CN113024445A - 基于吲哚菁类荧光探针、制备方法及用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了基于吲哚菁类荧光探针、制备方法及用途，结构如下。中间体EMPIW和6‑羟基‑2‑萘醛的缩合反应；荧光团N与丙烯酰氯的取代反应。该荧光探针基于吲哚菁结构，Michael受体作为识别基团，能特异性识别生物硫醇，且光学性能良好，能用于细胞内成像等。
Figure DDA0002977887100000011

Description

基于吲哚菁类荧光探针、制备方法及用途
技术领域
本发明涉及荧光探针、制备方法及用途，特别涉及基于吲哚菁类荧光探针、制备方法及用途。
背景技术
生物硫醇在生物体内起着重要的生理作用。其中半胱氨酸((Cys)参与生物体的信号调控与代谢过程。Cys在细胞的还原和肝脏解毒过程，蛋氨酸、硫胺素、肝素、生物素、硫辛酸、辅酶A等的生物合成中起重要作用，它可以保护防御系统免受氧化并影响二硫键的形成、折叠、组装和稳定性。人体中生物硫醇的水平异常可导致心血管疾病及中风、骨软弱病、精神病、生长迟缓、肝损伤等。因此，对生物体内的生物硫醇进行原位定量分析，就显得尤为重要。目前检测生物硫醇的方法有高效液相色谱法、电化学分析法、紫外分光光度法、荧光光谱法等等，而荧光光谱法相对于其他方法来说，其具有高灵敏度、特异性、用样量少、方法简单等优点。同时，荧光光谱法中的红外荧光成像技术具有背景干扰低、对生物样品的光损伤小、样品穿透性强、检测灵敏度高等优点，因此近红外荧光探针成像在化学、生物学和临床检验诊断等方面显示了较好的应用前景。
近年来，用于检测生物硫醇的荧光探针发展迅速，荧光素类、罗丹明类、香豆素类、BODIPY类、萘酰亚胺类、稀土配合物类、吡咯类、菁类等荧光染料陆续被设计合成，而菁类荧光探针由于最大吸收波长较大(λ＞600nm)，在近红外区应用于荧光标记效果明显，因此，菁类染料是近红外荧光染料唯一广泛使用的荧光染料，但其由于量子产率低、水溶解性差、光稳定性差等特点，局限了其进一步的发展。尽管菁类染料通过引入吲哚可改善其光学性能，但研究表明基于吲哚菁类荧光探针的荧光量子产率仍较低(一般地Φ＜0.25)，不适合生物成像。而具有刚性共面的染料，荧光量子产率比较高，但其发射波长一般是在可见区，这不利于它们在生物样品中的应用。为了提高吲哚菁类荧光探针的荧光量子产率，需要对吲哚菁类荧光探针的化学结构进行修饰。
发明内容
发明目的：本发明目的是提供基于吲哚菁类荧光探针，该荧光探针基于吲哚菁结构， Michael受体作为识别基团，能特异性识别生物硫醇，且光学性能良好，能用于细胞内成像。
本发明目的是提供所述基于吲哚菁类荧光探针的制备方法及用途。
技术方案：本发明提供一种基于吲哚菁类荧光探针，结构如下：
Figure RE-GDA0003075425600000021
进一步地，在不同的pH值范围内，探针N-1具有不同的光稳定性。
所述的基于吲哚菁类荧光探针的制备方法，包括如下步骤：
(1)中间体EMPIW和6-羟基-2-萘醛的缩合反应
向中间体EMPIW和6-羟基-2-萘醛的混合物种加入无水乙醇，反应完成后，向反应体系中加入不良溶剂进行析晶，抽滤、洗涤，得到绿褐色滤饼，干燥，得到荧光团N，工艺流程如下：
Figure RE-GDA0003075425600000022
(2)荧光团N与丙烯酰氯的取代反应
向惰性气体保护的荧光团N中注入无水DCM作溶剂，搅拌，待底物完全溶解，注入无水TEA，并在0℃环境中继续搅拌，再注入丙烯酰氯，反应后，反应液减压浓缩，得到暗红色粗产品，分离纯化，得到红色固体N-1，工艺流程如下：
Figure RE-GDA0003075425600000031
进一步地，所述不良溶剂为MTBE。
所述的基于吲哚菁类荧光探针响应Cys的方法，工艺如下：
Figure RE-GDA0003075425600000032
探针N-1与Cys发生响应后，由于分子内相互作用，可快速形成七元环并暴露出荧光团N，形成新的“推-拉电子”体系，其光谱发生明显的红移或蓝移，其机制的验证如图 1所示。
体外细胞毒性实验结果表明，探针N-1浓度在50μM时，Hela细胞的存活率仍超过了85％。体外细胞实验结果显示，探针N-1对HepG2细胞中内源性与外源性Cys显示出很好的荧光强度。研究结果表明探针N-1具有良好的光学性能，在中性环境中有较好的稳定性，能特异性检测细胞中内源性与外源性Cys，且对细胞毒副作用小。
所述的基于吲哚菁类荧光探针在制备Cys检测试剂中的用途。
进一步地，用于特异性检测细胞中内源性与外源性Cys。
所述的基于吲哚菁类荧光探针在制备诊断试剂中的用途。
所述的基于吲哚菁类荧光探针作为分子探针在细胞成像中的用途。可作为诊断试剂用于人体中生物硫醇的水平异常引起的心血管疾病及中风、骨软弱病、精神病、生长迟缓、肝损伤等疾病的诊断。
有益效果：本发明吲哚菁类荧光探针N-1，其有更大的共轭结构，光学性能相对良好。探针N-1与较宽的浓度范围内的Cys线性相关，且其检测线可达4nM，这为定量检测微量Cys的浓度提供了新思路。同时，探针N-1有较好的光稳定性，在一定的pH 范围内，能稳定存在，为探针N-1的体外以及体内实验的进一步探讨奠定了基础。其体外实验的进一步研究结果表明，探针N-1能特异性检测细胞中内源性与外源性Cys，这将为进一步探讨Cys的生理学功能提供了一种新方法。
附图说明
图1为探针N-1与Cys反应的LC-MS图谱；
图2为探针N-1的质谱；
图3为探针N-1的氢谱；
图4为探针N-1的碳谱；
图5为探针N-1及与Cys作用后的紫外吸收光谱；
图6为探针N-1与Cys作用的荧光光谱响应，图6(a)为探针N-1与Cys作用的荧光光谱响应，图6(b)探针N-1与Cys作用后的荧光比值(A/A0＝I485/I635，λex＝436nm)；
图7为探针N-1的荧光光谱响应，图7(a)为探针N-1的荧光光谱响应，图7(b) 为探针N-1的荧光比值(A/A0＝I485/I635，λex＝436nm)；
图8为pH对探针N-1的荧光强度响应，图8(a)为不同pH对探针N-1的荧光强度响应，图8(b)不同pH对探针N-1的荧光比值响应(A/A0＝I485/I635，λex＝436nm)；
图9为pH对Cys和探针N-1的荧光光谱响应，图9(a)为不同pH对探针N-1与 Cys作用的荧光光谱响应，图9(b)为pH对探针N-1与Cys作用的荧光比值 (A/A0＝I485/I635，λex＝436nm)响应；
图10为探针N-1与Cys反应的动力学荧光光谱，图10(a)为探针N-1荧光强度随时间变化；图10(b)为探针N-1荧光比值(A/A0＝I485/I635，λex＝436nm)随时间变化；
图11为探针N-1的选择性与竞争性实验结果；
图12为探针N-1细胞毒性实验结果；
图13为HepG2细胞的荧光成像结果。
具体实施方式
实施例1探针N-1的合成
1.中间体EMPIW和6-羟基-2-萘醛的缩合反应。
将中间体EMPIW(2g)和6-羟基-2-萘醛(2g)同时置于单口圆底烧瓶中，加入无水乙醇(35mL)，室温下搅拌24h。反应完成后，直接向反应体系中加入不良溶剂MTBE (30mL)进行析晶，在抽滤漏斗中抽滤并用MTBE洗涤晶体，得到绿褐色滤饼，将滤饼放在真空干燥箱中拉干，得到荧光团N(2g)，产率50％。
Figure RE-GDA0003075425600000051
2.荧光团N与丙烯酰氯的取代反应。
将荧光团N(2g)置于无水双口圆底烧瓶中，抽取真空氦气保护，注入无水DCM(20mL)作溶剂，在磁力搅拌器作用下，待底物完全溶解，注入无水TEA(1.7g)，并在冰水混合物0℃环境中继续搅拌0.5h，再缓慢注入丙烯酰氯(2g)，反应3h后，反应液直接减压浓缩，得到暗红色粗产品，再用硅胶柱层析色谱分离纯化(硅胶柱DCM∶ MeOH＝150∶1，TLC DCM∶MeOH＝20∶1)，得到红色固体N-1(0.95g)，产率24％。熔点：180℃～180.5℃。1H NMR(400MHz，MeOD)δ8.90(d，J＝7.3Hz，1H)，8.36(t，J＝ 12.1Hz，2H)，8.20(s，1H)，8.05(d，J＝8.2Hz，1H)，8.01-7.94(m，2H)，7.88(d，J＝8.5Hz， 1H)，7.72(t，J＝7.7Hz，1H)，7.55(d，J＝4.6Hz，1H)，7.52(d，J＝12.0Hz，1H)，7.37(d，J＝ 8.6Hz，1H)，7.02(s，1H)，6.89(d，J＝8.7Hz，1H)，6.58(d，J＝17.3Hz，1H)，6.32(dd，J＝ 17.3，10.5Hz，1H)，6.14(d，J＝10.5Hz，1H)，4.67(d，J＝6.9Hz，1H)，4.63(d，J＝7.1Hz， 1H)，1.55(t，J＝7.2Hz，3H).13C NMR(101MHz，MeOD)δ163.97(s)，160.48(s)，152.39 (s)，150.28(s)，137.96(s)，136.93(s)，135.09(d，J＝19.1Hz)，133.53(s)，132.62(s)，132.04 (s)，130.77(s)，130.60-130.06(m)，129.50(s)，128.89(s)，128.24(s)，127.27(s)，126.68(s)， 124.07(s)，122.82(s)，121.73(s)，119.05(s)，117.83(s)，113.53(s)，41.56(s)，14.72(s)。
Figure RE-GDA0003075425600000052
探针N-1的质谱图，如图2所示，氢谱如图3所示，碳谱如图4所示。
实施例2探针N-1的紫外吸收光谱
探针N-1的紫外吸收光谱是在PBS∶DMSO＝9∶1体系中测得，探针N-1的浓度为10μM。由图5可知，其最大紫外吸收的波长为595nm，再用不同浓度的Cys处理探针 N-1，并在37℃的摇床孵育半小时，测得其最大紫外吸收度的波长为436nm，随着Cys 浓度的增加，其在436nm处的紫外吸收度也在不断的增大，当Cys的浓度为300μM时，其在436nm处的紫外吸收度增大了5.2倍。
实施例3探针N-1的荧光光谱响应
不同浓度的Cys与探针N-1作用后的荧光光谱均在PBS∶DMSO＝9∶1体系中测得的，探针N-1的浓度为10μM。如图6所示，图6a为探针N-1与Cys作用的荧光光谱响应，图6b为探针N-1与Cys作用后的荧光比值(A/A0＝I485/I635，λex＝436nm)。由图 6可知，随着Cys浓度的增加，发射波长在635nm处的荧光强度不断减弱，而在485nm 处的荧光强度在不断增强。进一步研究发现，当Cys浓度在0μM～95μM时，Cys浓度与发射波长在485nm与635nm的荧光比值有较好的线性相关性(y＝0.0617x+0.5326， R2＝0.9954)。
由上述线性公式可得到k＝0.0617。再进行10次空白对照实验，测定10次探针N-1在436nm激发波长下，其发射波长在485nm和635nm处的荧光强度，计算其荧光比值(A/A0＝I485/I635)，由
Figure RE-GDA0003075425600000061
Xi为荧光比值A/A0，
Figure RE-GDA0003075425600000062
为10组荧光比值平均值，可计算出标准偏差σ。图7a为探针N-1的荧光光谱响应，图7b为探针 N-1的荧光比值(A/A0＝I485/I635，λex＝436nm)。由图7可知探针N-1(10μM)的10 次空白对照荧光比值标准偏差σ＝8.26267×10-5，再由检出限公式LOD＝3σ/k，可得探针 N-1的检出限为4nM，其远小于Cys在人体的最低浓度，因此，探针N-1能在较大浓度范围内对微量的Cys进行定量分析。
实施例4 pH对探针N-1的荧光光谱响应
取9×40mL磷酸盐缓冲液(pH＝7.2～7.4)、5×40mL醋酸盐缓冲液(pH＝3.5)于旋盖圆底离心管中，分别向离心管中加入一定量2M的盐酸、氢氧化钠溶液，配成不同 pH(1～14)的缓冲溶液备用。
不同pH对探针N-1的荧光光谱响应均在PBS∶DMSO＝9∶1体系中测得的，如图8 所示，图8a为不同pH对探针N-1的荧光强度响应，图8b为不同pH对探针N-1的荧光比值响应(A/A0＝I485/I635，λex＝436nm)，探针N-1的浓度为10μM。由图8可知，当pH范围在1～9时，探针N-1在发射波长635nm处的荧光强度缓慢减弱，但其荧光强度仍要远大于中性环境下的荧光强度，而485nm处的荧光强度基本相等，且可忽略不计，其对应的荧光比值约为0，而当pH＞9时，探针N-1的化学结构被破坏，其发射波长相对于485nm，发生明显红移，红移至512nm处，随着碱性的增强，其荧光强度在不断增加。其对应于发射波长485nm处的荧光强度在不断增大，而635nm处的荧光强度基本保持不变，故其对应的荧光比值在不断的增大。因此，探针N-1可用于检测细胞内或中性环境中的Cys。
实施例5 pH对Cys和探针N-1的荧光光谱响应
不同pH对Cys和探针N-1的荧光光谱响应均在PBS∶DMSO＝9∶1体系中测得的，如图9所示，图9a为pH对探针N-1与Cys作用的荧光光谱响应，图9b为pH对探针 N-1与Cys作用的荧光比值(A/A0＝I485/I635，λex＝436nm)响应。探针N-1的浓度为10μM， Cys浓度为500μM。研究结果表明，pH在1～4时，荧光发射波长在485nm处的荧光强度，相对于发射波长在635nm处的荧光强度可忽略不计，其对应的荧光比值也接近于0，即在酸性环境下，探针N-1不能识别Cys。当pH大于5且小于9时，随着碱性增强，其发射波长在635nm处的荧光强度不断减弱，在485nm处的荧光强度不断增强，其荧光比值也相对增大。当pH大于8时，探针N-1的化学结构被破坏，其发射光谱相对于485nm红移，荧光比值也相对增加。
实施例6探针N-1的动力学研究
探针N-1与Cys反应的动力学荧光光谱均在PBS∶DMSO＝9∶1体系中测得的，如图10所示，图10a为探针N-1荧光强度随时间变化，图10b为探针N-1荧光比值 (A/A0＝I485/I635，λex＝436nm)随时间变化，探针N-1的浓度为10μM，Cys浓度为500 μM。研究结果表明，探针N-1与Cys接触后，能快速发生响应，荧光发射波长在635nm 的荧光强度显著减弱，而在485nm处的荧光强度明显增强，其对应的荧光比值也明显增大，并在30min后，荧光强度与荧光比值均保持不变。与相比较，可知探针N-1的荧光强度与荧光比值基本一致，因此，探针N-1具有较好的光稳定性，衰减作用较小。即探针N-1能快速响应Cys，能用于Cys的快速检测。
实施例7探针N-1的选择性与竞争性实验
电子天平称取荧光探针N-1：1.30mg；Gly：1.25mg；Ala：1.50mg；Val：2.00mg； Leu：2.15mg；Phe：2.75mg；Trp：3.40mg；Asp：2.20mg；Lys：2.45mg；Gln：2.45 mg；Met：2.50mg；Ser：1.05mg；Thr：2.00mg；Pro：1.91mg；Arg：2.90mg；GSH： 5.10mg；Hcy：2.25mg；CaCl2：1.85mg；MgSO4：2.00mg；Na2S：1.30mg；NaCl： 0.97mg；NH4Cl：0.90mg；ZnCl2：2.27mg备用。将荧光探针N-1溶解于3mL的PBS∶ DMSO＝9∶1溶液中，配制成10-3M的储备液备用。Ala；Arg；Asp；CaCl2；Gln；Gly；GSH； Hcy；Leu；Lys；Met；MgSO4；Na2S；NaCl；NH4Cl；Phe；Pro；Ser；Thr；Trp；Val；ZnCl2均溶解于3mL超纯水中，配制成5×10-3M的储备液备用。
探针N-1对Cys的选择性与竞争性研究，均是在PBS∶DMSO＝9∶1体系中测得的，各种氨基酸、离子的浓度均为500μM，探针N-1、Cys的浓度分别为10μM、500μM， 1，Ala；2，Arg；3，Asp；4，CaCl2；5，Gln；6，Gly；7，GSH；8，Hcy；9，Leu；10，Lys；11，Met；12， MgSO4；13，Na2S；14，NaCl；15，NH4Cl；16，Phe；17，Pro；18，Ser；19，Thr；20，Trp；21，Val； 22，ZnCl2。如图11所示。研究结果表明，各种氨基酸与离子对探针N-1发射波长在485 nm、635nm处的荧光强度几乎不产生影响，其荧光比值几乎可忽略不计，随着Cys的加入，其在485nm、635nm处的荧光强度发生显著变化，荧光比值信号显著增强，约增强6～25倍。探针N-1对Cys的选择性优于其他氨基酸和离子，能特异性的检测Cys。
实施例8细胞毒性实验
探针N-1的细胞毒性实验是通过常规的细胞活力测定来评价的。在含5％CO2的37℃培养箱中培养接种在含有10％牛胎血清、80U/mL青霉素和0.08mg/mL链霉素的MEM 培养基中的Hela。探针N-1溶解在DMSO中，不同浓度的探针N-1(0μM～50μM)与 Hela细胞共同孵育24h。再将MTT(20μM，5mg/mL)加入细胞中孵育4h。多功能酶标仪测定每孔在436nm处的吸光度，由细胞存活率公式可得：细胞存活率(％)＝ (Absprobe-AbsMEM)/(Abscontrol-AbsMEM)×100，可得探针N-1在不同浓度下的细胞存活率。结果如图12所示。研究结果表明，当探针浓度高达50μM时，细胞仍有较高的存活率(大于85％)。探针N-1对细胞的毒副作用较小，能运用于细胞学上的研究。
实施例9细胞荧光成像实验
为了研究探针N-1能否选择性的检测细胞中的Cys，利用荧光倒置显微镜对细胞成像进行研究。如图13所示，其中，a1-a5为HepG2细胞与探针N-1(10μM)共同孵育。； b1-b5为HepG2细胞与100μM NEM共同孵育后再与探针N-1(10μM)共同孵育；c1-c5 为HepG2细胞先与NEM(100μM)共同孵育，然后与Cys(200μM)共同孵育，最后与探针N-1(10μM)共同孵育(λex＝436nm，绿色通道：λem＝485nm，红色通道：λem＝635 nm)。明场显示了实验环境下细胞的状态。探针N-1单独与细胞共同孵育30min时，细胞在绿色通道显示出较强的荧光信号，而红色通道几乎没有荧光。当细胞与NEM共同孵育30min后，再与探针N-1共同孵育30min时，绿色通道荧光显著减弱，显示出较弱的荧光信号，而红色通道荧光信号显著增强。当细胞与NEM共同孵育30min后，再与Cys共同孵育30min，最后与探针N-1共同孵育30min，在绿色通道观察到很强的荧光信号，红色通道荧光信号很微弱。这些结果表明，探针N-1能同时检测细胞中内源性与外源性Cys，因此，探针N-1是检测Cys浓度异常的一种可行的荧光探针。

Claims (9)

1.一种基于吲哚菁类荧光探针，结构如下：
Figure FDA0002977887070000011
2.根据权利要求1所述的基于吲哚菁类荧光探针，其特征在于：在不同的pH值范围内，探针N-1具有不同的光稳定性。
3.权利要求1所述的基于吲哚菁类荧光探针的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)中间体EMPIW和6-羟基-2-萘醛的缩合反应
向中间体EMPIW和6-羟基-2-萘醛的混合物种加入无水乙醇，反应完成后，向反应体系中加入不良溶剂进行析晶，抽滤、洗涤，得到绿褐色滤饼，干燥，得到荧光团N，工艺流程如下：
Figure FDA0002977887070000012
(2)荧光团N与丙烯酰氯的取代反应
向惰性气体保护的荧光团N中注入无水DCM作溶剂，搅拌，待底物完全溶解，注入无水TEA，并在0℃环境中继续搅拌，再注入丙烯酰氯，反应后，反应液减压浓缩，得到暗红色粗产品，分离纯化，得到红色固体N-1，工艺流程如下：
Figure FDA0002977887070000021
4.根据权利要求3所述的基于吲哚菁类荧光探针的制备方法，其特征在于：所述不良溶剂为MTBE。
5.权利要求1所述的基于吲哚菁类荧光探针响应Cys的方法，其特征在于：工艺如下：
Figure FDA0002977887070000022
6.权利要求1所述的基于吲哚菁类荧光探针在制备Cys检测试剂中的用途。
7.根据权利要求6所述的用途，用于特异性检测细胞中内源性与外源性Cys。
8.权利要求1所述的基于吲哚菁类荧光探针在制备诊断试剂中的用途。
9.权利要求1所述的基于吲哚菁类荧光探针作为分子探针在细胞成像中的用途。
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