CN112142755B - 异硫氰酸荧光素衍生物的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种新型的异硫氰酸荧光素衍生物的制备方法。此方法所制备出的异硫氰酸荧光素衍生物可以直接与生物材料中氨基酸连接，由此形成异硫氰酸荧光素衍生物标记的生物分子，进而实现对生物材料的检测。

Description

异硫氰酸荧光素衍生物的制备方法
技术领域
本发明涉及化学合成领域，具体涉及一种制备异硫氰酸荧光素衍生物的的方法。
背景技术
异硫氰酸荧光素(FITC)是在荧光素的基础上通过化学反应增加异硫氰酸基团得到的。FITC中所含的硫氰酸基团可以和生物材料中氨基酸的氨基基团反应形成硫脲键，从而实现对生物材料的荧光标记。例如，FITC能和各种抗体分子中的氨基酸结合，形成FITC标记的抗体分子。在抗体与待检测生物材料中的抗原结合后，通过在荧光显微镜下观察或流式细胞仪分析可对相应抗原进行定性、定位或定量的检测。FITC是目前应用最广泛的荧光素，其在食品、医学、农学和畜牧等方面均有广泛的用途。
但是，FITC通常需要偶联在抗体等检测分子上才能使用，无法单独用于生物材料的检测。因此，期望能够有一种可以直接与生物材料中氨基酸连接，并能够实现荧光检测的新型标记物质。
发明内容
针对此问题，本发明提供了一种新型的异硫氰酸荧光素衍生物的制备方法。此方法所制备出的异硫氰酸荧光素衍生物可以直接与生物材料中氨基酸连接，由此形成异硫氰酸荧光素衍生物标记的生物分子，进而实现对生物材料的检测。
一方面，本发明提供了一种制备下式化合物9所示的异硫氰酸荧光素衍生物的方法，
Figure GDA0003185974340000011
其包括以下步骤：
(i)在-78℃下，加入化合物3和四氢呋喃溶剂，相同温度下，滴加正丁基锂；1小时后，加入二甲基二硫醚，将温度升至室温反应，反应结束后，旋蒸除去溶剂，过柱分离纯化，得到如下所示的化合物4；
Figure GDA0003185974340000021
(ii)将如下所示的化合物5a溶于乙酸/水溶剂，并在0℃下加入亚硝酸钠，反应15分钟后加入叠氮化钠，并继续反应2小时，反应结束后，旋蒸除去溶剂，并2M的盐酸和水相继洗涤粗产品，过柱分离纯化，可得到化合物5；
Figure GDA0003185974340000022
(iii)在1,5-环辛二烯氯化铱二聚体催化和氮气保护下，使化合物5与化合物4在室温反应12小时，得到如化合物9所示的异硫氰酸荧光素衍生物。
在一个实施方式中，在步骤(i)中，化合物3、正丁基锂和二甲基二硫醚的摩尔当量比为1:2:1。。
在一个实施方式中，在步骤(ii)中，化合物5a、亚硝酸钠和叠氮化钠的摩尔当量比为1:1.5:2。
在一个实施方式中，在步骤(iii)中，化合物5、化合物4和1,5-环辛二烯氯化铱二聚体的摩尔当量比为2:2:1。
在一个实施方式中，所述方法进一步包括对反应后的分离纯化步骤。
在一个实施方式中，所述分离纯化步骤使用柱层析进行。
另一方面，本发明提供了一种制备下式化合物4的方法，
Figure GDA0003185974340000023
其包括以下步骤：
(i)将如下所示的化合物3a、碳酸钾和炔丙基溴混合并反应，得到如下所示的化合物3；
Figure GDA0003185974340000031
(ii)在-78℃下，加入化合物3和四氢呋喃溶剂，相同温度下，滴加正丁基锂，1小时后，加入二甲基二硫醚，将温度升至室温反应，反应结束后，旋蒸除去溶剂，过柱分离纯化，得到如下所示的化合物4，
Figure GDA0003185974340000032
在一个实施方式中，在步骤(i)中，化合物3a、碳酸钾和炔丙基溴的摩尔当量比为3:1:2。
在一个实施方式中，在步骤(ii)中，化合物1、正丁基锂和二甲基二硫醚的摩尔当量比为1:2:1。
在一个实施方式中，所述方法进一步包括对反应后的分离纯化步骤。
在一个实施方式中，所述分离纯化步骤使用柱层析进行。
另一方面，本发明提供了一种以下的异硫氰酸荧光素衍生物，
Figure GDA0003185974340000033
另一方面，本发明提供了一种以下的化合物，
Figure GDA0003185974340000034
另一方面，本发明提供了一种以下的异硫氰酸荧光素衍生物在制备荧光标记物中的用途：
Figure GDA0003185974340000041
在一个实施方式中，所述荧光标记物可以与氨基酸结合，优选与酪氨酸结合。
在一个实施方式中，在辣根过氧化物酶催化下，所述荧光标记物与氨基酸结合，优选与酪氨酸结合。
另一方面，本发明提供了一种荧光检测试剂盒，其包含选自以下的异硫氰酸荧光素衍生物：
Figure GDA0003185974340000042
在一个实施方式中，所述试剂盒进一步包括辣根过氧化物酶，以及可选地使用说明书。
现有技术中尚未报道本发明的异硫氰酸荧光素衍生物及其制备方法。本发明制备方法所制备出的异硫氰酸荧光素衍生物可以直接与生物材料中氨基酸(例如酪氨酸)反应生成异硫氰酸荧光素衍生物标记的生物分子。这极大的方便了生物材料的荧光检测。而且，本发明方法制备出的异硫氰酸荧光素衍生物结构稳定，发光效果好。此外，本发明的制备异硫氰酸荧光素衍生物的方法方便简单，特异性高，产物纯度高。
而且，化合物4是制备化合物9的一种中间体，此中间体的结构及其制备方法尚未报道。由此中间体制备的化合物9结构稳定，发光效果好。
附图说明
图1:化合物4的NMR谱
图2:化合物9的NMR
图3:化合物9的MS
图4:化合物9的发射光谱(EM)
图5:化合物9的紫外吸收光谱
图6:化合物9和Opal 520TM染色图像对比
其中A和C分别为在一组平行实验中化合物9和Opal 520TM染色图像；
B和D分别为在另一组平行实验中化合物9和Opal 520TM染色图像。
实施例
在本发明中，除非特殊说明，否则反应中所用的原料和试剂均是可以商业购买获得。可商购的化学试剂可由标准商业来源获得，本发明实施例中所用试剂来源包括AldrichChemical、Chemservice Inc.、Fisher Scientific Co.、Fisons Chemicals(Leicestershire UK)、Frontier Scientific(Logan UT)、国药集团化学试剂有限公司、北京化学试剂厂等。
实施例1
化合物3的制备方法
Figure GDA0003185974340000051
将1,4-苯二酚(20mmol)、炔丙基溴(10mmol)、碳酸钾(15mmol)溶于乙腈(50mL)，于50℃下反应过夜。旋蒸除去溶剂，柱层析分离得到目标产物3。
实施例2
化合物4的制备方法
Figure GDA0003185974340000052
100mL圆底烧瓶置换氮气三次。-78℃下加入化合物3(5mmol)、四氢呋喃(20mL)。搅拌均匀后，相同温度下，缓慢滴加正丁基锂(2.5M，己烷，4mL)。滴加完毕后1小时，加入二甲基二硫醚(5mmol)。反应液缓慢升至室温。TLC检测反应完毕后，加水淬灭，萃取，干燥，柱层析分离得到目标产物4。
1H NMR(400MHz，CDCl3):6.78(d,J＝8.0Hz,2H),6.69(d,J＝8.0Hz,2H),4.64(s,2H),2.30(s,3H).
MS m/z(CI)calcd.for C10H10O2S(M)+194.04,found 194.05.
实施例3
化合物5的制备方法
Figure GDA0003185974340000061
将5mmol化合物5-氨基荧光素(购自Aladdin，Lot No.H1801120)溶于100mL乙酸/水(2:1)，并在0℃下加入7.5mmol亚硝酸钠。反应15分钟后加入10mmol叠氮化钠，并继续反应2小时。反应结束后，旋蒸除去溶剂，并200mL浓度为2M的盐酸和1000mL水相继洗涤粗产品。TLC检测反应。通过柱色谱纯化(二氯甲烷：甲醇＝8：1)得到产物5。
实施例4
化合物9的制备方法
Figure GDA0003185974340000062
在充满氮气的手套箱中，向装有磁子的4mL棕瓶中加入化合物5(0.2mmol，74mg，1.0当量)、化合物4(0.2mmol，39mg，1.0当量)，甲醇(2mL)、1,5-环辛二烯氯化铱二聚体(5mg，0.5当量)，室温下搅拌12小时。TLC检测反应。通过柱色谱纯化(二氯甲烷：甲醇＝8：1)得到产物9。
1H NMR(400MHz，MeOH-d4):7.69(s,1H),7.48(d,J＝8.0Hz,2H),7.21(d,J＝8.0Hz,2H),6.67-6.55(m,4H),6.53-6.50(m,4H),5.25(s,2H),2.28(s,3H)。
HRMS m/z(CI)calcd.for C30H22N3O7S(M+H)+568.1179,found 568.1197.
实施例5
化合物9的发射光谱(EM)和紫外吸收光谱的测定
采用ICP发射光谱仪测定化合物9的发射光谱，按照光谱仪手册的方法进行测定。
结果显示在图4中。结果显示，化合物9的发射波长为520nm。
实施例6
采用德国蔡司紫外吸收光谱仪测定化合物9的紫外吸收光谱，按照光谱仪手册的方法进行测定。结果显示在图5中。
结果显示，化合物9可以被有效激发荧光且具有特定的紫外吸收。紫外吸收波长为470nm。
实施例7
化合物9的荧光检测
1.1.1实验试剂
1CD4抗体(ZM0418,中衫金桥)
2Opal 7-色荧光染色试剂盒(Lot Number:2306158)(Boston,MA,02118USA)，主要组成如下：
1)试剂盒组分包括：
a)抗体稀释液和封闭液
b)抗原修复液(pH9.0)
c)1×酪氨酸信号放大液
d)Ms+Rb HRP-二抗
e)DAPI染色剂
3.荧光染料
化合物9作为荧光染料
Figure GDA0003185974340000071
对照：选用美国Opal520 TM染色染料
4.其他常用试剂
无水乙醇(生产厂家国药集团化学试剂有限公司)
二甲苯(生产厂家国药集团化学试剂有限公司)
TritonX-100(生产厂家sigma)
Tween 20(生产厂家sigma)
TBST液(生产厂家北京宝瑞杰科技有限公司)
防淬灭剂(生产厂家北京雷根生物技术有限公司，货号IH0252，Lot0525A17)
1.1.2实验仪器
1，RM2235型石蜡切片机，Leica，德国；
2，电热恒温培养箱，生产厂上海一恒科学仪器有限公司
3，微波炉，生产厂家美的
4，医用离心机，生产厂商安徽中科中佳科学仪器有限公司
5，染色摇床，生产厂商江苏天翎仪器有限公司
6，多光谱成像系统(型号：Vectra，PerkinElmer Boston,MA,02118USA)Inform2.3.0软件。
7，其他常用设备
染色缸、染色架、免疫组化用湿盒、防水笔等
1.1.3实验样本
实验样本
人扁桃体切片
1.1.4研究方法
1.1.4.1免疫荧光检测
催化信使沉积法(CARD，catalyzed reporter deposition)是一种创新的信号放大标记技术。它通过一个分析物依赖性酶激活体系将标记物沉积在固相的分析表面上，而这些标记物可以被直接或间接检测出来。这种方法可以实现检测信号放大和提高检测限。CARD法中可用的可检测标记物有多种类型，如荧光探针，有机染料，化学发光染料等。
本实验采用免疫组织化学基本原理，利用一抗定位抗原，二抗引入辣根过氧化物酶(HRP)，再利用CARD法使得染料结合在抗原上从而实现标记和抗原检测。
实验步骤
以下实验在相同条件下，平行进行两组实验。
1.石蜡切片放置在60℃恒温箱中烘烤120分钟；
2.脱蜡和水化：二甲苯(10min)→二甲苯(10min)→无水乙醇(5min×2次)→95％乙醇(5min×2)→90％(5min)→85％乙醇(5min)→80％乙醇(5min)→75％乙醇(5min)；
3.蒸馏水冲洗2次5min；
4.抗原修复：用试剂盒内抗原修复液微波修复，预热5min，高火2min，中低火15min；
5.室温自然冷却；
6.洗涤：TBST洗3次,5min/次；
7.封闭：用试剂盒内封闭液，室温封闭10min；
8.一抗孵育：滴加一抗CD4(一抗工作液100μl)，37℃孵育1h；
9.洗涤：TBST洗3次,5min/次；
10.二抗孵育：滴加试剂盒内二抗，37℃孵育10min；
11.洗涤：TBST洗3次,5min/次；
12.荧光染色：滴加稀释后的荧光染色100μl(本发明化合物ALP9-0和对照Opal520TM)，室温10min；
13.洗涤：TBST洗3次,5min/次；
14.微波处理：重复步骤4)到步骤6)；
15.DAPI染色，室温5～10min；
16.洗涤：TBST洗3次,5min/次；
17.封固：防淬灭剂封片；
18.连续光谱成像，图像分析定量和统计分析。
附表：抗体染色表
抗体测试表
抗体 CD4 DAPI
货号 ZM0418 —
一抗种属 兔
一抗 100μl —
修复条件 AR9
一抗孵育条件 37℃1hr 5min
染料 Opal520<sup>TM</sup>/ALP9-0 DAPI
1.1.5图像及分析数据示例如下:
染色图像拍摄后，使用Nuance分析软件进行阳性信号分析
染料 *阳性信号平均强度(Scaled counts/s)
Opal520<sup>TM</sup> 0.912
ALP9-0 1.542
*计算方法：两组平行结果，分别统计阳性信号的总强度(Total counts)、阳性信号面积(pixels)和曝光时间(s)，然后再计算平均值。Scaled counts/s＝Total counts/(Pixels*s)
图6中的A和C分别为在一组平行实验中ALP9-0(化合物9)和Opal 520TM染色图像；且B和D分别为在另一组平行实验中ALP9-0(化合物9)和Opal 520TM染色图像。从肉眼观测的图像结果可以看出ALP9-0染料可以与待检测物抗原结合并进行染色，且信号很强。而且，与美国的市售染料Opal 520TM相比，ALP9-0染料的染色信号强度更强，效果更好。
由Nuance分析软件测定计算出的阳性信号平均强度也显示ALP9-0染料的染色信号强度更强。

Claims (6)

1.一种制备下式化合物9所示的异硫氰酸荧光素衍生物的方法，
Figure FDA0003185974330000011
其包括以下步骤：
(i)在-78℃下，加入化合物3和四氢呋喃溶剂，相同温度下，滴加正丁基锂；1小时后，加入二甲基二硫醚，将温度升至室温反应，反应结束后，旋蒸除去溶剂，过柱分离纯化，得到如下所示的化合物4；
Figure FDA0003185974330000012
(ii)将如下所示的化合物5a溶于乙酸/水溶剂，并在0℃下加入亚硝酸钠，反应15分钟后加入叠氮化钠，并继续反应2小时，反应结束后，旋蒸除去溶剂，并用2M的盐酸和水相继洗涤粗产品，过柱分离纯化，可得到化合物5；
Figure FDA0003185974330000013
(iii)在1,5-环辛二烯氯化铱二聚体催化和氮气保护下，使化合物5与化合物4在室温反应12小时，得到如化合物9所示的异硫氰酸荧光素衍生物。
2.如权利要求1所述的方法，其中在步骤(i)中，化合物3、正丁基锂和二甲基二硫醚的摩尔当量比为1:2:1。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中在步骤(ii)中，化合物5a、亚硝酸钠和叠氮化钠的摩尔当量比为1:1.5:2。
4.如权利要求1或2所述的方法，其中在步骤(iii)中，化合物5、化合物4和1,5-环辛二烯氯化铱二聚体的摩尔当量比为2:2:1。
5.如权利要求1或2所述的方法，其中所述方法进一步包括反应后的分离纯化步骤。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述分离纯化步骤使用柱层析进行。
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Title
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Supramolecular Ensembles Formed between Charged Conjugated Polymers and Glycoprobes for the Fluorogenic Recognition of Receptor Proteins;Wei-Tao Dou等;《ACS Appl Mater Interfaces》;20160601;第8卷(第21期);13601-13606 *
一些新荧光探针的合成和荧光性质研究;金池琼;《中国优秀博硕士学位论文全文数据库（硕士） 工程科技I辑》;20060915(第09期);B014-37 *

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