CN112142753A - 异硫氰酸荧光素衍生物的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种新型的异硫氰酸荧光素衍生物的制备方法。此方法所制备出的异硫氰酸荧光素衍生物可以直接与生物材料中氨基酸连接,由此形成异硫氰酸荧光素衍生物标记的生物分子,进而实现对生物材料的检测。
Description
技术领域
本发明涉及化学合成领域,具体涉及一种制备异硫氰酸荧光素衍生物的方法。
背景技术
异硫氰酸荧光素(FITC)是在荧光素的基础上通过化学反应增加异硫氰酸基团得到的。FITC中所含的硫氰酸基团可以和生物材料中氨基酸的氨基基团反应形成硫脲键,从而实现对生物材料的荧光标记。例如,FITC能和各种抗体分子中的氨基酸结合,形成FITC标记的抗体分子。在抗体与待检测生物材料中的抗原结合后,通过在荧光显微镜下观察或流式细胞仪分析可对相应抗原进行定性、定位或定量的检测。FITC是目前应用最广泛的荧光素,其在食品、医学、农学和畜牧等方面均有广泛的用途。
但是,FITC通常需要偶联在抗体等检测分子上才能使用,无法单独用于生物材料的检测。因此,期望能够有一种可以直接与生物材料中氨基酸连接,并能够实现荧光检测的新型标记物质。
发明内容
针对此问题,本发明提供了一种新型的异硫氰酸荧光素衍生物的制备方法。此方法所制备出的异硫氰酸荧光素衍生物可以直接与生物材料中氨基酸连接,由此形成异硫氰酸荧光素衍生物标记的生物分子,进而实现对生物材料的检测。
一方面,本发明提供了一种制备下式化合物6所示的异硫氰酸荧光素衍生物的方法,
其包括以下步骤:
(i)将如下所示的化合物1a、三乙基硅烷和三氟化硼乙醚络合物(BF3·OEt2)在二氯甲烷溶剂中混合并反应,得到如下所示的化合物1;
(ii)将如下所示的化合物5a溶于乙酸/水溶剂,并在0℃下加入亚硝酸钠,反应15分钟后加入叠氮化钠,并继续反应2小时,反应结束后,旋蒸除去溶剂,并2M的盐酸和水相继洗涤粗产品,过柱分离纯化,可得到化合物5;
(iii)在碘化亚铜催化和氮气保护下,使化合物5和化合物1在二甲基亚砜溶剂中,在80℃反应1.5小时,得到如化合物6所示的异硫氰酸荧光素衍生物。
在一个实施方式中,在步骤(i)中,化合物1a、三乙基硅烷和三氟化硼乙醚络合物(BF3·OEt2)的摩尔当量比为1:2:2。
在一个实施方式中,在步骤(ii)中,化合物5a、亚硝酸钠和叠氮化钠的摩尔当量比为2:3:4。
在一个实施方式中,在步骤(iii)中,化合物5、化合物1和碘化亚铜催化的摩尔当量比为2:3:1。
在一个实施方式中,所述方法进一步包括对反应后的分离纯化步骤。
在一个实施方式中,所述分离纯化步骤使用柱层析进行。
另一方面,本发明提供了一种制备下式化合物7所示的异硫氰酸荧光素衍生物的方法,
其包括以下步骤:
(i)将如下所示的化合物3a、碳酸钾和炔丙基溴混合并反应,得到如下所示的化合物3;
(ii)将如下所示的化合物5a溶于乙酸/水溶剂,并在0℃下加入亚硝酸钠,反应15分钟后加入叠氮化钠,并继续反应2小时,反应结束后,旋蒸除去溶剂,并2M的盐酸和水相继洗涤粗产品,过柱分离纯化,可得到化合物5;
(iii)在碘化亚铜催化和氮气保护下,使化合物5和化合物3在二甲基亚砜溶剂中,在80℃反应1.5小时,得到如化合物7所示的异硫氰酸荧光素衍生物。
在一个实施方式中,在步骤(i)中,化合物3a、碳酸钾和炔丙基溴的摩尔当量比为4:3:2。
在一个实施方式中,在步骤(ii)中,化合物5a、亚硝酸钠和叠氮化钠的摩尔当量比为2:3:4。
在一个实施方式中,在步骤(iii)中,化合物5、化合物3和碘化亚铜催化的摩尔当量比为2:3:1。
在一个实施方式中,所述方法进一步包括对反应后的分离纯化步骤。
在一个实施方式中,所述分离纯化步骤使用柱层析进行。
另一方面,本发明提供了选自以下的一种或多种异硫氰酸荧光素衍生物:
另一方面,本发明提供了一种选自以下的一种或多种异硫氰酸荧光素衍生物在制备荧光标记物中的用途:
在一个实施方式中,所述荧光标记物可以与氨基酸结合,优选与酪氨酸结合。
在一个实施方式中,在辣根过氧化物酶催化下,所述荧光标记物与氨基酸结合,优选与酪氨酸结合。
另一方面,本发明提供了一种荧光检测试剂盒,其包含选自以下的一种或多种异硫氰酸荧光素衍生物:
在一个实施方式中,所述试剂盒进一步包括辣根过氧化物酶,以及可选地使用说明书。
现有技术中尚未报道本发明的异硫氰酸荧光素衍生物及其制备方法。在实际合成中,化合物6的合成更加容易,产业化前景高。
本发明制备方法所制备出的异硫氰酸荧光素衍生物可以直接与生物材料中氨基酸(例如酪氨酸)反应生成异硫氰酸荧光素衍生物标记的生物分子。这极大的方便了生物材料的荧光检测。而且,本发明方法制备出的异硫氰酸荧光素衍生物结构稳定,发光效果好。此外,本发明的制备异硫氰酸荧光素衍生物的方法方便简单,特异性高,产物纯度高。
附图说明
图1:化合物6的NMR谱
图2:化合物6的MS谱
图3:化合物6的发射光谱(EM))
图4:化合物6的紫外吸收光谱
图5:化合物7的MS谱
图6:化合物7的NMR谱
图7:化合物7的发射光谱(EM))
图8:化合物7的紫外吸收光谱
图9:化合物6、7和Opal 520TM的染色图像
图9A和9B为两组平行实验中化合物6的染色图像;
图9C和9D为两组平行实验中化合物7的染色图像;和
图9E和9F为两组平行实验中Opal 520TM的染色图像,
其中9A、9C和9E为在同一组实验中拍摄的图像;9B、9D和9F为在另一组实验中拍摄的图像。
实施例
在本发明中,除非特殊说明,否则反应中所用的原料和试剂均是可以商业购买获得。可商购的化学试剂可由标准商业来源获得,本发明实施例中所用试剂来源包括AldrichChemical、Chemservice Inc.、Fisher Scientific Co.、Fisons Chemicals(Leicestershire UK)、Frontier Scientific(Logan UT)、国药集团化学试剂有限公司、北京化学试剂厂等。
实施例1
化合物1的制备方法
在氩气氛下,在干燥的玻璃器皿中进行反应。将起始4-(丁-3-炔-1-基)苯酚的醇(669mg,2.4mmol,1.0当量)溶解在无水二氯甲烷(10mL)中并用Et3SiH(773μL,563mg,4.8mmol,2.0当量)处理。将混合物冷却至0℃,然后加入BF3·OEt2(613μL,687mg,4.8mmol,2.0当量)并将反应在0℃下搅拌1小时。当TLC显示原料完全转化时,另外4当量BF3·OEt2(1.2mL,1.37g,9.6mmol,4.0当量),将混合物温热至室温并搅拌18小时。TLC显示中间体完全转化为最终产物,混合物用二氯甲烷(50mL)稀释并用饱和NaHCO3(30mL)水溶液洗涤。水层用二氯甲烷(2×20mL)反萃取,合并的有机层用盐水(30mL)洗涤,用无水Na2SO4干燥,除去溶剂后,通过快速柱色谱(己烷/乙酸乙酯95/5)纯化粗产物,得到252mg(71%)无色油状产物。
实施例2
化合物3的制备方法
将1,4-苯二酚(20mmol)、炔丙基溴(10mmol)、碳酸钾(15mmol)溶于乙腈(50mL),于50℃下反应过夜。旋蒸除去溶剂,柱层析分离得到目标产物3。
实施例3
化合物5的制备方法
将5mmol化合物5-氨基荧光素(购自Aladdin,Lot No.H1801120)溶于100mL乙酸/水(2:1),并在0℃下加入7.5mmol亚硝酸钠。反应15分钟后加入10mmol叠氮化钠,并继续反应2小时。反应结束后,旋蒸除去溶剂,并200mL浓度为2M的盐酸和1000mL水相继洗涤粗产品。TLC检测反应。通过柱色谱纯化(二氯甲烷:甲醇=8:1)得到产物5。
实施例4
化合物6的制备方法
在充满氮气的手套箱中,向装有磁子的4mL棕瓶中加入二甲基亚砜(0.5mL)、碘化亚铜(19mg,0.5当量),室温下搅拌30分钟。将化合物5(0.2mmol,74mg,1.0当量)、化合物1(0.3mmol,45mg,1.5当量)加入棕瓶中,80℃搅拌1.3小时。TLC检测反应。通过柱色谱纯化(二氯甲烷:甲醇=8:1)得到产物6。
1H NMR(400MHz,MeOH-d4):δ8.4(s,1H),8.36(s,1H),8.20(d,J=8.0Hz,1H),7.42(d,J=8.0Hz,1H),7.05(d,J=8.0Hz,2H),6.71(s,2H),6.73-6.69(m,4H),6.65-6.56(m,2H),3.08(t,J=16Hz,2H),2.98(t,J=12Hz,2H)。(参见图1)
HRMS m/z(CI)calcd.for C30H23N3O6(M+2H)+521.1587,found 521.1539.(参见图2)
实施例5
化合物6的发射光谱(EM)和紫外吸收光谱的测定
采用ICP发射光谱仪测定化合物6的发射光谱,按照光谱仪手册的方法进行测定。
结果显示在图3中。结果显示,化合物6的发射波长为520nm。
采用德国蔡司紫外吸收光谱仪测定化合物6的紫外吸收光谱,按照光谱仪手册的方法进行测定。结果显示在图4中。
结果显示,化合物6可以被有效激发荧光且具有特定的紫外吸收。紫外吸收波长为470nm。
实施例6
化合物7的制备方法
在充满氮气的手套箱中,向装有磁子的4mL棕瓶中加入二甲基亚砜(0.5mL)、碘化亚铜(19mg,0.5当量),室温下搅拌40分钟。将化合物5(0.2mmol,74mg,1.0当量)、化合物3(0.3mmol,45mg,1.5当量)加入棕瓶中,80℃搅拌2.5小时。TLC检测反应。通过柱色谱纯化(二氯甲烷:甲醇=8:1)得到产物7。
1H NMR(400MHz,MeOH-d4):δ8.78(s,1H),8.49(s,1H),8.27(d,J=8.0Hz,1H),7.45(d,J=8.0Hz,1H),7.12(t,J=16.0Hz,1H),6.91-6.85(m,3H),6.76-6.65(m,5H),6.60-6.55(m,2H),5.49(s,2H)。(参见图5)
HRMS m/z(CI)calcd.for C29H20N3O7(M+H)+522.1302,found 522.1301.(参见图6)
此外,对比化合物6和化合物7的制备工艺,二者较为近似,化合物6制备的条件略微温和。综合原料成本,制备工艺等综合因素,似乎化合物6的制备工艺工业应用前景略佳。
实施例7
化合物7的发射光谱(EM)和紫外吸收光谱的测定
采用ICP发射光谱仪测定化合物7的发射光谱,按照光谱仪手册的方法进行测定。
结果显示在图7中。结果显示,化合物7的发射波长为520nm。
采用德国蔡司紫外吸收光谱仪测定化合物7的紫外吸收光谱,按照光谱仪手册的方法进行测定。结果显示在图8中。
结果显示,化合物7可以被有效激发荧光且具有特定的紫外吸收。紫外吸收波长为470nm。
实施例8
化合物6和7的荧光检测
1.1.1实验试剂
1,CD4抗体(ZM0418,中衫金桥)
2,OpalTM 7-色荧光染色试剂盒(Lot Number:2306158)(Boston,MA,02118USA),主要组成如下:
1)试剂盒组分包括:
a)抗体稀释液和封闭液
b)抗原修复液(pH9.0)
c)1×酪氨酸信号放大液
d)Ms+Rb HRP-二抗
e)DAPI染色剂
3.荧光染料
对照采用美国Opal520TM
实验平行进行两组。
4.其他常用试剂
无水乙醇(生产厂家国药集团化学试剂有限公司)
二甲苯(生产厂家国药集团化学试剂有限公司)
TritonX-100(生产厂家sigma)
Tween 20(生产厂家sigma)
TBST液(生产厂家北京宝瑞杰科技有限公司)
防淬灭剂(生产厂家北京雷根生物技术有限公司,货号IH0252,Lot0525A17)
1.1.2实验仪器
1,RM2235型石蜡切片机,Leica,德国;
2,电热恒温培养箱,生产厂上海一恒科学仪器有限公司
3,微波炉,生产厂家美的
4,医用离心机,生产厂商安徽中科中佳科学仪器有限公司
5,染色摇床,生产厂商江苏天翎仪器有限公司
6,多光谱成像系统(型号:Vectra,PerkinElmer Boston,MA,02118USA)Inform2.3.0软件。
7,其他常用设备
染色缸、染色架、免疫组化用湿盒、防水笔等
1.1.3实验样本
实验样本
人扁桃体切片
1.1.4研究方法
1.1.4.1免疫荧光检测
基本原理
催化信使沉积法(CARD,catalyzed reporter deposition)是一种创新的信号放大标记技术。它通过一个分析物依赖性酶激活体系将标记物沉积在固相的分析表面上,而这些标记物可以被直接或间接检测出来。这种方法可以实现检测信号放大和提高检测限。CARD法中可用的可检测标记物有多种类型,如荧光探针,有机染料,化学发光染料等。
本实验采用免疫组织化学基本原理,利用一抗定位抗原,二抗引入辣根过氧化物酶(HRP),再利用CARD法使得染料结合在抗原上从而实现标记和抗原检测。
以下实验在相同条件下,平行进行两组实验。
实验步骤
1.石蜡切片放置在60℃恒温箱中烘烤120分钟;
2.脱蜡和水化:二甲苯(10min)→二甲苯(10min)→无水乙醇(5min×2次)→95%乙醇(5min×2)→90%(5min)→85%乙醇(5min)→80%乙醇(5min)→75%乙醇(5min);
3.蒸馏水冲洗2次5min;
4.抗原修复:用试剂盒内抗原修复液微波修复,预热5min,高火2min,中低火15min;
5.室温自然冷却;
6.洗涤:TBST洗3次,5min/次;
7.封闭:用试剂盒内封闭液,室温封闭10min;
8.一抗孵育:滴加一抗CD4(一抗工作液100μl),37℃孵育1h;
9.洗涤:TBST洗3次,5min/次;
10.二抗孵育:滴加试剂盒内二抗,37℃孵育10min;
11.洗涤:TBST洗3次,5min/次;
12.荧光显色:滴加稀释后的荧光染色100μl(三种染料分别为:本发明化合物“ALP6-0”、本发明化合物“ALP7-0”、和对照Opal520TM),室温10min;
13.洗涤:TBST洗3次,5min/次;
14.微波处理:重复步骤4)到步骤6);
15.DAPI染色,室温5~10min;
16.洗涤:TBST洗3次,5min/次;
17.封固:防淬灭剂封片;
18.连续光谱成像,图像分析定量和统计分析。
附表:抗体染色表
抗体测试表
抗体 | CD4 | DAPI |
货号 | ZM0418 | — |
一抗种属 | 兔 | |
一抗 | 100μl | — |
修复条件 | AR9 | |
一抗孵育条件 | 37℃1hr | 5min |
染料 | Opal520<sup>TM</sup>/ALP6-0/ALP7-0 | DAPI |
1.1.5图像及分析数据示例如下:
染色图像拍摄后,使用Nuance分析软件进行阳性信号分析,结果计算如下:
染料 | *阳性信号评均强度(Scaled counts/s) |
Opal520<sup>TM</sup> | 0.912 |
ALP6-0 | 1.316 |
ALP7-0 | 1.428 |
*计算方法:两组平行结果,分别统计阳性信号的总强度(Total counts)、阳性信号面积(pixels)和曝光时间(s),然后再计算平均值。Scaled counts/s=Total counts/(Pixels*s)
图9A、9C和9E为在同一组实验中拍摄的ALP6-0(化合物6)、ALP7-0(化合物7)和Opal 520TM的染色图像。图9B、9D和9F为在另一组实验中拍摄的ALP6-0(化合物6)、ALP7-0(化合物7)和Opal 520TM的染色图像。
从肉眼观测的图9A-F的图像结果可以看出,ALP6-0和ALP7-0染料均可以与待检测物抗原结合并进行染色,且信号很强。而且,与美国的市售染料Opal520TM相比,ALP6-0和ALP7-0染料均显示出更强的染色信号强度,效果更好。ALP6-0和ALP7-0染料二者本身效果差异不大。
由Nuance分析软件测定计算出的阳性信号平均强度也显示ALP6-0和ALP7-0染料的染色信号均优于Opal520TM。ALP6-0和ALP7-0染料二者之间平均强度并无明显差异。
Claims (6)
2.如权利要求1的方法,其中在步骤(i)中,化合物1a、三乙基硅烷和三氟化硼乙醚络合物(BF3·OEt2)的摩尔当量比为1:2:2。
3.如权利要求1或2的方法,其中在步骤(ii)中,化合物5a、亚硝酸钠和叠氮化钠的摩尔当量比为2:3:4。
4.如权利要求1-3任一项的方法,其中在步骤(iii)中,化合物5、化合物1和碘化亚铜催化的摩尔当量比为2:3:1。
5.如权利要求1-4任一项的方法,其中所述方法进一步包括对反应后的分离纯化步骤。
6.如权利要求1-5任一项的方法,其中所述分离纯化步骤使用柱层析进行。
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