CN108395474A - 一种可见光诱导吡唑偶联苯丙氨酸类化合物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明一种可见光诱导吡唑偶联苯丙氨酸类化合物的方法，在可见光、空气以及光敏剂的共同作用下，苯丙氨酸发生生物正交/共轭/胺化反应，实现了吡唑及其衍生物修饰单个苯丙氨酸残基、含苯丙氨酸残基的多肽以及蛋白质。该方法还可以为多肽/蛋白质提供二次修饰的机会，如利用“点击”反应(“Click”Reaction)连接其他功能分子，如：荧光素、生物素、聚乙二醇、具同位素标记的核磁探针分子以及各种药物分子等。含有吡唑或其衍生物的蛋白质修饰试剂与胰岛素结合后，由于每个结构域之间的空间位阻，胰岛素从不易于人体释放的六聚体快速解离成易于控制血糖的单聚体胰岛素，该方法可应用于糖尿病治疗，值得进一步推广。

Description

一种可见光诱导吡唑偶联苯丙氨酸类化合物的方法
技术领域
本发明属于生物化学领域，涉及一种可见光诱导吡唑偶联苯丙氨酸类化合物的方法。
背景技术
早期的生物共轭技术并不具有完全的化学选择性，使得标记试剂被随机地连接到多个氨基酸残基上，从而导致多肽/蛋白质的标记位点不完全具有特异性。然而，最近的研究结果表明，位点特异性修饰的多肽/蛋白质比随机偶联产物具有更好的药理学性质。同时也已经开发了将“标签”(“tag”)化合物直接连接到多肽和蛋白质的化学方法，但目前的研究仍缺乏普适性或完全的位点选择性。
最近在研究最多的氨基酸残基中，具有芳香族侧链的残基可以进一步分成容易电离的(如组氨酸和酪氨酸)以及不容易电离的(如色氨酸和苯丙氨酸)。值得注意的是，研究表明，在绝大多数的修饰反应中，侧链的pKa不是反应性的唯一预测因子，如色氨酸残基吲哚环可以实现一些官能化即可印证这一论点。
在生物分子中，苯丙氨酸残基是疏水性的，在蛋白质折叠时，倾向于朝向内部，因此，通常苯丙氨酸被认为是难以开发的生物结合位点。同时，由于其天然丰度低(人类蛋白质中含量仅为3.6％)，且其在研发治疗重大疾病药物中扮演了极其重要的角色，因此，研发直接标记苯丙氨酸残基的方法是至关重要的。在传统研究中，可以通过使用预处理的非天然苯丙氨酸(pAcF)和非天然的对叠氮基苯丙氨酸(pAzF)作为原料，通过肟缩合反应或“点击”化学反应(“Click”Reaction)来实现具有位点特异性的生物正交反应，而这种非天然苯丙氨酸的反应需要先用强酸、强氧化剂处理，再利用生物技术接上蛋白质，比较复杂。由于天然苯丙氨酸的氨基酸残基为一个苯基，苯基SP2碳氢键不易被活化，一般需要在高温、重金属、或强氧化剂等条件下才可能反应。所以现在技术中针对天然苯丙氨酸的标记仅有一两例，且都是使用过渡金属铑活化，这类金属具有生物毒性，不适于标记多肽和蛋白质中的苯丙氨酸残基。
在动物体内，胰岛素存在于胰腺的胰岛内并且通常以六聚体形态存在，胰岛素具有平衡血糖水平并且可以将血糖维持在正常范围内的功能。在糖尿病的治疗中，六聚体胰岛素通常作为长效胰岛素药物使用。最近，如赖脯胰岛素(Lispro)、诺和锐(Aspart)和赖谷胰岛素(Gluisine)等。这些胰岛素的突变物可以使胰岛素六聚体表现出不同程度的解离，从而形成单体、二聚体和四聚体等。然而，通过突变或者直接修饰胰岛素N端的策略仍然非常罕见。
发明内容
为了克服现有技术中存在的缺陷，本发明首先提供了一种能够制得具有特定结构特征的苯丙氨酸单体的化学合成方法，通过苯丙氨酸类化合物在可见光、空气及光敏剂的共同作用下的生物正交/共轭/胺化反应，实现了吡唑及其衍生物修饰单个苯丙氨酸残基、含苯丙氨酸残基的多肽以及蛋白质。该方法还可以为多肽/蛋白质提供二次修饰的机会，如利用点击反应连接其他功能分子，如：荧光素、生物素、聚乙二醇以及各种药物分子等。
本发明提供的技术方案具体如下：
一种可见光诱导吡唑环修饰苯丙氨酸类化合物的方法，物质A与物质B在光源、空气、光敏剂的共同作用下进行点击反应，得到吡唑环修饰苯丙氨酸类化合物；所述的光敏剂具有通式(I)所示的结构：
物质A为苯丙氨酸或其衍生物、含有苯丙氨酸残基的多肽或蛋白质；
物质B为吡唑或其衍生物，由生物活性分子、放射性标记分子、荧光标记分子、药物分子或聚合物标记的吡唑；
R1、R2、R3独立地选自H，具有取代基的或未取代的烷基、烯基、炔基、芳基、烷氧基、胺基、烷胺基、羟基、杂环类化合物中的一种。
物质A与物质B的化学反应式为：
其中：C代表吡唑环修饰苯丙氨酸类化合物；
R4、R5、R6、R7、R8、R9独立地选自H，具有取代基的或未取代的烷基、烯基、炔基、芳基、烷氧基、胺基、烷胺基、羟基、杂环类化合物中的一种。
当R4＝R5＝H时，R6选自以下官能团中的一种：
代表连接键。
化合物A代表手性中心为左旋或右旋、或内/外消旋的苯丙氨酸及其衍生物。
所述光源为可见光光源、紫外光源或蓝色LED灯光源。
所述的聚合物选自聚乙二醇、聚亚烷氧基、聚二甲基硅氧烷基、聚胺酯中的一种，所述的生物活性分子选自氨基酸、多肽、生物素、糖类化合物中的一种，所述的荧光标记分子选自荧光素、香豆素、罗丹明中的一种。
一种标记含有苯丙氨酸残基的多肽或蛋白质的方法，包括以下步骤：
(1)首先合成4-乙炔基-1H-吡唑，制备方程如下：
(2)然后通过铜催化叠氮端炔环加成反应合成R标记的吡唑环；反应式为：
其中，R代表生物活性分子、放射性标记分子、荧光标记分子、药物分子、聚合物中的一种；(3)含有苯丙氨酸残基的多肽或蛋白质与R标记的吡唑环在光源、空气、上述光敏剂的共同作用下发生点击反应，得到R标记的多肽或蛋白质。
上述方法在医药品、保健食品、化妆品领域的应用。
所述的物质B选自以下功能分子修饰的吡唑中的一种：
(a)生物素修饰的吡唑
(b)荧光素修饰的吡唑
(c)聚乙二醇修饰的吡唑
(d)糖类修饰的吡唑
(5)具同位素标记的核磁探针分子修饰的吡唑
所述的蛋白质为正常或突变的动物胰岛素，所述的动物胰岛素包括人胰岛素、牛胰岛素和猪胰岛素。包括有生物活性或者用作模型试验的不具有生物活性的多肽或蛋白质。
本发明在可见光、空气以及光敏剂的共同作用下完成光诱导苯丙氨酸的生物正交/共轭/胺化反应。该反应经证明能够作用于苯丙氨酸残基并能完成位点选择性的C(sp2)-H胺化反应，含有吡唑或其衍生物的蛋白质修饰试剂可以与胰岛素结合，由于每个结构域之间的空间位阻，胰岛素从不易于人体释放的六聚体快速解离成易于控制血糖的单聚体胰岛素，该方法可应用于糖尿病治疗，值得进一步推广。
本发明具有以下优点和有益效果：
(1)可见光诱导的吡唑“标签”加上“点击”反应使得苯丙氨酸位点选择性具有了良好的反应性和特异性，为基于这种天然氨基酸的胰岛素官能化提供了直接的方法。
(2)本发明采用的光敏剂中不含金属，生物毒性低，具有广泛的应用前景。
(3)本发明活化含苯基胺酸的生物分子的方法仅需加入缀合物和光敏剂后照蓝色可见光即可，操作方便，条件温和，成本低。
(4)利用吡唑胺化苯丙氨酸生物分子对蛋白质进行标记的方法具有相容性以及有效性，能够标记任何含有苯丙氨酸的多肽和蛋白质。
附图说明
图1展示了实施例2的化学反应式及其制备的几种吡唑-苯丙氨酸化合物的结构式。
图2对比了实施例制备的几种吡唑-苯丙氨酸化合物的ESI-HRMS光谱分析图的理论数据和实验数据；图2(A)代表化合物3a；图2(B)代表化合物3c；图2(C)代表化合物3b；图2(D)代表化合物3e。
图3为吡唑-苯丙氨酸化合物3a的X射线衍射图。
图4展示了制备吡唑修饰的三肽的反应式及产物的ESI-HRMS光谱分析图；图4(A)对比了实施例3产物的理论数据和实验数据；图4(B)对比了实施例4产物的理论数据和实验数据。
图5为两步法将苯丙氨酸三肽(Ac-FVN-OMe)生物素化的示意图及其产物的ESI-HRMS光谱分析图；图5(A)为含苯丙氨酸多肽-吡唑炔烃-生物素的合成示意图；图5(B)为含苯丙氨酸多肽-吡唑炔烃的反应式及其理论数据和实验数据的对比图；图5(C)为合成含苯丙氨酸多肽-吡唑三氮唑-生物素的反应式及其理论数据和实验数据的对比图。
图6为通过MALDI-TOF-MS分析可见光诱导的吡唑标记用于合成吡唑-胰岛素单聚体；图6(A)代表胰岛素，图6(B)代表吡唑-胰岛素，图6(C)为反应液中胰岛素和吡唑-胰岛素含量随反应时间的变化图。
图7为X射线小角衍射图；图7(A)代表三种胰岛素的对比图；图7(B)为吡唑-胰岛素随光照时间的变化图。
图8为可见光诱导吡唑标记胰岛素后离解成单聚体的过程示意图。
图9为可见光诱导吡唑标记胰岛素的对照实验图。
具体实施方式
以下结合实施例进一步描述解释本发明，但这些实施例并非意味着限制本发明的保护范围。在下面的实施例中所涉及的实验材料如无特别说明均可通过市场购得或通过本领域常规的制备方法获得。
实施例1
(1)实验条件选择
在空气气氛中，向乙酰基-L-苯丙氨酸甲酯1a(0.2mmol，1当量，44.2mg)的乙腈/水(1.5mL/1.5mL)溶液中加入吡唑2a(0.3mmol，20.4mg)和2,4,6-三苯基吡喃四氟化硼盐(0.04mmol，20mol％，15.8mg)，在25℃下用3W蓝色LED照射10小时；反应完成后，通过旋转蒸发减压除去溶剂，得到反应混合物，然后通过硅胶柱色谱(淋洗剂为体积比为2:1的己烷：乙酸乙酯混合物)纯化，得到固体产物3a，对从二氯甲烷/己烷中得到的晶体3a进行结构测定。
在以上试验条件的基础上设置对照试验，分别设置无空气条件下、无照光条件下、无光敏剂条件下、无吡唑条件下的对照组，发现分别在无空气、无照光和无光敏剂的条件下皆不发生反应，起始物乙酰基-L-苯丙氨酸甲酯1a也不出现转化现象；而在无吡唑的条件下也不会有目标产物生成，起始物乙酰基-L-苯丙氨酸甲酯1a则出现部分降解现象。
(2)光敏剂的选择
本实施例在蓝色LED作为光源的条件下，采用甲基乙酰基-L-苯丙氨酸(1a)和吡唑(2a)作为模型底物，考察了下列光敏剂(Acr+MesClO4 -，Ir(ppy)3，曙红Y和Ru(bpy3)PF6，2,4,6-三苯基吡喃鎓四氟硼酸盐)对反应的影响。如下表所示，只有2,4,6-三苯基吡喃鎓四氟硼酸盐(TPT+BF4 -)可以触发反应，其他光敏剂皆不反应。考察Acr+MesClO4 -、Ir(ppy)3，曙红Y和Ru(bpy3)PF6和2,4,6-三苯基吡喃鎓四氟硼酸盐(TPT+BF4 -)等光敏剂的氧化还原电位后，发现由于Acr+MesClO4 -、曙红Y和Ru(bpy3)的氧化还原电位太低，除了氧化还原电位高的2,4,6-三苯基吡喃鎓四氟硼酸盐(TPT+BF4 -)外，其他光敏剂在蓝色LED光激发下均不具备氧化苯丙氨酸的能力，不能催化吡唑与苯丙氨酸反应，而在激发态具有强氧化能力的2,4,6-三苯基吡喃鎓四氟硼酸盐则能够催化吡唑与苯丙氨酸反应。
反应方程如下：
表1.光敏剂对反应的影响
实施例2：带有不同官能团(R)的吡唑对反应性的影响
在实施例1所选择的反应条件的基础上，将苯丙氨酸1(0.2mmol，1.0当量)、吡唑或其衍生物2(0.3mmol，3.0当量)投入3mL乙腈/水(1/1)混合溶剂中，再向反应体系中加入2,4,6-三苯基吡喃鎓四氟硼酸盐(0.04mmol，20mol％)，得到对位取代的吡唑结合苯丙氨酸化合物3a(转化率99％)。在室温、蓝色LED作为光源的条件下，考察带有不同官能团(R)的吡唑对反应性的影响：通过X-射线晶体学来确定3a的分子结构，发现芳基取代的吡唑以及不同的供电子或吸电子取代的吡唑(3b-3d)能很好地转化为相应的产物，含有炔基或乙酰基的吡唑(3e和3f)可认为是正交/“点击”反应“手柄”，也能发生光诱导反应并生成对应的产物。通过LC-MS确认起始物苯丙氨酸被转化成相应的胺化产物。
实施例3：模拟在胰岛素上标记吡唑
首先合成三肽(Ac-FVN-OMe)作为模拟胰岛素B链疏水N-末端部分的模型，在Ac-FVN-OMe上标记吡唑：
在空气气氛中，在光敏剂2,4,6-三苯基吡喃四氟化硼盐(10mM)存在下，向三肽Ac-FVN-OMe(3mM)的乙腈/水溶液(1.5mL/1.5mL)中加入吡唑(10mM)，于3W的蓝色LED在25℃反应2小时；反应完成后，得到吡唑标记的Ac-F(Pyr)VN-OMe，产物利用ESI-HRMS进行分析。
实施例4：模拟在胰岛素上标记炔基-吡唑
首先合成三肽(Ac-FVN-OMe)作为模拟胰岛素B链疏水N-末端部分的模型，在Ac-FVN-OMe上标记炔基-吡唑：
4-乙炔基-1H-吡唑的制备方程如下：
将Ac-FVN-OMe(0.02mmol)与4-乙炔基-1H-吡唑(0.3mmol)一同加入乙腈/水(1.5mL/1.5mL)溶液中，然后加入2,4,6-三苯基吡喃四氟化硼盐(0.04mmol，20mol％，15.8mg)，在25℃下用3W蓝色LED进行照射，发生可见光诱导的生物偶联反应，反应10小时后用ESI-HRMS分析产物。ESI-HRMS结果显示，室温下，能够通过可见光诱导的生物偶联反应在Ac-FVN-OMe的苯丙氨酸残基上安装双正交“手柄”，得到4-乙炔基-1H-吡唑标记的三肽Ac-F(Pyr)VN-OMe。
实施例5：模拟在胰岛素上修饰生物素标记的炔基-吡唑
由于生物素标记的胰岛素具有非常高的临床医学应用价值，其会增加胰岛素敏感性并可能有助于降低血糖，继而控制血糖水平，通过引入叠氮-生物素化合物以构建Ac-F(Pyr-生物素)VN-OMe，可使胰岛素进一步生物素化顺利进行。
通过铜催化叠氮端炔环加成(CuAAC)反应合成生物素标记的三肽Ac-F(Pyr-生物素)VN-OMe：
R代表生物素
向生物素-叠氮化物(20mM)的乙腈/水溶液(1.5mL/1.5mL)中加入40mM CuSO4、叠氮端炔环和40mM抗坏血酸钠进行反应，在空气气氛中，在光敏剂2,4,6-三苯基吡喃四氟化硼盐(10mM)存在下，向反应液中加入三肽Ac-FVN-OMe，于室温、3W的蓝色LED条件下搅拌12小时，得到物素标记的三肽Ac-F(Pyr-生物素)VN-OMe，反应10小时后用ESI-HRMS分析产物。在m/z＝523.2284处的炔基吡唑标记的三肽峰(Ac-F(Pyr)VN-OMe)的ESI-HRMS谱和基于同位素丰度的Ac-F(Pyr)VN-OMe的荷质比为m/z＝523.2305。对于“点击”反应产物Ac-F(Pyr-Biotin)VN-OMe，在m/z＝891.3982处显示基峰的ESI-HRMS光谱及其(Ac-F(Pyr-生物素)VN-OMe·CH3OH·Na+)，m/z＝891.3906。
实施例6：可见光诱导吡唑标记猪胰岛素
(1)利用吡唑修饰猪胰岛素
将总共含有51个氨基酸残基(m/z＝5777Da)的游离苯丙氨酸(B1Phe)的天然哺乳动物蛋白质猪胰岛素用作靶蛋白，进行可见光诱导的吡唑偶联反应：
在含有2,4,6-三苯基吡喃四氟化硼盐的乙腈-水溶液(10mM，CH3CN/H2O＝1：1)中加入猪胰岛素(m/z＝5777Da，3mM)和吡唑(10mM)，将其置于室温下照射3w的蓝色LED，反应2小时，通过MALDI-TOF-MS监测可见原猪胰岛素的峰转化为分子量5844Da的吡唑-猪胰岛素。MALDI-TOF-MS数据显示，含有一个N-末端苯丙氨酸的胰岛素的理论分子量为5777Da，通过MALDI-TOF-MS检测发现其实际分子量为5777Da；吡唑修饰的胰岛素的理论分子量为5844Da，通过MALDI-TOF-MS检测的实际分子量为5844Da。
(2)反应体系随时间变化的规律
通过MALDI-TOF-MS监测反应混合物发现：在吡唑偶联胰岛素的反应过程中，胰岛素的峰值随时间逐渐降低并最终消失，同时目标产物的峰值出现并逐渐升高。该结果表明，可见光能够诱导胰岛素和吡唑发生生物偶联反应，将胰岛素迅速转化成吡唑修饰的胰岛素，该反应可以在前10分钟内发生且在120分钟内完成。
(3)吡唑修饰的胰岛素的结构
利用小角X射线散射技术研究生物共轭胰岛素溶液中吡唑修饰的胰岛素的真正基元，发现吡唑修饰的胰岛素与胰岛素六聚体分离，并成为与胰岛素单体结构相同的吡唑修饰的胰岛素单体。
(4)吡唑修饰的胰岛素单体稳定性测试
室温存放2小时和10小时后，反应液中的吡唑修饰的胰岛素单体仍与胰岛素单体结构结构保持一致。
将吡唑修饰的胰岛素单体密封在含有空气的小瓶中，4℃贮存一个月，吡唑修饰的胰岛素单体仍与胰岛素单体结构结构保持一致。

Claims (10)

1.一种可见光诱导吡唑环修饰苯丙氨酸类化合物的方法，其特征在于：物质A与物质B在光源、空气、光敏剂的共同作用下进行点击反应，得到吡唑环修饰苯丙氨酸类化合物；所述的光敏剂具有通式(I)所示的结构：
物质A为苯丙氨酸或其衍生物、含有苯丙氨酸残基的多肽或蛋白质；
物质B为吡唑或其衍生物，由生物活性分子、放射性标记分子、荧光标记分子、药物分子或聚合物标记的吡唑；
R1、R2、R3独立地选自H，具有取代基的或未取代的烷基、烯基、炔基、芳基、烷氧基、胺基、烷胺基、羟基、杂环类化合物中的一种。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，物质A与物质B的化学反应式为：
其中：C代表吡唑环修饰苯丙氨酸类化合物；
R4、R5、R6、R7、R8、R9独立地选自H，具有取代基的或未取代的烷基、烯基、炔基、芳基、烷氧基、胺基、烷胺基、羟基、杂环类化合物中的一种。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：当R4＝R5＝H时，R6选自以下官能团中的一种：
代表连接键。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：化合物A代表手性中心为左旋或右旋、或内/外消旋的苯丙氨酸及其衍生物。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述光源为可见光光源、紫外光源或蓝色LED灯光源。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的聚合物选自聚乙二醇、聚亚烷氧基、聚二甲基硅氧烷基、聚胺酯中的一种，所述的生物活性分子选自氨基酸、多肽、生物素、糖类化合物中的一种，所述的荧光标记分子选自荧光素、香豆素、罗丹明中的一种。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的物质B选自以下物质中的一种：
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的蛋白质为正常或突变的动物胰岛素。
9.一种标记含有苯丙氨酸残基的多肽或蛋白质的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)首先合成4-乙炔基-1H-吡唑，制备方程如下：
(2)然后通过铜催化叠氮端炔环加成反应合成R标记的吡唑环；反应式为：
其中，R代表生物活性分子、放射性标记分子、荧光标记分子、药物分子、聚合物中的一种；
(3)含有苯丙氨酸残基的多肽或蛋白质与R标记的吡唑环在光源、空气、权利要求1中所述的光敏剂的共同作用下发生点击反应，得到R标记的多肽或蛋白质。
10.权利要求1所述的方法在医药品、保健食品、化妆品领域的应用。
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