电极，感应材料为玻璃膜；固相电极，由难溶金属物质加压成型；液态膜电极，将环氧树脂或内装聚氯乙烯作为感应膜；缬氨霉素膜制成的K+电极。这些电极都具有一定寿命，使用一段时问后，电极会老化，且价格昂贵。
（3）化学测定法：目前K+的化学测定主要利用复环王冠化合物如穴冠醚或球冠醚，亦称为冠醚，均为离子载体进行测定，由于大环结构内有空穴，分子内部氧原子有未共用电子对可与金属离子结合，根据空穴大小，可选择性结合不同直径的金属离子，从而可达到测出离子浓度的目的。
（4）酶法：酶法测定钾的原理是利用对丙酮酸激酶的激活作用，后者催化磷酸烯醇式丙酮酸变为乳酸同时伴有还原型辅酶Ⅰ的消耗，在波长340nm处测NADH的吸光度下降。
（5）原子分光光度法也可用于检测血清中钾、钠离子，但操作复杂，误差较大，不及火焰光度法简便。
发明内容
本发明的目的：提供一种利用菁染料超分子与鸟嘌呤四链体（G-四链体）作用体系检测钾离子浓度的新方法，以及应用该方法配制而成的钾离子浓度检测试剂盒。利用该试剂盒中的试剂，可利用紫外吸收光谱或荧光光谱仪器定量分析血清或尿液中钾离子的浓度，测定过程不受钠离子或其他微量元素的影响，精确度高。同时，由于该试剂灵敏度很高，对不同钾离子浓度表现出颜色上的变化，肉眼可见，可实现可视化检测。
本发明的总体技术路线为：通过加入钾离子来调控G-四链体结构的形成或构象转变，随之菁染料识别G-四链体结构的变化，从而反映出钾离子的浓度水平。具体为：在没有钠离子及其他金属阳离子存在的环境下，钾离子促使单链的DNA序列转变为G-四链体结构，随着G-四链体结构的生成，菁染料的聚集形态发生变化，从而在颜色上发生改变，达到肉眼观测，同时在紫外吸收光谱及荧光光谱上也发生明显的变化，吸光度及荧光强度的变化程度与钾离子浓度成正比，从而实现定量反映钾离子水平；或者在钠离子存在的环境下，DNA序列形成反平行结构G-四链体，加入钾离子反平行G-四链体则发生构象转变，随着G-四链体构象转变，菁染料的聚集形态发生变化，从而在颜色上及紫外吸收光谱及荧光光谱上也发生明显的变化，吸光度及荧光强度的变化程度与钾离子浓度成正比，可定量反映钾离子水平。
本发明的第一方面提供一种检测液体样品中钾离子浓度的方法，所述方法包括以下步骤：
（1）用pH6.2～8.2的缓冲溶液配制钾离子浓度不同的多个溶液样本，其中每个所述溶液样本中含有相同浓度的能够形成G-四链体的DNA分子以及相同浓度的菁染料；
（2）将所述多个溶液样本置于紫外可见光吸收光谱仪或分光光度计下，检测第一波长处的吸光度值及第二波长处的吸光度值，或者将所述多个溶液样本置于荧光光谱仪下，采用560nm的激发波长，检测波长在第三波长处的荧光强度值，其中所述第一波长在560nm至590nm范围，所述第二波长在500nm至540nm范围，所述第三波长在580nm至640nm范围；
（3）以各个所述溶液样本的钾离子浓度作为横坐标或纵坐标，以步骤（2）中测得的第一波长处的吸光度值或第二波长处的吸光度值或者第一波长处的吸光度值与第二波长处的吸光度值的比值或者第三波长处的荧光强度值为纵坐标或横坐标作图，从而获得钾离子浓度的标准曲线；
（4）在待测液体样品中加入能够形成G-四链体的DNA分子、式I的化合物以及缓冲液，以使待测液体样品中的能够形成G-四链体的DNA分子的浓度、式I的化合物的浓度以及pH值与步骤（1）中的溶液样本一致，从而得到测试溶液；
（5）将步骤（4）中获得的测试溶液置于紫外可见光吸收光谱仪或分光光度计下，检测测试溶液在第一波长及第二波长处吸光度值，或者将所述测试溶液置于荧光光谱仪下，采用560nm的激发波长，检测第三波长处的荧光强度值；
（6）利用步骤（5）中测得的第一波长处的吸光度值或第二波长处的吸光度值或者第一波长处的吸光度值与第二波长处的吸光度值的比值或者第三波长处的荧光强度值在步骤（3）中获得的钾离子浓度标准曲线中找到对应的测试溶液的钾离子浓度值，然后通过待测样品被的稀释倍数计算出待测样品的钾离子浓度。
本发明的方法可以方便地用于检测各种溶液样品中的钾离子浓度，例如，可以检测人或动物血液、尿液或其他体液中的钾离子浓度。
由于在人体或动物体中，除了钾离子之外还存在许多其他金属离子，特别是钠离子的存在对本发明的方法的精确性会产生一定的影响。
因此，本发明的第二方面提供一种在钠离子背景下检测液体样品中钾离子浓度的方法，所述方法包括以下步骤：
（1）用pH6.2～8.2的缓冲溶液配制钾离子浓度不同的多个溶液样本，其中每个所述溶液样本中含有相同浓度的能够形成G-四链体的DNA分子、相同浓度的钠离子以及相同浓度的菁染料；
（2）将所述多个溶液样本置于紫外可见光吸收光谱仪或分光光度计下，检测所述溶液样本在第一波长及第四波长处的吸光度值，或者将所述多个溶液样本置于荧光光谱仪下，采用560nm的激发波长，检测波长在第三波长处的荧光强度值，其中所述第一波长在560nm至590nm范围，所述第四波长在610nm至670nm范围，所述第三波长在580nm至640nm范围；
（3）以各个所述溶液样本的钾离子浓度作为横坐标或纵坐标，以步骤（2）中测得的各溶液样本在第一波长处的吸光度值或第四波长处的吸光度值或者第一波长处的吸光度值与第四波长处的吸光度值的比值或者第三波长处的荧光强度值为纵坐标或横坐标作图，从而获得钾离子浓度的标准曲线；
（4）在待测液体样品中加入能够形成G-四链体的DNA分子、式I的化合物以及缓冲液，以使待测液体样品中的能够形成G-四链体的DNA分子的浓度、式I的化合物的浓度以及pH值与步骤（1）中的溶液样本一致，从而得到测试溶液；
（5）将步骤（4）中获得的测试溶液置于紫外可见光吸收光谱仪或分光光度计下，检测所述测试溶液在所述第一波长及所述第四波长处的吸光度值，或者将所述测试溶液置于荧光光谱仪下，采用560nm的激发波长，检测波长在所述第三波长处的荧光强度值；
（6）利用步骤（5）中测得的第一波长处的吸光度值或第四波长处的吸光度值或者第一波长处的吸光度值与第四波长处的吸光度值的比值或者第三波长处的荧光强度值在步骤（3）中获得的钾离子浓度标准曲线中找到对应的测试溶液的钾离子浓度值，然后通过待测样品被的稀释倍数计算出待测样品的钾离子浓度。
根据本发明第一方面的方法，其中所述缓冲液选自三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液、硼酸-硼砂缓冲液、三乙醇胺缓冲液、咪唑-盐酸缓冲液、双甘氨肽缓冲液或2-氨基-2-甲基-1-丙醇缓冲液。
根据本发明第二方面的方法，其中所述缓冲液选自三羟甲基氨基甲烷-盐酸（Tris-HCl）缓冲液、硼酸-硼砂缓冲液、三乙醇胺缓冲液、咪唑-盐酸缓冲液、双甘氨肽缓冲液、2-氨基-2-甲基-1-丙醇缓冲液、磷酸钠-磷酸氢钠缓冲液、巴比妥钠-盐酸缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、甘氨酸-氢氧化钠缓冲液、硼砂-氢氧化钠缓冲液或磷酸钠缓冲液。
在本发明的实施方案中，对缓冲液中缓冲剂的浓度并不做特别的限定，但是优选的浓度范围为10～50mmol/L。
根据本发明第一方面或第二方面的方法，其中所述菁染料为下式I的化合物
Figure BDA00001780421100051
式I
其中：R1为C1-C6的烷基、苯基、烷基取代的苯基；R2、R3、R4和R5独立地选自H或C1-C6的烷基，或者R2和R3与它们所连接的碳原子一起形成5元至7元的环结构，或者R4和R5与它们所连接的碳原子一起形成5元至7元的环结构；R6和R7为C1-C6烷基或者磺酸基取代的C1-C6烷基；Y为反离子，根据R6和R7所带电荷的不同而不同，若R6和R7为烷基，则Y为卤素阴离子；若R6和R7只有一个带有磺酸根，则无需Y作为反离子；若R6和R7均带有磺酸根，则Y为三乙胺阳离子；X1，X2独立地选自碳（C）、氧（O）、硫（S）、硒（Se）或碲（Te）。
根据本发明第一方面或第二方面的方法，其中C1-C6的烷基为碳原子数为1-6的直链或支链的烷基，包括但不限于，甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊基、异戊基、正己基或异己基等。
根据本发明第一方面或第二方面的方法，其中R1选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊基、异戊基、正己基、异己基、苯基、甲基苯基或二甲基苯基。
根据本发明第一方面或第二方面的方法，其中R2、R3、R4和R5独立地选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊基、异戊基、正己基或异己基。
根据本发明第一方面或第二方面的方法，其中R2和R3与它们所连接的碳原子可以形成5元至7元的饱和环结构或不饱和环结构，所述环结构可以含或不含有氮（N）或硫（S）原子。
根据本发明第一方面或第二方面的方法，其中R4和R5与它们所连接的碳原子可以形成5元至7元的饱和或不饱和环结构，所述环结构可以含或不含有N或S原子。
根据本发明第一方面或第二方面的方法，其中Y优选为氟、氯、溴、碘阴离子或三乙胺阳离子。
根据本发明第一方面或第二方面所述的方法，其中可以通过使用可溶性钾盐如氯化钾、硫酸钾、硝酸钾等来配制所述多个溶液样本，各溶液样本中钾离子浓度的范围优选在0至200mmol/L的范围，进一步优选在0至100mmol/L的范围，更进一步优选在0至10mmol/L的范围，最优选在0至2mmol/L的范围，其中所述可溶性钾盐的非限定性实例包括，氯化钾、溴化钾、碘化钾、硫酸钾或硝酸钾等。
根据本发明第二方面所述的方法，其中所述多个溶液样本中钠离子浓度优选控制在人体或动物体中生理浓度范围内，例如10至200mmol/L的范围，优选在40至160mmol/L的范围，钠离子的浓度可以通添加可溶性钠盐或者使用含有钠离子的缓冲液来调节，所述可溶性钠盐的非限定性实例包括，氯化钠、溴化钠、碘化钠、硫酸钠或硝酸钠等。
根据本发明第一方面或第二方面的方法，其中所述菁染料在溶液样本中的浓度在3至20μmol/L的范围，优选在5至10μmol/L，所述能够形成G-四链体的DNA分子在溶液样本中的浓度在3至30μmol/L的范围，优选在5至20μmol/L，进一步优选在10至20μmol/L。
根据本发明第一方面或第二方面所述的方法，其中所述能够形成G-四链体的DNA分子为分子序列中富含鸟嘌呤的DNA分子，并且优选分子序列中具有“GG”结构的DNA分子。此类DNA分子中，四个鸟嘌呤通过氢键连接可以形成平面四集体，两个以上的平面四集体可以相互堆叠形成立体四链结构，即鸟嘌呤四链体（G-四链体）。这类DNA分子的非限定性实例包括，如可购自英骏生物技术有限公司的TTAGGGTTAGGG、TTAGGG TTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG、AGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG、TGAGGGTGGGGAGGGTGGGGAA、AGGGAGGGCGCTGGGAGGAGGG、GGGCGCGGGAGGAATTGGGCGGG、GGTTGGTGTGGTTGG、TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGG、TTGGGGTTGGGG、GGGGTTGGGG、GGGCGCGGGAGGAAGGGGGCGGG或GGGCGCGGGAGGAATTGGGCGGG等DNA分子，但可形成G-四链体的DNA序列范围不受这些列举所限制。另外，对于本发明中所使用的能够形成G-四链体的DNA分子的长度并没有特殊限制，但是优选6~300个碱基的长度，更优选10~100个碱基的长度，最优选10~30个碱基的长度。
本发明的第三方面提供一种实施本发明方法的试剂盒和系统，所述试剂盒包括：pH6.2~8.2的缓冲液、可溶性钾盐、能够形成G-四链体的DNA分子和菁染料；所述系统包括：pH6.2~8.2的缓冲液、可溶性钾盐、能够形成G-四链体的DNA分子、菁染料和紫外可见光吸收光谱仪或分光光度计或荧光光谱仪。
根据本发明第三方面所述的试剂盒和系统，还包括可溶性钠盐。
根据本发明第三方面所述的试剂盒和系统，其中所述缓冲液、可溶性钾盐、可溶性钠盐、能够形成G四链体的DNA分子和菁染料如前文所定义。
本发明的方法和试剂盒的主要优点在于：
1）本发明利用菁染料超分子聚集体特异识别钾离子调控的G-四链体结构，可在生理钠离子浓度下操作而不受影响，对钾离子特异性高；
2）本发明使用菁染料超分子探针，对钾离子调控的G-四链体结构变化十分敏感，伴有聚集形态的改变，同时在紫外吸收光谱中展现出吸收带高达近百纳米的位移，因而产生颜色上的变化，可实现可视检测；
3）本发明所使用的菁染料超分子，在紫外吸收光谱及荧光光谱都能产生显著变化，利用普通的紫外吸收光谱仪或分光光度计或荧光光谱仪都可实现定量检测，不需要特殊或额外仪器，测试成本低廉，便于行业内推广应用；
4）本发明所用试剂成分只有3～4种，只需按比例混合，就可用仪器检测，操作简单、快捷且成本低廉，该体系在缓冲液环境中操作，不会污染环境。
5）本发明所用试剂成分简单、种类少，相互之间不会产生影响，且稳定性好，可长时间储存，能很好保证应用测试效果；
6）应用本发明提供的检测方法可以制成液态试剂、干粉试剂、干试剂等多种形式的试剂，可用来测定人体和其它动物体内钾离子的含量，也可用来检测水质或土壤等其他样本中的钾离子水平。
7）应用本发明提供的检测方法，根据菁染料聚集体颜色变化的特性，可以开发成试纸的形式，使检测更为简单、便利。
8）使用本发明的方法，通过不同的稀释倍数，可以实现对各种浓度范围的样品中的钾离子浓度进行分析。
附图说明
图1是根据本发明实施例1的钾离子浓度标准曲线；
图2是根据本发明实施例2的钾离子浓度标准曲线；
图3是根据本发明实施例3的钾离子浓度标准曲线；
图4是根据本发明实施例4的钾离子浓度标准曲线；
图5是根据本发明实施例9的钾离子浓度标准曲线；
图6是根据本发明实施例10的钾离子浓度标准曲线；
图7是根据本发明实施例11的钾离子浓度标准曲线；
图8是根据本发明实施例12的钾离子浓度标准曲线。
具体实施方式
下面将参照附图以具体实施例的方式来更详细地描述本发明，但是应当理解，本发明可以以不同的方式实施，提供这些实施例仅是为了使本说明书充分和完整，以使本领域技术人员能够实施本发明，本发明的范围不应当限定为本文所列的具体实施例。在本发明的实施例中所使用的仪器有：紫外可见光吸收光谱仪，型号为Agilent 8453UV-visible spectrophotometer；荧光光谱仪，型号Hitachi F4500spectrofluorometer(Japan)。
实施例1
在本实施例中使用的能够形成G  四链体的DNA  为AGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG，所使用的菁染料为下式的化合物
Figure BDA00001780421100091
1）制备标准溶液样本和测试溶液
将一定量的DNA溶解于pH值6.2的Tris-HCl缓冲液中，制备浓度为200μmol/LDNA母液，备用。
取浓度为200μmol/L菁染料的甲醇溶液300μL，加入19.2ml Tris-HCl缓冲液,然后再加入DNA溶液300μL混匀。把上述样本平均分成10份，每份样本溶液为1.98mL。
取其中的6个样本，分别加入一定量的浓度为200mmol/L的KCl溶液，然后用Tris-HCl缓冲液定容至2mL，得到钾离子的浓度分别为0、0.05、0.1、0.25、0.5、0.8mmol/L的标准溶液样本。
另外4个样本中加入待测尿液样本20μL，得到4个测试溶液，尿液样本占测试溶液的1%。
以上样品于阴暗处放置、备用。
2）检测分析
将上述样品分别利用紫外吸收光谱仪进行分析。一切操作都在室温环境下进行，不需额外条件。紫外吸收光谱收集的波长在400～800nm处的数据。
3）结果分析
以标准样本在580nm处的吸光度（A1）为横坐标，以标准样本的钾离子浓度为纵坐标做图，得到钾离子浓度的标准曲线，如图1所示。用测试溶液的580nm处的吸光度可以在标准曲线上找到对应的测试溶液的钾离子浓度值，将其除以1%得到待测尿样的钾离子浓度值，结果见下表1。
表1
Figure BDA00001780421100101
实施例2
在本实施例中使用的能够形成G四链体的DNA为TGAGGGTGGGGAGGGTGGGGAA DNA，所使用的菁染料为下式的化合物
Figure BDA00001780421100102
1）制备标准溶液样本和测试溶液
将一定量的DNA溶解于pH值8.2的硼酸-硼砂缓冲液中，制备浓度为200μmol/LDNA母液，备用。
取浓度为600μmol/L菁染料的甲醇溶液300μL，加入19.2ml硼酸-硼砂缓冲液,然后再加入DNA溶液300μL混匀。把上述样本平均分成10份，每份样本溶液为1.98mL。
取其中的6个样本，分别加入一定量的浓度为200mmol/L的KCl溶液，然后用硼酸-硼砂缓冲液定容至2mL，得到钾离子的浓度分别为0、0.05、0.1、0.25、0.5、0.8mmol/L的标准溶液样本。
另外4个样本中加入待测尿液样本20μL，得到4个测试溶液，尿液样本占测试溶液的1%。
2）检测分析
将上述样品分别利用紫外吸收光谱仪进行分析。一切操作都在室温环境下进行，不需额外条件。紫外吸收光谱收集的波长在400～800nm处的数据。
3）结果分析
以标准样本在580nm处的吸光度与530nm处吸光度的比值（A1/A2）为纵坐标，以标准样本的钾离子浓度为横坐标做图，得到钾离子浓度的标准曲线，如图2所示。用测试溶液的580nm处的吸光度与530nm处吸光度的比值可以在标准曲线上找到对应的测试溶液的钾离子浓度值，将其除以1%得到待测尿样的钾离子浓度值，结果见下表2。
表2
Figure BDA00001780421100111
实施例3
在本实施例中使用的能够形成G四链体的DNA为GGGCCAGGGAGCGGGGCGGAGGGGG，所使用的菁染料为下式的化合物
Figure BDA00001780421100112
1）制备标准溶液样本和测试溶液
将一定量的DNA溶解于pH值7.2的Tris-HCl缓冲液中，制备浓度为600μmol/LDNA母液，备用。
取浓度为1.2mmol/L菁染料的甲醇溶液300μL，加入19.2ml Tris-HCl缓冲液,然后再加入DNA溶液300μL混匀。把上述样本平均分成10份，每份样本溶液为1.98mL。
取其中的6个样本，分别加入一定量的浓度为200mmol/L的KCl溶液，然后用Tris-HCl缓冲液定容至2mL，得到钾离子的浓度分别为0、0.05、0.1、0.25、0.5、0.8mmol/L的标准溶液样本。
另外4个样本中加入待测尿液样本20μL，得到4个测试溶液，尿液样本占测试溶液的1%。
以上样品于阴暗处放置、备用。
2）检测分析
将上述样品分别利用紫外吸收光谱仪进行分析。一切操作都在室温环境下进行，不需额外条件。紫外吸收光谱收集的波长在400～800nm处的数据。
3）结果分析
以标准样本在530nm处的吸光度（A2）为纵坐标，以标准样本的钾离子浓度为横坐标做图，得到钾离子浓度的标准曲线，如图3所示。用测试溶液的530nm处的吸光度在标准曲线上找到对应的测试溶液的钾离子浓度值，将其除以1%得到待测尿样的钾离子浓度值，结果见下表3。
表3
Figure BDA00001780421100121
实施例4
在本实施例中使用的能够形成G四链体的DNA为AGGGTT，所使用的菁染料为下式的化合物
Figure BDA00001780421100122
1）制备标准溶液样本和测试溶液
将一定量的DNA溶解于pH值7.0的Tris-HCl缓冲液中，制备浓度为1.2mmol/LDNA母液，备用。
取浓度为200μmol/L菁染料的甲醇溶液300μL，加入19.2ml Tris-HCl缓冲液,然后再加入DNA溶液300μL混匀。把上述样本平均分成10份，每份样本溶液为1.98mL。
取其中的6个样本，分别加入一定量的浓度为200mmol/L的KCl溶液，然后用Tris-HCl缓冲液定容至2mL，得到钾离子的浓度分别为0、0.05、0.1、0.25、0.5、0.8mmol/L的标准溶液样本。
另外4个样本中加入待测尿液样本20μL，得到4个测试溶液，尿液样本占测试溶液的1%。
以上样品于阴暗处放置、备用。
2）检测分析
将上述样品荧光光谱仪进行分析。一切操作都在室温环境下进行，不需额外条件。荧光光谱激发波长为560nm，波长收集范围为570～720nm。
3）结果分析
以标准样本的在波长580nm处的荧光强度（FI）为横坐标，以标准样本的钾离子浓度为纵坐标做图，得到钾离子浓度的标准曲线，如图4所示。用测试溶液的荧光强度在标准曲线上找到对应的测试溶液的钾离子浓度值，将其除以1%得到待测尿样的钾离子浓度值，结果见下表4。
表4
Figure BDA00001780421100131
实施例5
采用与实施例1相同的步骤对四个血清样品进行检测，区别在于使用的DNA为TTAGGG TTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG，使用的菁染料为下式的化合物：
检测溶液样本和测试溶液在波长590nm处的吸光度，记为A1。
结果如下表5：
表5
Figure BDA00001780421100142
实施例6
采用与实施例2相同的步骤对四个血清样品进行检测，区别在于使用的DNA为AGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG，使用的菁染料为下式的化合物：
Figure BDA00001780421100143
检测溶液样本和测试溶液在波长590nm处和540nm处的吸光度，分别记为A1和A2。
结果如下表6：
表6
Figure BDA00001780421100151
实施例7
采用与实施例3相同的步骤对四个血清样品进行检测，区别在于使用下式的化合物：
Figure BDA00001780421100152
检测溶液样本和测试溶液在波长500nm处的吸光度，记为A2。
结果如下表7：
表7
Figure BDA00001780421100153
实施例8
采用与实施例4相同的步骤对四个血清样品进行检测，区别在于使用下式的化合物：
Figure BDA00001780421100154
检测溶液样本和测试溶液在波长640nm处的荧光强度，记为FI。
结果如下表8：
表8
Figure BDA00001780421100161
实施例9-16在钠离子背景下进行
实施例9
在本实施例中使用的能够形成G-四链体的DNA为AGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG，所使用的菁染料为下式的化合物
Figure BDA00001780421100162
1）配制标准溶液样本和测试溶液
将一定量的DNA样品溶解于含有20mmol/L NaCl的Tris-HCl（Tris-Na）缓冲液（pH6.2）中，制备浓度为500μmol/L的DNA母液，备用。
取浓度为200μmol/L菁染料的甲醇溶液300μL，加入19.38ml Tris-Na缓冲液,然后再加入DNA溶液120μL混匀。把上述样本平均分成10份，每份样本溶液为1.98mL。
取其中的7个样本，分别加入一定量的浓度为200mmol/L KCl的Tris-Na溶液，然后用Tris-Na缓冲液定容至2mL，得到钾离子的浓度分别为0、0.05、0.1、0.2、0.5、1、1.5mmol/L的标准样本溶液。
另外3个样本中加入待测尿液样本20μL，尿液样本占总溶液样本的1%。
以上样品于阴暗处放置、备用。
2）检测分析
将上述样品利用紫外吸收光谱仪进行分析。一切操作都在室温环境下进行，不需额外条件。紫外吸收光谱收集的波长在400～800nm处的数据。
3）结果分析
以标准溶液样本在560nm处的吸光度（记为A1）为横坐标，以标准溶液样本的钾离子浓度为纵坐标作图，得到钾离子浓度的标准曲线，如图5所示。用测试溶液的580nm处的吸光度可以在标准曲线上找到对应的测试溶液的钾离子浓度值，将其除以1%得到待测尿样的钾离子浓度值，结果见下表9。
表9
实施例10
在本实施例中使用的能够形成G-四链体的DNA为AGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG，所使用的菁染料为下式的化合物
Figure BDA00001780421100172
1）配制标准溶液样本和测试溶液
将一定量的DNA溶解于含有200mmol/L NaCl的Tris-HCl（Tris-Na）缓冲液（pH8.2）中，制备浓度为1.5mmol/L的DNA母液，备用。
取浓度为600μmol/L菁染料的甲醇溶液300μL，加入19.38ml Tris-Na缓冲液,然后再加入DNA溶液120μL混匀。把上述样本平均分成10份，每份样本溶液为1.98mL。
取其中的7个样本，分别加入一定量的浓度为200mmol/L KCl的Tris-Na溶液，然后用Tris-Na缓冲液定容至2mL，得到钾离子的浓度分别为0、0.05、0.1、0.2、0.5、1、1.5mmol/L的标准样本溶液。
另外3个样本中加入待测尿液样本20μL，尿液样本占总溶液样本的1%。
以上样品于阴暗处放置、备用。
2）检测分析
将上述样品分别利用紫外吸收光谱仪进行分析。一切操作都在室温环境下进行，不需额外条件。紫外吸收光谱收集的波长在400～800nm处的数据。
3）结果分析
以标准样本在650nm处的吸光度（记为A3）为横坐标，以标准溶液样本的钾离子浓度为纵坐标作图，得到钾离子浓度的标准曲线，如图6所示。用测试溶液的650nm处的吸光度可以在标准曲线上找到对应的测试溶液的钾离子浓度值，将其除以1%得到待测尿样的钾离子浓度值，结果见下表10。
表10
Figure BDA00001780421100181
实施例11
在本实施例中使用的能够形成G四链体的DNA为GGGCCAGGGAGCGGGGCGGAGGGGG，所使用的菁染料为下式的化合物
Figure BDA00001780421100182
1）配制标准溶液样本和测试溶液
将一定量的DNA溶解于含有160mmol/L NaCl的Tris-HCl（Tris-Na）缓冲液（pH7.0）中，制备浓度为500μmol/L的DNA母液，备用。
取浓度为200μmol/L菁染料的甲醇溶液300μL，加入19.38ml Tris-Na缓冲液,然后再加入DNA溶液120μL混匀。把上述样本平均分成10份，每份样本溶液为1.98mL。
取其中的7个样本，分别加入一定量的浓度为200mmol/L KCl的Tris-Na溶液，然后用Tris-Na缓冲液定容至2mL，得到钾离子的浓度分别为0、0.05、0.1、0.2、0.5、1、1.5mmol/L的标准样本溶液。
另外3个样本中加入待测尿液样本20μL，尿液样本占总溶液样本的1%。
以上样品于阴暗处放置、备用。
2）检测分析
将上述样品利用紫外吸收光谱仪进行分析。一切操作都在室温环境下进行，不需额外条件。紫外吸收光谱收集的波长在400～800nm处的数据。
3）结果分析
以标准样本在560nm处的吸光度（A1）与670nm处的吸光度（A3）的比值（A1/A3）为横坐标，以标准溶液样本的钾离子浓度为纵坐标作图，得到钾离子浓度的标准曲线，如图7所示。用测试溶液的560nm处的吸光度与670nm处的吸光度的比值（A1/A3）可以在标准曲线上找到对应的测试溶液的钾离子浓度值，将其除以1%得到待测尿样的钾离子浓度值，结果见下表11。
表11
实施例12
在本实施例中使用的能够形成G-四链体的DNA为GGGCGCGGGAGGAATTGGGCGGG，所使用的菁染料为下式的化合物
1）配制标准溶液样本和测试溶液
将一定量的DNA溶解于含有40mmol/L NaCl的Tris-HCl（Tris-Na）缓冲液中，制备浓度为3mmol/L的DNA母液，备用。
取浓度为1.2mmol/L菁染料的甲醇溶液300μL，加入19.38ml Tris-Na缓冲液,然后再加入DNA溶液120μL混匀。把上述样本平均分成10份，每份样本溶液为1.98mL。
取其中的7个样本，分别加入一定量的浓度为200mmol/L KCl的Tris-Na溶液，然后用Tris-Na缓冲液定容至2mL，得到钾离子的浓度分别为0、0.05、0.1、0.2、0.5、1、1.5mmol/L的标准样本溶液。
另外3个样本中加入待测尿液样本20μL，尿液样本占总溶液样本的1%。
以上样品于阴暗处放置、备用。
2）检测分析
将上述样品用荧光光谱仪进行分析。一切操作都在室温环境下进行，不需额外条件。荧光光谱激发波长为560nm，波长收集范围为570～720nm。
3）结果分析
以标准样本在640nm处的荧光强度（记为FI）为横坐标，以标准溶液样本的钾离子浓度为纵坐标作图，得到钾离子浓度的标准曲线，如图8所示。用测试溶液的640nm处的荧光强度可以在标准曲线上找到对应的测试溶液的钾离子浓度值，将其除以1%得到待测尿样的钾离子浓度值，结果见下表12。
表12
实施例13
采用与实施例9相同的步骤对三个血清样品进行检测，区别在于使用的DNA为GGGCGCGGGAGGAATTGGGCGGG，使用的菁染料为下式的化合物：
Figure BDA00001780421100212
检测溶液样本和测试溶液在波长590nm处的吸光度，记为A1。
结果如下表13：
表13
实施例14
采用与实施例10相同的步骤对三个血清样品进行检测，区别在于使用的DNA为GGGCGCGGGAGGAAGGGGGCGGG，使用的菁染料为下式的化合物：
Figure BDA00001780421100221
检测溶液样本和测试溶液在波长670nm处的吸光度，记为A3。
结果如下表14：
表14
Figure BDA00001780421100222
实施例15
采用与实施例11相同的步骤对三个血清样品进行检测，区别在于使用的DNA为GGGGTTGGGG，使用的菁染料为下式的化合物：
Figure BDA00001780421100223
检测溶液样本和测试溶液在波长580nm和610nm处的吸光度，分别记为A1和A3。
结果如下表15：
表15
Figure BDA00001780421100224
实施例16
采用与实施例12相同的步骤对三个血清样品进行检测，区别在于使用的DNA为TTGGGGTTGGGG，使用的菁染料为下式的化合物：
Figure BDA00001780421100231
检测溶液样本和测试溶液在波长600nm处的荧光强度，记为FI。
结果如下表16：
表16
Figure BDA00001780421100232
本发明的显著特色之一是：基于钾离子调控DNA构像的变化实现检测，钾离子引起DNA构像变化，DNA构像变化又引起菁染料聚集形态的改变，从而使得溶液颜色或吸收、荧光光谱上发生改变。体系成分简单，反应也简单，钾离子是整个反应的“引发剂”，保证了检测的精确度。
本发明的显著特色之二是：体系本身可带有大量的钠离子，这种情况可保证样本中钠离子所能引起的环境的变化忽略不计。
本发明的显著特色之三是：使用菁染料超分子探针，反应灵敏度高，有颜色变化，可实现肉眼观测。
总之，实验证明本发明的测定方法，完全可以通过紫外吸收光谱仪或荧光光谱仪，测定出样本中钾离子的浓度水平，测试灵敏度高，特异性好，精确度好。同时，还可通过溶液颜色的变化，用肉眼判断钾离子浓度水平的高低。此外，本发明提供的钾离子检测试剂盒，稳定性好，长时间存放之后仍然能够准确检测各种类型样品中钾离子的含量。
虽然已经以具体实施例的方式描述了本发明，但是对于本领域技术人员来说明显的是，在不脱离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围的情况下，可以对本发明进行各种变化和修改，这些变化和修改同样包括在本发明的范围内。
Figure IDA00001780422000011
Figure IDA00001780422000031

Claims (10)

1.一种检测液体样品中钾离子浓度的试剂盒，其包括：pH6.2~8.2的缓冲液、可溶性钾盐、能够形成G-四链体的DNA分子和菁染料。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其还包括可溶性钠盐。
3.如权利要求1或2所述的试剂盒，其中所述菁染料为式I的化合物，
式I
其中：R1为C1-C6的烷基、苯基、烷基取代的苯基；R2、R3、R4和R5独立地选自H或C1-C6的烷基，或者R2和R3与它们所连接的碳原子一起形成5元至7元的环结构，或者R4和R5与它们所连接的碳原子一起形成5元至7元的环结构；R6和R7为C1-C6烷基或者磺酸基取代的C1-C6烷基；Y为反离子，根据R6和R7所带电荷的不同而不同，若R6和R7为烷基，则Y为卤素阴离子；若R6和R7只有一个带有磺酸根，则无需Y作为反离子；若R6和R7均带有磺酸根，则Y为三乙胺阳离子；X1，X2独立地选自C、O、S、Se或Te。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其中所述C1-C6的烷基选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊基、异戊基、正己基或异己基。
5.如权利要求3所述的试剂盒，其中R1选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊基、异戊基、正己基、异己基、苯基、甲基苯基或二甲基苯基；R2、R3、R4和R5独立地选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊基、异戊基、正己基或异己基。
6.如权利要求3所述的试剂盒，其中所述5元至7元环结构为含有或不含有N或S原子的饱和或不饱和环结构。
7.如权利要求3所述的试剂盒，其中Y选自氟、氯、溴、碘阴离子或三乙胺阳离子。 
8.权利要求1所述的试剂盒，其中所述缓冲液选自三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液、硼酸-硼砂缓冲液、三乙醇胺缓冲液、咪唑-盐酸缓冲液、双甘氨肽缓冲液或2-氨基-2-甲基-1-丙醇缓冲液。
9.权利要求2所述的试剂盒，其中所述缓冲液选自三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液、硼酸-硼砂缓冲液、三乙醇胺缓冲液、咪唑-盐酸缓冲液、双甘氨肽缓冲液、2-氨基-2-甲基-1-丙醇缓冲液、磷酸钠-磷酸氢钠缓冲液、巴比妥钠-盐酸缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、甘氨酸-氢氧化钠缓冲液、硼砂-氢氧化钠缓冲液或磷酸钠缓冲液。
10.一种检测液体样品中钾离子浓度的系统，所述系统包括如权利要求1至9中任一项所述的试剂盒和紫外可见光吸收光谱仪或分光光度计或荧光光谱仪。 
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