CN107056774A

CN107056774A - 一种次氯酸荧光探针及其制备方法和应用

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Publication number: CN107056774A
Application number: CN201710219195.2A
Authority: CN
Inventors: 林伟英; 任明光; 邓贝贝
Original assignee: University of Jinan
Current assignee: University of Jinan
Priority date: 2017-04-06
Filing date: 2017-04-06
Publication date: 2017-08-18
Anticipated expiration: 2037-04-06
Also published as: CN107056774B

Abstract

本发明通过分子结构设计，提供一种具有响应速度快，选择性好，灵敏度高的次氯酸荧光探针及其制备方法和该次氯酸荧光探针在检测水溶液及细胞内次氯酸中的应用。所述荧光探针可应用于水溶液或生物体系中次氯酸的检测；所述检测包含荧光检测、细胞成像和和目视比色。在一定浓度范围内，荧光强度与次氯酸浓度呈线性正相关，实现定量测定次氯酸的浓度。本发明的次氯酸探针合成简单，后处理过程相对简单；实现了次氯酸分子探针的选择性快速检测，并且选择性好，抗其他分子干扰能力强，是一种简单，快速，灵敏的次氯酸分子特异性检测试剂，在生物分子检测领域具有广阔的应用前景。

Description

一种次氯酸荧光探针及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种快速检测次氯酸的荧光探针及其制备和在检测细胞中次氯酸的应用，属于分析化学技术领域。

背景技术

次氯酸（HClO）属于活性氧的一种，作为一种高效的杀菌剂，在生命的免疫系统中起到重要的作用。细胞内源性的次氯酸主要由白细胞（如单核细胞，嗜酸性细胞，嗜中性粒细胞等）中的髓过氧化物酶系统产生。细胞免疫反应产生可产生次氯酸，但是一旦细胞中次氯酸的浓度发生异常，就会引起包括风湿性关节炎、心血管疾病和癌症在内的多种疾病。在细胞内溶酶体作为一类较为重要的细胞器，次氯酸可以维持溶酶体的氧化-还原的平衡，对溶酶体的功能的稳定起到了十分重要的作用，检测溶酶体内次氯酸对判断机体状态具有重要意义。

可用于选择性检测次氯酸/次氯酸盐的方法有很多，如碘量滴定法、比色法、化学发光法、库仑法、极谱法和辐解法等。然而，这些方法往往比较繁琐，一些工作必须在有机介质或有机/水介质中进行，限制其应用。与传统检测方法相比，荧光探针被认为是生物研究理想的手段，因为荧光检测所需的仪器相对简单，选择性和灵敏度高，检测范围广，响应时间快速，而且检测过程对样品没有破坏，对细胞危害也很小，荧光检测结合显微镜可以提供实时检测。HClO在生物细胞中，其浓度变化较快，所以检测次氯酸的荧光探针需要一定的响应速度,以达到对生物体系次氯酸进行实时检测的目的。生物体内存在大量的不同类型的氧化剂（如，超氧自由基，羟基自由基，过氧化氢，单线态氧等），在其他干扰离子或分子存在的条件下，专一性的对体内次氯酸进行识别，需要探针分子具有较好的抗干扰性。然而目前现有的次氯酸探针在生物体内的选择专一性差、反应时间长。

发明内容

针对目前次氯酸分子荧光探针在生物体内的选择专一性差、反应时间长的现状，本发明通过分子结构设计，提供一种具有响应速度快，选择性好，灵敏度高的次氯酸荧光探针。

本发明另一目的是提供一种过程简单的该次氯酸探针的制备方法。

本发明再一目的是提供该次氯酸荧光探针在检测水溶液及细胞内次氯酸中的应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。

一种次氯酸荧光探针，具有如下式（Ⅰ）所示的结构：

式（I）。

所述次氯酸荧光探针，简称为PZ-HClO，合成路线如下：

。

所述次氯酸荧光探针的制备方法，包括以下步骤：

（1）邻羟基苯乙酮溶于乙酸乙酯中，将金属钠缓慢加入上述反应液中，反应得产物，产物萃取、干燥、脱溶，通过柱色谱分离得到化合物1-1；

（2）化合物1-1溶于乙酸中，加入硫酸，反应回流得产物，产物萃取、干燥、脱溶，通过柱色谱分离得到化合物1-2；

（3）化合物1-2和丙二腈溶于乙酸酐中，加热回流反应得产物，产物萃取、干燥、脱溶，过柱色谱分离得到化合物1-3；

（4）吩噻嗪溶于DMF中，0℃下加入氢化钠，反应到室温时加入碘乙烷，继续反应得产物，产物萃取、干燥、脱溶，通过柱色谱进行分离纯化得到化合物2-1；

（5）三氯氧磷与DMF在室温下搅拌，得反应液，将化合物2-1溶于1,2-二氯乙烷，加入上述反应液中，反应得产物，产物萃取、干燥、脱溶，通过柱色谱分离得到化合物2-2；

（6）化合物2-2与化合物1-3溶于甲苯中，并向其中加入哌啶，回流反应得产物，产物萃取、干燥、脱溶，通过柱色谱分离得到化合物PZ-HClO。

上述次氯酸荧光探针的制备方法中，邻羟基苯乙酮与乙酸乙酯摩尔比为1:10；化合物1-2和丙二腈的摩尔比为5:6；吩噻嗪与碘乙烷的摩尔比为2:3；化合物2-2与化合物1-3的摩尔比为1:1。

上述次氯酸荧光探针的制备方法中，步骤（2）反应温度为100℃，步骤（3）反应温度为140℃，步骤（6）反应温度为110℃。

上述次氯酸荧光探针的制备方法中，各中间产物柱层析的硅胶颗粒大小为200-300目；步骤（1）中洗脱剂配比为乙酸乙酯/石油醚=1:6；步骤（2）中洗脱剂配比为乙酸乙酯/石油醚=1:5；步骤（3）中洗脱剂配比为乙酸乙酯/石油醚=1:4；步骤（4）中洗脱剂配比为二氯甲烷/石油醚=1:2；步骤（5）中洗脱剂配比为二氯甲烷/石油醚=1:1；步骤（6）中洗脱剂配比为二氯甲烷/石油醚=1:1。

所述荧光探针可应用于水溶液或生物体系中次氯酸的检测；所述检测包含荧光检测、细胞成像和和目视比色。

所述次氯酸荧光探针应用于检测次氯酸时，荧光荧光探针本身无荧光或荧光很弱，与次氯酸反应后生成具有式（II）的化合物，使荧光发生改变，用于定性检测次氯酸；次氯酸荧光探针与次氯酸溶液反应后生成具有式（II）的化合物，在可见光区发生颜色改变，目视比色，用于定性检测次氯酸。

所述次氯酸荧光探针应用于检测次氯酸溶液时，以波长450nm光进行激发，随着次氯酸含量的逐渐增加，其在605nm处的荧光峰值逐渐增强；检测细胞中次氯酸时，激发波长为561nm，发射光检测范围为570-620 nm。在一定浓度范围内，荧光强度与次氯酸浓度呈线性正相关，从而实现定量测定次氯酸的浓度。

本发明具有以下优点：探针的合成简单，后处理过程相对简单；实现了次氯酸分子探针的选择性快速检测，并且选择性好，抗其他分子干扰能力强。此外，用肉眼就可以观察到溶液颜色的变化，伴随着紫外灯下同样可以观察到荧光颜色变化，是一种具有生色传感功能的荧光探针。基于其特异性且显著的颜色变化，该试剂可作为显示水溶液中和生物细胞内次氯酸分子存在的专一性指示剂，可进行实时定性及定量的目视比色法检测。故而，本发明是一种简单，快速，灵敏的次氯酸分子特异性检测试剂，在生物分子检测领域具有广阔的应用前景。

附图说明

图1是实施例一中探针PZ-HClO的¹H NMR图谱；

图2是探针PZ-HClO随次氯酸钠浓度变化荧光谱图的变化情况；

图3是探针PZ-HClO荧光强度与次氯酸钠浓度的关系图；

图4是探针PZ-HClO对不同离子和分子的选择性荧光谱图；

图5是探针PZ-HClO对不同离子和分子的选择性柱状图数据；

图6是探针PZ-HClO溶液在次氯酸钠加入前后溶液颜色的变化；

图7是探针PZ-HClO应用与细胞中对外源性HClO进行荧光成像。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制，实施例中化合物的号码对应上述方案中化合物。

实施例1 荧光探针PZ-HClO的合成。

（1）将邻羟基苯乙酮（10.0 g，13.5 mmol）溶于200 mL乙酸乙酯中，在搅拌的情况下缓慢加入钠（8.0 g，340 mmol）。室温反应4小时，用TCL板检测反应，反应完全后，减压过滤，得到的固体溶于100 mL水中，用盐酸中和至pH为中性。乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，减压旋干溶剂得粗产品，并用硅胶柱进行分离，硅胶颗粒大小为200-300目，洗脱剂配比为乙酸乙酯/石油醚=1:6，产率为80%。

（2）化合物1（6.95 g，38.9 mmol）溶于70 mL乙酸中，将硫酸（4.6 mL）缓慢加入到上述溶液中，120℃加热反应1 h。用TCL板检测反应，反应完全后，将反应液冷却至室温，倒入50 mL冰水中，用碳酸钠中和是pH值为中性，用二氯甲烷萃取，无水硫酸钠干燥。减压旋干溶剂得粗产品，并用硅胶柱进行分离，硅胶颗粒大小为200-300目，洗脱剂配比为乙酸乙酯/石油醚=1:5，产率为60%。

（3）化合物1-2（4.78 g，30 mmol）与丙二腈（2.4 g，36.2 mmol）溶于25 mL乙酸酐中，140℃加热回流，反应14 h。用TCL板检测反应，反应完全后，将反应液冷却至室温，减压旋干溶剂，加入80 mL去离子水，100℃加热回流30min。用二氯甲烷萃取，无水硫酸钠干燥。减压旋干溶剂得粗产品，并用硅胶柱进行分离，硅胶颗粒大小为200-300目，洗脱剂配比为乙酸乙酯/石油醚=1:4，产率为55%。

（4）吩噻嗪（201 mg，1 mmol）溶于2 mLDMF中，0℃下缓慢加入氢化钠（36 mg，1.5mmol）反应到室温时，向其中加入碘乙烷（234 mg，1.5 mmol）反应14 h。用TCL板检测反应，反应完全后，将反应液冷却至室温，减压过滤，得粗产品并用硅胶柱进行分离，硅胶颗粒大小为200-300目，洗脱剂配比为二氯甲烷/石油醚=1:2。产率为85%。

（5）将1 mL DMF加入到反应瓶中，在0℃下，缓慢滴加1 mLPOCl₃，滴加完毕后，室温反应30min。然后将化合物2-1（227 mg，1mmol）溶于1 mL 1,2-二氯乙烷中，加入到上述反应液中。100℃加热回流，反应16 h。用TCL板检测反应，反应完全后，将反应液冷却至室温，用二氯甲烷萃取，无水硫酸钠干燥。减压旋干溶剂得粗产品，并用硅胶柱进行分离，硅胶颗粒大小为200-300目，洗脱剂配比为二氯甲烷/石油醚=1:1，产率为65%。

（6）将化合物2-2（80 mg，0.389 mmol）与化合物1-3（110 g，0.428 mmol）溶于10mL甲苯中中，常温下依次加入哌啶0.3 mL，乙酸0.3 mL，反应30min。然后110℃加热回流，反应17 h。用TCL板检测反应，反应完全后，将反应液冷却至室温，减压旋干溶剂，加入80 mL去离子水，100℃加热回流30min。用二氯甲烷萃取，无水硫酸钠干燥。减压旋干溶剂得粗产品，并用硅胶柱进行分离，硅胶颗粒大小为200-300目，洗脱剂配比为二氯甲烷/石油醚=1:1，产率为89%。¹HNMR (400 MHz, Chloroform-d) δ 8.94 (dd, J = 8.4, 1.2 Hz, 1H), 7.82– 7.71 (m, 1H), 7.60 – 7.50 (m, 2H), 7.50 – 7.43 (m, 1H), 7.39 (dd, J = 8.5,1.9 Hz, 1H), 7.34 (d, J = 1.9 Hz, 1H), 7.22 – 7.12 (m, 2H), 6.95 (dt, J =18.7, 7.9 Hz, 3H), 6.86 (s, 1H), 6.68 (d, J = 15.8 Hz, 1H), 3.99 (q, J = 6.9Hz, 2H), 1.48 (t, J = 7.0 Hz, 3H)。

实施例2 荧光探针PZ-HClO荧光强度随HClO浓度的变化。

取实施例1制备的PZ-HClO次氯酸荧光探针溶于N,N-二甲基甲酰胺（DMF）中，制成1mmol/L 储备液。从储备液中取出30uL 加入到5mL 的离心管当中，用0.1mol/L，pH=7.5磷酸盐缓冲溶液（PBS）与乙醇体积比为1:1的溶液稀释至3 mL，加入不同浓度（0-25 μM）的NaClO标准溶液（NaClO 在中性条件下水溶液中即自发产生酸碱平衡移动而产生HClO，下同），用450 nm为激发波长测量其荧光谱图，荧光光谱如图2 所示。以NaClO浓度为横坐标，以为荧光强度为纵坐标作图，得图3，随着NaClO浓度浓度增加，荧光强度显著增加。由图中数据可知，在0-25 μM浓度范围内，荧光强度与NaClO浓度呈线性正相关。

实施例3 荧光探针PZ-HClO对不同分子或离子的选择性。

从实施例2中荧光探针储备液中取出30 μL加入到5 mL的离心管当中，分别加入等摩尔量的硫氢根离子（HS^-），硫离子（S^2-），亚硫酸根离子（SO₃ ^2-），丁基磷酸二丁酯（DBBP），叔丁基过氧化氢（TBHP），一氧化氮（NO），过氧化氢（H₂O₂），亚硝酸根离子（NO₂ ^-），硝酸根离子（NO₃ ^2-），羟自由基（OH^.）等竞争或干扰分子/离子的标准溶液，另取两只试管分别加入等摩尔量的次氯酸钠标准溶液和等量的水（空白对照），30min 后以450 nm为激发光，检测溶液的荧光发射光谱变化，结果如图4所示。根据不同竞争分子或离子的荧光强度作图，如图5所示。由图4与图5看可以发现，荧光探针PZ-HClO对多种竞争分子有较强的抗干扰性对荧光探针PZ-HClO在605nm处的荧光几乎没有影响，而次氯酸溶液的加入使化合物PZ-HClO在605nm处的荧光显著增强。

实施例4 荧光探针PZ-HClO对次氯酸的可视化检测。

从实施例2 中荧光探针储备液中取出30 μL加入到5mL的样品管中，加入50mmol/L的次氯酸钠标准溶液，如图6所示，次氯酸钠可以使合物PZ-HClO荧光探针的PBS：乙醇体积比为1:1的缓冲溶液溶液发生明显的颜色变化，溶液颜色从淡红色变成橙色。对未加入次氯酸钠溶液及加入次氯酸钠溶液的荧光探针溶液，进行紫外灯照射，可观察到肉眼可视的次氯酸诱导荧光探针从无色变成淡红色荧光，说明荧光探针PZ-HClO是一种具有生色传感功能的荧光探针。

实施例5 荧光探针PZ-HClO对细胞外源性次氯酸荧光成像

将本发明荧光探针PZ-HClO应用于HeLa细胞中，对外源性的次氯酸进行荧光成像，具体操作步骤如下：

a）将10μM荧光探针PZ-HClO溶液加入到育有HeLa细胞的培养液（2mL）中，在二氧化碳培养箱中培养30min，用磷酸缓冲液洗涤三次后，明场成像，如图a），可以看到细胞大致的轮廓；

b）将a）中细胞用561 nm激光激发，探测器接受范围为570nm-620nm，得到成像图b)；

c）将图a）和图b）叠加，得图像c）；

d）将10μM荧光探针PZ-HClO溶液加入到育有HeLa细胞的培养液（2mL）中在二氧化碳培养箱中培养30min，加入20μM的次氯酸钠水溶液后，在培养箱中培养30 min，用磷酸缓冲液洗涤三次后，明场成像，如图d），可以看到细胞大致的轮廓；

e）将d）中细胞用561nm激光激发，探测器接受范围为570nm-620nm，得到成像图e)；

f）将图d）和图e）叠加，得图像f）。

根据图7所示，没有加入次氯酸钠溶液的细胞在561 nm的激发下在红通道几乎观察不到荧光发出。然而，另一份加入次氯酸钠溶液后，在561 nm的激发光的照射下在红通道能够明显的观察到荧光发射，并能够进行荧光成像。这说明本荧光探针PZ-HClO可以对细胞中外源性的次氯酸进行荧光成像。

Claims

1.一种次氯酸荧光探针，具有如下式（I）所示的结构：

式（I）。

2.一种如权利要求1所述的次氯酸荧光探针的制备方法，包括以下步骤：

（1）邻羟基苯乙酮溶于乙酸乙酯中，将金属钠缓慢加入上述反应液中，反应得产物，产物萃取、干燥、脱溶，通过柱色谱分离得到化合物1-1：；

（2）化合物1-1溶于乙酸中，加入硫酸，反应回流得产物，产物萃取、干燥、脱溶，通过柱色谱分离得到化合物1-2：；

（3）化合物1-2和丙二腈溶于乙酸酐中，加热回流反应得产物，产物萃取、干燥、脱溶，过柱色谱分离得到化合物1-3：；

（4）吩噻嗪溶于DMF中，0℃下加入氢化钠，反应到室温时加入碘乙烷，继续反应得产物，产物萃取、干燥、脱溶，通过柱色谱进行分离纯化得到化合物2-1：；

（5）三氯氧磷与DMF在室温下搅拌，得反应液，将化合物2-1溶于1,2-二氯乙烷，加入上述反应液中，反应得产物，产物萃取、干燥、脱溶，通过柱色谱分离得到化合物2-2：；

（6）化合物2-2与化合物1-3溶于甲苯中，并向其中加入哌啶，回流反应得产物，产物萃取、干燥、脱溶，通过柱色谱分离得到权利要求1所述的次氯酸荧光探针。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，邻羟基苯乙酮与乙酸乙酯摩尔比为1:10；化合物1-2和丙二腈的摩尔比为5:6；吩噻嗪与碘乙烷的摩尔比为2:3；化合物2-2与化合物1-3的摩尔比为1:1。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）反应温度为100℃，步骤（3）反应温度为140℃，步骤（6）反应温度为110℃。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，各中间产物柱层析的硅胶颗粒大小为200-300目；步骤（1）中洗脱剂配比为乙酸乙酯/石油醚=1:6；步骤（2）中洗脱剂配比为乙酸乙酯/石油醚=1:5；步骤（3）中洗脱剂配比为乙酸乙酯/石油醚=1:4；步骤（4）中洗脱剂配比为二氯甲烷/石油醚=1:2；步骤（5）中洗脱剂配比为二氯甲烷/石油醚=1:1；步骤（6）中洗脱剂配比为二氯甲烷/石油醚=1:1。

6.一种权利要求1所述的次氯酸荧光探针在检测次氯酸中的应用，其特征在于，用于水溶液或生物体系中次氯酸的检测，所述的检测包含荧光检测、细胞成像和目视比色。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，检测次氯酸溶液时，以450 nm为激发波长，在605nm处有荧光峰值；检测细胞中次氯酸时，激发波长为561nm，发射光检测范围为570-620 nm。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，荧光强度与次氯酸浓度呈线性正相关。