CN112209923A - 一种高选择性检测Cys/Hcy和GSH的近红外荧光探针的合成和应用 - Google Patents

一种高选择性检测Cys/Hcy和GSH的近红外荧光探针的合成和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种检测Cys，Hcy和GSH的荧光探针，属于荧光探针领域。其分子结构如下：

Description

一种高选择性检测Cys/Hcy和GSH的近红外荧光探针的合成和 应用
本发明涉及一种检测Cys/Hcy和GSH的近红外荧光探针JSC-RSH，包括其制备、光物理性质研究及在生物成像领域的应用，属于荧光探针领域。
背景技术
生物硫醇是生物体内含巯基化合物的总称，广泛地存在于生物体内，最具代表性的生物硫醇为三种巯基化合物：半胱氨酸(Cys)、同型半胱氨酸(Hcy)和谷胱甘肽(GSH)。巯基化合物是生物体酶发挥作用后和生理活动中的重要信号分子，同时巯基化合物也可以调节细胞的正常氧化还原状态，在生物体的生理活动中具有重要的功能。生物体内巯基化合物的浓度异常与许多种疾病有关，Cys的缺乏与生长缓慢、肝损伤、毛发褪色、皮肤病、昏睡以及水肿等疾病有关；血浆中Hcy浓度过高与心血管疾病、阿兹海默症和骨质疏松症有关；GSH能够保护机体免受氧化及自由基介导的氧应激损伤，其浓度与白血病、癌症及艾滋病等有关。因此，检测生物体内的生物硫醇对研究细胞功能和进行疾病早期诊断具有重要的意义。相对于其它传统的检测技术，荧光分析法具有操作简单、选择性好、灵敏度高等优点，尤其可以用于细胞及生物活体成像，因此近年来利用荧光探针来检测离子及生物分子的研究受到了广泛的关注。
发明内容
本发明目的在于提供一种检测Cys,Hcy和GSH的近红外荧光探针JSC-RSH，其结构式如下：
Figure BDA0002723748250000011
合成路线如下：
(a)将8-羟基久洛尼定-9-甲醛，3-氰基-4-甲基香豆素和哌啶加入至无水乙醇中。回流1h，将反应液旋干得到固体粗产品。用柱层析法分离得到化合物JSC，技术路线为：
Figure BDA0002723748250000021
(b)将步骤(a)制得的将化合物JSC和三乙胺溶于无水二氯甲烷中，0℃下搅拌30min后，将用无水二氯甲烷溶解的2,4-二硝基苯磺酰氯逐滴加入至反应液中，在0℃下搅拌4h，之后将反应液旋干得到固体粗产品，用柱层析法分离得到探针JSC-RSH，技术路线为：
Figure BDA0002723748250000022
所述步骤(a)中8-羟基久洛尼定-9-甲醛、3-氰基-4-甲基香豆素和哌啶的物质的量比为1：1.2：0.25。
所述步骤(b)中JSC、2,4-二硝基苯磺酰氯和三乙胺的物质的量比为1：1.25：0.25。
所述步骤(a)、(b)中柱层析采用的洗脱剂分别为(V二氯甲烷/V乙酸乙酯＝30/1)和(V石油醚:V二氯甲烷＝1/1)。
本发明的荧光探针测试方法如下，将探针分子溶解在DMSO/PBS(4:1,v/v,10mM,pH＝7.40)中，室温下进行测试。可以对生物硫醇进行定性、定量检测，具体实施方法在实施实例中详细介绍。
本发明的荧光探针的响应机理如下：探针JSC-RSH以2,4-二硝基苯磺酰基(DNBS)为识别基团，由于荧光团与DNBS之间产生光诱导电子转移(PET)过程，荧光被猝灭，所以探针JSC-RSH无荧光。如下图所示，生物硫醇与探针JSC-RSH发生亲核取代反应，DNBS部分从探针分子上脱离并释放出具有近红外荧光的JSC。
本发明的荧光探针JSC-RSH本身无荧光，与Cys/Hcy和GSH响应后得到近红外荧光产物JSC,最大发射波长为679nm。
本发明所述的探针分子合成路线简单，成本较低，生物相容性好，可以实现快速检测生物硫醇。
附图说明
图1为本发明的荧光探针JSC-RSH在氘代氯仿中核磁共振氢谱，横坐标化学位移，纵坐标为强度。
图2为本发明的荧光染料JSC在氘代氯仿中核磁共振氢谱，横坐标化学位移，纵坐标为强度。
图3为本发明的荧光探针(10μM)在DMSO/PBS缓冲液(4:1,v/v,10.0mM,pH＝7.40)中相关分析物的响应(Na+、K+、Cl-、F-、HS-、S2 2-、Glu、Arg、Lys、Tyr、Leu、Pro、Trp、Ser、Thr、Asp、Val、lle、His、Ala、Phe、Met和Gly，浓度为10.0μM)，横坐标为波长，纵坐标为荧光强度。
图4为本申请荧光探针的的响应过程机理图。
具体实施实例
实施例1：染料JSC的合成
将8-羟基久洛尼定-9-甲醛(108.6mg,0.5mmol)，3-氰基-4-甲基香豆素(111.0mg,0.6mmol)和0.0125mmol哌啶加入至5mL无水乙醇中。回流1h，将反应液旋干得到固体粗产品。用柱层析法(硅胶200-300目，淋洗剂：V二氯甲烷/V乙酸乙酯＝30/1)分离得到化合物JSC，暗紫色固体，112.9mg，产率64％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.38(s,1H),8.22(d,J＝26.0Hz,2H),7.84(s,1H),7.65(s,1H),7.53(d,J＝13.8Hz,2H),7.10(d,J＝10.7Hz,2H),6.98(s,1H),3.36(dd,J＝13.6,7.0Hz,4H),2.83(dd,J＝12.3,8.6Hz,4H),2.04-1.96(m,4H).
实施例2：探针JSC-RSH的合成
将化合物JSC(76.8mg,0.2mmol)和0.05mmol三乙胺溶于5mL无水二氯甲烷中，0℃下搅拌30min后，将用3mL无水二氯甲烷溶解的2,4-二硝基苯磺酰氯(66.5mg,0.25mmol)逐滴加入至反应液中，在0℃下搅拌4h，之后将反应液旋干得到固体粗产品，用柱层析法(硅胶200-300目，淋洗剂：V石油醚:V二氯甲烷＝1/1)分离得到探针JSC-RSH，暗紫色固体，88.4mg，产率72％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.38(s,1H),8.22(d,J＝26.0Hz,2H),7.84(s,1H),7.65(s,1H),7.53(d,J＝13.8Hz,2H),7.10(d,J＝10.7Hz,2H),6.98(s,1H),3.36(dd,J＝13.6,7.0Hz,4H),2.83(dd,J＝12.3,8.6Hz,4H),2.04-1.96(m,4H).
实施案例3：本发明荧光探针检测生物硫醇研究
将探针分子溶解在DMSO/PBS(4:1,v/v,10mM,pH＝7.40)中，配制成10μM的溶液，加入Cys/Hcy和GSH三种生物硫醇都可以迅速观测到679nm处的荧光变化。其检测时间较短，可以实现定性、定量检测生物硫醇。

Claims (8)

1.一种检测生物硫醇的近红外荧光探针，其结构为：
Figure FDA0002723748240000011
2.权利要求1所述的荧光探针JSC-RSH的制备方法，其特征在于，步骤如下：
(a)将8-羟基久洛尼定-9-甲醛，3-氰基-4-甲基香豆素和哌啶加入至无水乙醇中。回流1h，将反应液旋干得到固体粗产品。用柱层析法分离得到化合物JSC。
(b)将化合物JSC和三乙胺溶于无水二氯甲烷中，0℃下搅拌30min后，将用无水二氯甲烷溶解的2,4-二硝基苯磺酰氯逐滴加入至反应液中，在0℃下搅拌4h，之后将反应液旋干得到固体粗产品，用柱层析法分离得到探针JSC-RSH。
3.根据权利要求2所述的荧光探针JSC-RSH的制备方法，其特征在于：所述步骤(a)中8-羟基久洛尼定-9-甲醛、3-氰基-4-甲基香豆素和哌啶的物质的量比为1：1.2：0.25。
4.根据权利要求2所述的荧光探针JSC-RSH的制备方法，其特征在于：所述步骤(b)中JSC、2,4-二硝基苯磺酰氯和三乙胺的物质的量比为1：1.25：0.25。
5.根据权利要求2所述的荧光探针JSC-RSH的制备方法，其特征在于：所述步骤(a)、(b)中柱层析采用的洗脱剂分别为(V二氯甲烷/V乙酸乙酯＝30/1)和(V石油醚:V二氯甲烷＝1/1)。
6.权利要求1所述的荧光探针JSC-RSH在制备定量检测生物硫醇的试剂中的应用，其特征在于：室温下，将荧光探针JSC-RSH溶解在pH＝7.4的PBS缓冲溶液中配制成10μM的检测试剂，加入待测样品，观察荧光变化。
7.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述PBS缓冲溶液的浓度为0.01M，PBS缓冲溶液中含有体积分数80％的DMSO。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述应用以在679nm处监测到红光确定待测样品含有Cys/Hcy/GSH。
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