CN106872427A - 一种碳量子点靶向检测溶酶体中h2s的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种碳量子点靶向检测溶酶体中H2S的方法,属于生物传感器及离子识别领域。本发明合成的碳量子点CD‑dopa‑morph荧光探针与H2S由于光诱导电子转移在575nm处的荧光强度会明显增强。本发明的碳量子点荧光探针对H2S检测最低限度达到70nM。本发明的碳量子点荧光探针合成方法简单、生物相容性好、细胞毒性小、检测灵敏度高、检测迅速且信号稳定,为实现临床检测细胞溶酶体中的H2S提供了可能。
Description
技术领域
本发明涉及一种碳量子点靶向检测溶酶体中H2S的方法,属于生物传感器及离子识别领域。
背景技术
近年来,发现硫化氢(H2S)广泛存在于包括人类在内的哺乳动物体内,尤其是细胞的溶酶体,而且起着非常重要的生物学作用。硫化氢已经被认为是继一氧化氮(NO)和一氧化碳(CO)之后的第三种气体信号分子,具有多种生理功能,包括调制血压,缓解缺血性再灌注损伤,发挥抗炎作用,降低代谢率等。硫化氢水平的改变与多种疾病相关,如唐氏综合征、阿尔茨海默病等。
硫化氢的检测技术有很多如:极谱技术、电极技术、色谱技术等,上述方法虽然可以用于硫化氢检测,但是存在很大局限性,且无法用于体内检测。为了深入研究硫化氢在体内的生理学作用,迫切需要开发应用于体内、实时、快速、选择性的检测硫化氢的技术。为了解决上述问题,开发了荧光检测技术,这种检测技术具有高灵敏度、无损探伤,已经用在了硫化氢的检测中,并且已经合成几种靶向检测溶酶体中硫化氢的探针。然而,目前检测硫化氢的探针都是有机小分子荧光探针,存在光稳定性差、合成步骤复杂、水溶性差等问题。
碳量子点作为一种新型的荧光碳纳米材料,这些年引起广泛关注,主要是由于光稳定性好、生物相容性好、水溶性好、表面易修饰等优点,这也证明了碳量子点在生物领域有很大的应用前景。最近,Liu et al.发表了一篇采用碳量子点检测环境中H2S的文章,但是目前还没有碳量子点检测人体内H2S的文章,而且H2S主要存在于细胞的溶酶体中。因此,开发一种选择性好、灵敏度高、检测迅速且具有靶向检测溶酶体内H2S的方法,将对H2S的研究发展具有至关重要的作用。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有荧光探针生物相容性差、细胞毒性大的问题,提供一种碳量子点靶向检测溶酶体中H2S的方法,该方法创造性的提出生物相容性好、细胞毒性小的碳量子点作荧光探针用于细胞溶酶体内硫化氢的检测,为实现临床检测细胞溶酶体中的H2S提供了可能。
本发明的目的是通过下述技术方案实现的。
一种碳量子点靶向检测溶酶体中H2S的方法,具体步骤如下:
步骤一、用pH=5.0的甘氨酸缓冲液,将碳量子点CD-dopa-morph配置成已知浓度的碳量子点分散液。
步骤二、将上述分散液转移到石英比色皿中,配置500μM浓度的NaHS储备液,每次加入储备液并进行荧光强度测试,保证每次加入后能够形成0.1μM、0.2μM、0.3μM、0.4μM、0.5μM、0.6μM、0.7μM、1μM、2μM、3μM、4μM的浓度梯度,所述加入的储备液总体积不大于石英比色皿中分散液总体积的5%。
步骤三、根据步骤二中不同浓度的H2S对探针荧光发射光谱影响,确定荧光发射光谱575nm处荧光强度与H2S浓度的对应关系,在H2S含量为0-0.7μM区间内,拟合出一条定量检测H2S的标准方程y=a+bx,其中y为所测的含H2S的探针在最大发射峰575nm位置处对应的荧光强度,x为样品中含有的H2S的含量(单位:μM)a=-0.06046,b=1.34316。
步骤四、将含有H2S的待测液样品加入到已知碳量子点CD-dopa-morph探针浓度的pH=5.0的甘氨酸缓冲液中,测定荧光光谱,将所测得样品在575nm位置处对应的荧光强度数值带入步骤三中所得的H2S定量标准方程中,可以定量确定样品中H2S的含量。
步骤一所述的碳量子点CD-dopa-morph的合成方法为:
在容器中加入体积比为3:1的甲醇和二氯甲烷混合液,用氮气鼓泡2h,除去溶剂中的氧气。向其中加入碳量子点CD-dopa-morph,dopa-quione-ITC和morph-ITC,三者的质量比为1:1:1,并搅拌黑暗条件下反应24h,然后将粗产物溶剂旋蒸掉。将粗产物通过硅胶柱色谱法,利用体积比为50:1的二氯甲烷和甲醇作为洗脱液进一步提纯,得到黄绿色产物,再减压浓缩、减压真空干燥最终得到产物黄色粉末CDs-dopa-morph产率50%左右。
反应式如下所示:
碳量子点CD-dopa-morph化学结构式:
有益效果
1.本发明的一种碳量子点靶向检测溶酶体中H2S的方法,可以靶向检测溶酶体中的H2S。
2.本发明的一种碳量子点靶向检测溶酶体中H2S的方法,是通过探针CD-dopa-morph和H2S间的光诱导电子转移,在575nm处的荧光强度明显增强,检测最低限度达到70nM。该探针生物相容性好、细胞毒性小、检测灵敏度高、检测迅速且信号稳定,为实现临床检测细胞线粒体中的H2S提供了可能。
3.本发明的一种碳量子点靶向检测溶酶体中H2S的方法,以邻苯二胺为原料,通过一步合成碳量子点C-dots,并在其表面修饰dopa-quione-ITC和morph-ITC,合成具有靶向检测溶酶体H2S的探针,原料便宜,反应条件温和,后处理简单,产物产率较高。
附图说明
图1是本发明中CDs-dopa-morph和C-dots的红外光谱图;
图2是本发明中探针CDs-dopa-morph的TEM图;
图3是本发明中探针CDs-dopa-morph的细胞毒性图;
图4是本发明中探针CDs-dopa-morph的细胞靶向性图;
图5是本发明中探针CDs-dopa-morph对H2S选择性荧光光谱图;
图6是本发明中探针CDs-dopa-morph随H2S浓度增加的荧光光谱图;
图7是本发明中探针CDs-dopa-morph在575nm处荧光强度与H2S浓度的关系图;
图8是本发明中探针CDs-dopa-morph与H2S在0-0.7μM线性范围内的拟合曲线;
具体实施方式
下面结合实施例与附图对本发明做进一步说明。
实施例1
碳量子点C-dots的制备方法
称取0.9g邻苯二胺,加入到90mL的乙醇中搅拌至完全溶解,然后将上述溶液快速转至聚四氟乙烯内衬的高压反应釜中,然后放置烘箱180℃反应12h,自然冷却至室温,取出。将反应后的混合溶液减压浓缩,得到黑色粉末的粗产物。粗产物通过硅胶柱色谱法,利用体积比为50:1的二氯甲烷和甲醇作为洗脱液,获得黄绿色产物,通过减压旋蒸、减压真空干燥最终得到黄色粉末为C-dots。
碳量子点CD-dopa-morph荧光探针的制备方法
在容器中加入30mL的甲醇,10mL的二氯甲烷,用氮气鼓泡2h,除去溶剂中的氧气。然后用注射器取除氧的甲醇去分别溶解碳量子点(C-dots 16mg),多巴醌异硫氰酸酯(dopa-quione-ITC 16mg),三乙胺80μL,然后用注射器加入装有甲醇的容器中,用注射器取5mL除氧的二氯甲烷去溶解吗啉异硫氰酸酯(morph-ITC 16mg),并搅拌,黑暗条件下反应24h,然后将粗产物溶剂旋蒸掉。将粗产物通过硅胶柱色谱法,利用体积比为50:1的二氯甲烷和甲醇作为洗脱液进一步提纯,得到黄绿色产物,再减压浓缩、减压真空干燥最终得到产物黄色粉末CDs-dopa-morph产率50%左右。此外,对探针CDs-dopa-morph进行相关表征红外光谱(图1)、TEM(图2)、细胞毒性测试(图3)、细胞靶向性实验(图4)。探针CDs-dopa-morph的红外光谱中,1600cm-1为醌羰基C=O伸缩振动峰,在1268cm-1出现的峰为C=S的伸缩振动特征峰,1025cm-1出现的峰为C-O-C的伸缩振动特征峰,可见dopa-quione-ITC,morph-ITC已经修饰到碳量子点C-dots上,探针CDs-dopa-morph已经合成。图2中可以看到探针的粒径为5-7nm。通过表征CDs-dopa-morph已经成功合成,并且具有较低的细胞毒性和溶酶体靶向性。
实施例2、H2S的选择性实验
将碳量子点CDs-dopa-morph加入到pH=5.0的甘氨酸缓冲液中配置成已知浓度溶液,分别向其中加入不同干扰物质配成的储备液,并测试荧光强度。干扰物质包含:K+、Fe3+、Zn2+、Mg2+、Na2SO3、NaHSO3、NO2 -、NO3 -、AA、GSH所有物质浓度200μM,H2S的浓度为10μM。从荧光光谱中可以明显的看到,只有含H2S的样品溶液在575nm处对探针有很强的荧光增强,表现出对H2S的高效选择性(如图5所示),而含有其他常见离子、氨基酸等样品表现出非常弱的荧光变化。由此,可以判断出本发明所制备的CDs-dopa-morph荧光探针对H2S有很好的选择性。
实施例3、传感器溶液的配制
将碳量子点CDs-dopa-morph加入到pH=5.0的甘氨酸缓冲液中配置成已知浓度溶液。用配置后的溶液可以用于H2S的定性和定量检测,如图6-图8所示。从图8的定量分析数据可以得到本发明中碳量子点CDs-dopa-morph用于H2S定量检测的标准方程。
下面结合实例进一步描述本发明对H2S的定量识别检测。
实施例4
为验证不同碳量子点浓度下本发明H2S的检测方法的准确性和可靠性,配置浓度为0.2μg/mL的CDs-dopa-morph的探针溶液,采用人工为配制含H2S的五组试样,其H2S的含量分别为0.1μM,0.2μM,0.3μM,0.5μM,0.7μM。在充分搅拌均匀后采集荧光光谱,采用本发明检测方法对上述试样的H2S含量进行检测,其检测结果如下表所示。
表一:试样使用浓度为0.2μg/mL的CDs-dopa-morph对H2S的
定量识别检测
试样 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
理论含量 | |||||
检测含量 |
由表一所示的结果可知,采用浓度0.2μg/mL的CDs-dopa-morph探针,本发明方法对H2S含量的实际检测值与制作试样时加入的含量值,即理论含量基本相同,具有较小的误差范围。
实施例5
为采用与具体实例3基本相同的检测条件,配置浓度为1μg/mL的CDs-dopa-morph的探针溶液,采用本发明检测方法对上述试样的H2S含量进行检测,其检测结果如下表所示。
表二:试样使用浓度为1μg/mL的CDs-dopa-morph对H2S的定
量识别检测
由表二所示的结果可知,采用浓度为1μg/mL的CDs-dopa-morp探针,本发明方法对H2S含量的实际检测值与制作试样时加入的含量值,即理论含量基本相同,具有较小的误差范围。
实施例6
为采用与具体实例3基本相同的检测条件,配置浓度为5μg/mL的CDs-dopa-morph的探针溶液,采用本发明检测方法对上述试样的H2S含量进行检测,其检测结果如下表所示。
表三:试样使用浓度为5μg/mL的CDs-dopa-morph对H2S的定
量识别检测
试样 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
理论含量 | |||||
检测含量 |
由表三所示的结果可知,采用浓度为5μg/mL的CDs-dopa-morph探针,本发明方法对H2S含量的实际检测值与制作试样时加入的含量值,即理论含量基本相同,具有较小的误差范围。
由表一至表三所示的结果可知,尽管使用了不同浓度的探针CDs-dopa-morph,采用本发明对H2S含量的检测方法,当探针CDs-dopa-morph浓度0.2-5μg/mL都可以得到较为准确的检测结果,并且具有较小的误差。
综合试验数据表明,本发明使用碳量子点CDs-dopa-morph对H2S进行定量检测方法的有益效果是采用成本较低的设备对线粒体中的H2S含量进行检测,测量速度快,操作简单、方便,测量结果准确、可靠、重复性好。
Claims (3)
1.一种碳量子点靶向检测溶酶体中H2S的方法,其特征在于:具体步骤如下:
步骤一、用pH=5.0的甘氨酸缓冲液,将碳量子点CD-dopa-morph配置成已知浓度的碳量子点分散液。
步骤二、将上述分散液转移到石英比色皿中,配置500μM浓度的NaHS储备液,每次加入储备液并进行荧光强度测试,保证每次加入后能够形成0.1μM、0.2μM、0.3μM、0.4μM、0.5μM、0.6μM、0.7μM、1μM、2μM、3μM、4μM的浓度梯度,所述加入的储备液总体积不大于石英比色皿中分散液总体积的5%。
步骤三、根据步骤二中不同浓度的H2S对探针荧光发射光谱影响,确定荧光发射光谱575nm处荧光强度与H2S浓度的对应关系,在H2S含量为0-0.7μM区间内,拟合出一条定量检测H2S的标准方程y=a+bx,其中y为所测的含H2S的探针在最大发射峰575nm位置处对应的荧光强度,x为样品中含有的H2S的含量(单位:μM)a=-0.06046,b=1.34316。
步骤四、将含有H2S的待测液样品加入到已知碳量子点CD-dopa-morph探针浓度的pH=5.0的甘氨酸缓冲液中,测定荧光光谱,将所测得样品在575nm位置处对应的荧光强度数值带入步骤三中所得的H2S定量标准方程中,可以定量确定样品中H2S的含量。
2.如权利要求1所述的一种碳量子点靶向检测溶酶体中H2S的方法,其特征在于:步骤一所述的碳量子点CD-dopa-morph的合成方法为:
在容器中加入甲醇和二氯甲烷混合液(v:v,3:1),用氮气鼓泡2h,除去溶剂中的氧气。加入碳量子点CD-dopa-morph,dopa-quione-ITC和morph-ITC,三者的质量比为1:1:1,搅拌,黑暗条件下反应24h,然后将粗产物溶剂旋蒸掉。将粗产物通过硅胶柱色谱法,利用二氯甲烷和甲醇作为洗脱液(v:v,50:1)进一步提纯,得到黄绿色产物,再减压浓缩、减压真空干燥最终得到产物黄色粉末CDs-dopa-morph产率50%左右。
3.如权利要求1或2所述的一种碳量子点靶向检测溶酶体中H2S的方法,其特征在于:所述碳量子点CDs-dopa-morph的化学结构式如下:
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