CN105651751A - 基于核酸技术的生物体内生理活性小分子的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开基于核酸技术的生物体内生理活性小分子的检测方法。该方法利用富含鸟嘌呤的核酸片段能够四链体结构，从而与某些生理活性小分子相互作用，进而增强这些生理活性小分子自身某些物理化学性质，从而实现对它们的选择性检测和成像。本发明的生理活性小分子检测及成像方法具有以下优点：1）检测信号与生理活性小分子浓度呈现非常好的线性关系；2）对生理活性小分子具有高度选择性，不受检测环境和检测体系中复杂成分的影响；3）检测操作简便速度快，该方法只需将样品与含有特定核酸的检测溶液相混合，使其作用一段时间后通过合适的检测手段即可得知样品中生理活性小分子的含量，从而实现对生物体内某些生理活性小分子的高通量检测及成像。
Description
技术领域
本发明属于生物分析领域，具体涉及利用核酸的四链体结构高灵敏高选择性检测生物体内生理活性小分子的方法。
背景技术
生物体内一系列的生化反应中无不具有相应的生理活性小分子参与。正是这些具有生理活性的化学物质的调节，生物体才能完成复杂的高级生命活动。例如，血红素(heme)和原卟啉(protoporphyrinIX,PPIX)都是生物体内重要的生理活性小分子。其中血红素是许多含铁蛋白的活性中心而PPIX则是血红素的合成前驱体，这两者参与生物体内的各种生化反应，特别是与氧气传输密切相关的能量代谢反应以及某些炎症反应和免疫失调等。更重要的是，由于肿瘤细胞中合成PPIX的一系列酶的活性被大大增强而合成血红素的酶的活性受到抑制，因此肿瘤细胞中的PPIX相对于正常细胞而言浓度要高得多。这一特殊现象使得PPIX成为肿瘤检测的生物标志物之一。此外，由于PPIX自身极为特殊的光化学性质，因此，它也是肿瘤光动力治疗中的内生型光敏剂。除此之外，其他的各种生理活性小分子如金属离子，神经递质和调质，抗氧化剂等均在信号传导、细胞分裂与分化、免疫调节等一系列生理病理过程中扮演着各自极为重要的角色。因此，实现生物体内生理活性小分子的简便、实时、高灵敏高选择性分析和成像不仅对于从分子水平探索某些生理病理过程、信号传导过程以及某些疾病的发病机制有着极为重要的意义，而且对于治疗相关疾病的药物研究和开发也极具指导和参考价值。传统检测生理活性小分子的方法主要集中在高效液相色谱(Highperformanceliquidchromatography,HPLC)、毛细管电泳(Capillaryelectrophoresis，CE)、质谱(massspectrum)、磁共振成像(Magneticrenascenceimaging,MRI),电子计算机断层扫描(Computedtomography,CT)等。然而这些经典方法在检测生物体内生理活性小分子时存在许多不足之处。首先，这些方法大多需要昂贵而复杂的仪器，需要专业化的仪器操作员进行操作，因此难以实现现场分析。其次，生物样品需要复杂的前处理、预富集和分离等步骤，分析时间长，无法实现生物样品中待测物的快速分析，时间分辨率也较差。此外，生理环境异常复杂，许多生理活性小分子在体内的浓度又很低，许多常规检测手段难以实现其快速测定。
因此，十分需要发展一种新型的检测技术用于生物体内生理活性小分子的高灵敏、高选择性检测及成像。
发明内容
发明目的：本发明针对目前生物体内生理活性小分子检测方法存在的操作复杂、耗时长、时间分辨率较差等现状，通过发展新型核酸技术对相关生理活性小分子进行高选择性、高灵敏性的检测。该技术用于这些生理物质检测具有以下优点：1)该检测方法对待测生理活性小分子有着良好的灵敏度和检测限，完全满足生物体内相关生理活性小分子的检测要求；2)选择性好，生物体内其他物质没有干扰；3)成本低廉，无需特意设计和合成对待测物有选择性响应的荧光探针分子或者其他生物识别单元；4)需样量很小，检测操作简便，分析速度较快，可以实现生理病理过程中生物体内生理活性小分子的动态观测。
技术方案：为了解决上述技术问题，本发明提供了一种核酸技术用于高灵敏高选择性快速检测生物体内相关物质。该方法包含一种可特定条件下形成核酸四链体的富含鸟嘌呤(G碱基)的核酸。该核酸四链体与待测生理活性小分子相互作用之后可以显著增强这些待测物自身的物理化学性质(如紫外-可见吸收，荧光强度、催化反应动力学参数等)，进而通过合理的检测手段将这种特定的相互作用输出为相应的检测信号，从而实现对待测分子的分析和成像。
本发明提供了一种含有核酸的检测溶液，该检测溶液中包括有富含鸟嘌呤的核酸。
该检测溶液包含天然DNA或RNA，以及其磷酸骨架经过修饰的核酸和具有非天然碱基的核酸。
该核酸在一定条件下形成正平行DNA四链体结构。
所述核酸的核苷酸序列为5’-GTGGGTAGGGCGGGTTGG-3’。
一种基于核酸技术的生物体内生理活性小分子的检测方法，包括以下步骤：
1)特定序列核酸制备：利用固相合成技术制备所设计的单链核酸，经分离纯化后得到所述的特定序列的核酸。
2)配制核酸储备液：配制适合pH值及化学组分的缓冲溶液即TE缓冲液待用；取一定量步骤1)中的特定序列的核酸溶于该缓冲液中得到核酸储备液；
3)配制核酸四链体检测液：取一定量核酸储备液，向其中加入一定量的KCl并用缓冲液稀释，经加热退火后得到核酸四链体检测液。
4)生理活性小分子检测：将上述核酸四链体检测液与含有待测生理活性小分子的样品以适当体积比混合后孵育反应，然后通过合理的检测手段得到该生物识别过程中的输出信号并由此计算得到待测生理活性小分子的浓度值。合理的检测手段检测该生物识别过程中所产生的信号能够实现对待测物的分析和成像。
本发明对待测生理活性小分子的定量检测原理：该核酸探针在特定条件下存在下形成特定的核酸四链体结构。该结构可以与某些生理活性小分子相互作用形成的复合物，在此过程中该核酸四链体可以显著增强某些生理活性小分子自身的物理化学性质，从而借助相应的检测手段将该识别过程转化为特定的信号输出，最终实现待测分子的分析和成像。
具体包括以下步骤：
1)DNA制备：利用PCR反应制备所设计的DNA，经凝胶电泳分离，纯化后得到特定序列的DNA片段；
2)配制DNA储备液：配制pH为7.0，含有2.5mMEDTA的50mMTris-HCl缓冲溶液即TE缓冲溶液待用；取一定量DNA溶于该TE缓冲液中，配制浓度为400μM的DNA储备液；
3)配制正平行DNA四链体检测液：取一定量DNA储备液，向其中加入一定量的KCl并用TE缓冲液稀释，最终溶液中含有DNA浓度为20μM，K+浓度为200mM；将该溶液置于90℃下水浴加热10min后缓慢降温至室温，然后避光保存待用；(TE缓冲液：T:Tris-HCl；E:EDTA；50mMTris-HCl(pH7.0),2.5mMEDTA)；
4)生理活性小分子检测：将上述正平行DNA四链体检测液与含有生理活性小分子的样品以1:1的体积比混合后置于37℃环境中避光反应2h，然后检测所得样品中的荧光信号，根据样品中的荧光强度的即可得到生理活性小分子的浓度值。
其中，所述生理活性小分子为原卟啉。
有益效果：本发明的核酸技术所输出的物理信号对待测体系中待测生理活性小分子的含量在一定浓度范围内有着良好的线性关系，从而实现对待测目标的高灵敏检测。该检测体系几乎不受生物体系内其他常见的生理物质干扰，因此对目标待测物的检测有着高度选择性。此外该方法仪器简单、操作简便、成本低廉、需样量少，可以实现生物体内相关生理活性小分子的连续、快速检测及成像，因此具有很高的实际应用价值。
本发明针对目前生物体内生理活性小分子的检测方法存在操作复杂、耗时长、时间分辨率差等现状，通过利用核酸技术实现对相关生理物质的高选择性、高灵敏度的检测。该技术用于生物体内相关生理物质的检测具有以下优点：1)选择性好，检测信号既不受生物体系中其他成分的干扰，也不受生理病理过程中生物环境变化的干扰；2)灵敏度高；3)需样量少，分析速度较快，有效提高生物体内待测物检测的时间分辨率；4)操作简便，可用于临床目标待测物的快速分析和成像。
附图说明
图1DNA/PPIX对PPIX检测的工作曲线；
图2纯PPIX荧光检测的工作曲线；
图3DNA/PPIX对PPIX检测的选择性；(1、人工脑脊液(aCSF)；2、aCSF+500μM葡萄糖；3、aCSF+500μM乳酸；4、aCSF+10μM抗坏血酸(AA)；5、aCSF+10μM5-羟色胺(5-HT)；6、aCSF+10μMUA(尿酸)；7、aCSF+10μMDA(多巴胺)；8、aCSF+10μMDOPAC(3,4-二羟基苯乙酸))；
图4DNA技术用于鼠脑透析液中PPIX的检测；
图5DNA技术用于缺血-再灌注过程中鼠脑内海马区PPIX的动态监测
图6DNA技术用于肿瘤内PPIX的动态监测；
图7DNA技术用于生物体内PPIX检测的原理。
具体实施方式
下面对本发明技术方案进行详细说明，但是本发明的保护范围不局限于所述实施例。
以单链DNA(ProbeG)为所述核酸的例子，其序列为5’-GTGGGTAGGGCGGGTTGG-3’(由南京金斯瑞生物技术有限公司合成)。
以原卟啉(PPIX)为所述生理活性小分子的例子。
实施例1DNA技术在PPIX检测中的应用
1)DNA制备：
利用PCR反应制备所设计的DNA，经凝胶电泳分离，纯化后得到特定序列的ProbeG。
2)配制DNA储备液：
配制pH为7.0，含有2.5mMEDTA的50mMTris-HCl缓冲溶液(TE缓冲液)待用；取一定量DNA溶于该TE缓冲液中，配制浓度为400μM的DNA储备液。
3)配制正平行DNA四链体检测液：取一定量DNA储备液，向其中加入一定量的KCl并用TE缓冲液稀释，最终溶液中含有DNA浓度为20μM，K+浓度为200mM。将该溶液置于90℃下水浴加热10min后缓慢降温至室温，然后避光保存待用。
4)PPIX检测：将上述检测液含有PPIX的样品以1:1的体积比混合后置于37℃环境中避光反应2h，然后检测所得样品中的荧光信号。根据样品中的荧光强度，带入相应的工作曲线，即可得到PPIX的浓度值。
由图1可见，在所得到的正平行DNA四链体溶液中加入PPIX之后，所得到的DNA/PPIX复合物的荧光强度与所加入的PPIX浓度在一定浓度范围内呈现出非常好的线性关系，线性相关系数达到了0.991，线性范围为10nM–10μM，其最低检测限为0.5nM。该线性范围完全覆盖了生物体内PPIX的浓度范围，故可以用于生物体内PPIX的测定。如图2所示，如果直接检测水溶液中PPIX的荧光，不仅灵敏度低而且检出限高(100nm)，难以满足生物体内PPIX的检测需求。
实施例2DNA技术对PPIX的高选择性检测
该方法对PPIX表现出很好的选择性。如图2所示，生物体内常见的生理活性小分子对该PPIX检测体系几乎没有干扰，说明该DNA技术可用于生物体内PPIX的高选择性检测。
实施例3DNA技术对生物体内PPIX的高选择性检测
取10μL正平行DNA溶液，分别与10μL的人工脑脊液，鼠脑透析液以及500nMPPIX标准溶液混合后避光静止2h。之后将样品取出，检测其荧光强度。从图6中可以看出空白的人工脑脊液中没有任何荧光信号，加入鼠脑透析液之后可以检测出明显的荧光信号，该荧光信号与PPIX的标准样品相同，证明鼠脑透析液中存在PPIX，其浓度可以由工作曲线计算得到，经测定大鼠大脑海马区的PPIX浓度约为161.8±101.7nM(n＝4)。
实施例4DNA技术对生理/病理过程中活动物体内PPIX的高选择性检测
参照实施例3，检测生理/病理过程中活动物体内PPIX的动态变化。图5所示为缺血-再灌注过程中大鼠脑内PPIX浓度的动态变化。我们发现发生全脑缺血后，大鼠脑内海马区的PPIX浓度显著下降且在再灌注过程中也没有恢复至基础值。图6所示为在移植有肿瘤的小鼠体内注射5-氨基酮戊酸后肿瘤内PPIX的动态变化。我们发现，肿瘤组织中的PPIX浓度明显高于正常组织。小鼠腹腔注射5-氨基酮戊酸后其肿瘤内的PPIX浓度发生显著的上升，大约在8小时的时候升至最高值，随后开始缓慢下降。而正常组的小鼠体内注射5-氨基酮戊酸后PPIX基本没有变化，证明我们的方法可以用于光动力治疗过程中肿瘤内PPIX的动态监测。
Claims (7)
1.一种含有核酸的检测溶液，其特征在于，该检测溶液中包括有富含鸟嘌呤的核酸。
2.根据权利要求1所述的含有核酸的检测溶液，其特征在于，该检测溶液包含天然DNA或RNA，以及其磷酸骨架经过修饰的核酸和具有非天然碱基的核酸。
3.根据权利要求1所述的含有核酸的检测溶液，其特征在于，该核酸在一定条件下形成正平行DNA四链体结构。
4.根据权利要求1所述的含有核酸的检测溶液，其特征在于，所述核酸的核苷酸序列为5’-GTGGGTAGGGCGGGTTGG-3’。
5.一种基于核酸技术的生物体内生理活性小分子的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）特定序列核酸制备：利用固相合成技术制备所设计的单链核酸，经分离纯化后得到权利要求1所述的特定序列的核酸；
2）配制核酸储备液：配制适合pH值及化学组分的缓冲溶液即TE缓冲液待用；取一定量核酸溶于该缓冲液中得到核酸储备液；
3）配制核酸四链体检测液：取一定量核酸储备液，向其中加入一定量的KCl并用缓冲液稀释，经加热退火后得到核酸四链体检测液；
4）生理活性小分子检测：将步骤3）中的核酸四链体检测液与含有待测生理活性小分子的样品以适当体积比混合后孵育反应，然后通过合理的检测手段得到该生物识别过程中的输出信号并由此计算得到待测生理活性小分子的浓度值。
6.根据权利要求5所述的一种基于核酸技术的生物体内生理活性小分子的检测方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
1）DNA制备：利用PCR反应制备所设计的DNA，经凝胶电泳分离，纯化后得到特定序列的DNA片段；
2）配制DNA储备液：配制pH为7.0，含有2.5mMEDTA的50mMTris-HCl缓冲溶液即TE缓冲溶液待用；取一定量步骤1）中的DNA片段溶于该TE缓冲液中，配制浓度为400μM的DNA储备液；
3）配制正平行DNA四链体检测液：取一定量DNA储备液，向其中加入一定量的KCl并用TE缓冲液稀释，最终溶液中含有DNA浓度为20μM，K+浓度为200mM；将该溶液置于90℃下水浴加热10min后缓慢降温至室温，然后避光保存待用；
4）生理活性小分子检测：将步骤3）中的正平行DNA四链体检测液与含有生理活性小分子的样品以1:1的体积比混合后置于37oC环境中避光反应2h，然后检测所得样品中的荧光信号，根据样品中的荧光强度的即可得到生理活性小分子的浓度值。
7.根据权利要求6所述的一种基于核酸技术的生物体内生理活性小分子的检测方法，其特征在于，所述生理活性小分子为原卟啉。
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