CN107746367A - β‑石竹烯衍生物及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种β‑石竹烯衍生物及其制备方法与应用。本发明所提供的β‑石竹烯衍生物的结构通式如式I所示，其中，R选自下述任意一种基团：羟基、氨基、酯基和酰胺基。本发明的发明人通过实验验证了：该反应子具有良好的反应性，稳定性，原料易得性，同时具有一定的反应速率。在相应的蛋白标记和细胞标记实验中证明了本反应子的应用性，为相关的生物正交反应子开发提供了新的思路。
Description
技术领域
本发明涉及一种β-石竹烯衍生物及其制备方法与应用。
背景技术
近年来，生物正交反应在生物大分子(包括蛋白质、核酸、糖类等)的结构、功能和相互作用的研究，尤其是对这些生物大分子在活细胞内实时追踪方面取得了很大的发展[J.A.Prescher and C.R.Bertozzi,Nature chemical biology 2005,1,13-21.]。生物正交反应(Bioorthogonal reaction)是指可以在生物体内的生理条件下发生，不会与体内同时发生的其他生化反应互相干扰，也不会对生物体和目标生物分子产生损伤的化学反应[E.M.Sletten and C.R.Bertozzi,Angewandte Chemie International Edition 2009,48,6974-6998.]。评价生物正交反应的主要因素是反应子的活性高低和稳定性好坏；此外，反应子原料是否廉价，是否容易制备，也是在应用时被考虑的问题[R.K.Lim and Q.Lin,Chemical Communications 2010,46,1589-1600.]。Bertozzi提出基于环张力驱动的叠氮-环辛炔(3+2)反应是本领域一个重大突破[N.J.Agard,J.A.Prescher and C.R.Bertozzi,Journal of the American Chemical Society 2004,126,15046-15047.]，近年来几乎所有的生物正交反应都是基于环张力驱动的，特别是1.3偶极环加成反应和逆电子需求狄尔斯-阿尔德反应。(见图1)
缺电子双烯体四嗪参与的逆电子需求的狄尔斯-阿尔德反应已经被广泛研究，该反应选择性好，高效，无需催化剂[M.L.Blackman,M.Royzen and J.M.Fox,Journal of theAmerican Chemical Society 2008,130,13518-13519.]。亲双烯体引入环张力通常作为提升反应性的常用策略，诸如反应子反式环辛烯(trans-cyclooctene，TCO),降冰片烯(norbornen，NB),(bicyclononyne,BCN),酰基氮杂环丁烯(acylazetine),环丙烯(cyclopropenes)。反式环辛烯是所有反应子中速率最快的，然而其代谢稳定性较差，与生物体内基团反应的潜在活性使应用仍存在问题。小环体系如酰基氮杂环丁烯，环丙烯体系又存在合成不简便的缺点。因此，寻找一个在反应活性，稳定性，生物相容性和易制备方面存在一个平衡的亲双烯体组分，具有很大的研究价值。
天然产物是药物活性结构的主要来源，但是在生物正交反应领域还缺乏相应的应用。在IEDDA的研究中，sauer报道了亲双烯体常常使用张力烯烃环丙烯，环丁烯，降冰片烯，反式环辛烯等张力体系[F.Thalhammer,U.Wallfahrer and J.Sauer,Tetrahedronletters 1990,31,6851-6854.]。在这些研究中，反式环壬烯的作用常常被忽
天然产物β-石竹烯是一种双环倍半萜类化合物，具有天然存在的四九反式并环结构，该化合物从丁香叶油、丁香茎油、肉桂叶油等分离而得，分布广泛且廉价(1290CNY/500ML)，常用作食用香料[O.V.Larionov and E.Corey,Journal of the AmericanChemical Society 2008,130,2954-2955.]。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种β-石竹烯衍生物。
本发明所提供的β-石竹烯衍生物的结构通式如式I所示。
其中，R选自下述任意一种基团：羟基、氨基、酯基和酰胺基。
本发明还提供了上述式I所示化合物的制备方法。
式I所示化合物中R＝羟基的化合物的制备方法，包括下述步骤：
1)在碱存在下，使化合物1β-石竹烯与mCPBA(间氯过氧苯甲酸)进行反应，得到化合物7；
2)在惰性气氛中，使化合物7和9-BBN(9-硼双环[3.3.1]壬烷)进行反应1，然后向其中加入NaOH和H2O2进行反应2，得到化合物8；
3)将化合物8、咪唑和TBSCl(叔丁基二甲基氯硅烷)进行反应，得到化合物9；
4)将化合物9在锌铜偶的作用下进行还原反应，然后加入TBAF(四丁基氟化铵)脱除硅烷保护基，得到式I所示化合物中R＝羟基的化合物，即化合物11。
上述步骤1)中，所述反应在溶剂中进行，所述溶剂可为二氯甲烷(DCM)；所述β-石竹烯与mCPBA的摩尔比为1：1.5。所述反应的反应温度为室温，反应时间为2-5小时。
所述碱具体可为NaHCO3。
所述步骤1)中反应结束后，还包括下述步骤：用质量浓度为10-15％的NaOH溶液淬灭反应，有机相用饱和食盐水洗涤，所得有机相用无水硫酸钠干燥。
上述步骤2)中，所述反应在溶剂中进行，所述溶剂可为四氢呋喃(THF)；
所述化合物7和9-BBN的摩尔比为1：1.5。
所述反应1的反应温度为0℃，反应时间为8-12小时。
所述NaOH的加入量为每mmol化合物7加入1.6ml；所述H2O2的加入量为每mmol化合物7加入1.6ml。
所述反应2的反应温度为室温，反应时间为2-4小时。
所述步骤2)中反应2结束后，还包括下述步骤：减压悬干部分溶剂后，加入二氯甲烷，有机相用二氯甲烷萃取，所得有机相使用无水硫酸钠干燥，柱色谱分离。
所述柱色谱分离中采用的洗脱液为石油醚和乙酸乙酯按照体积比4:1混合的混合溶剂。
上述步骤3)中，所述反应在溶剂中进行，所述溶剂可为二氯甲烷(DCM)；
所述化合物8、咪唑和TBSCl的摩尔比为1：2：1.2。
所述反应的反应温度为室温，反应时间为10-20小时。
所述步骤3)中反应结束后，还包括下述步骤：溶剂减压悬干，柱色谱分离。
所述柱色谱分离中采用的洗脱液为石油醚和乙酸乙酯按照体积比4:1混合的混合溶剂。
上述步骤4)中，所述反应在溶剂中进行，所述溶剂可为乙醇。
所述化合物9与锌铜偶的摩尔比为1：20-50；所述还原反应条件为：加热回流48-72小时。
所述TBAF的加入量为每mmol化合物9加入5-10mmol。
所述步骤4)中脱除硅烷保护基后，还包括下述步骤：减压悬干溶剂，使用质量分数为10％AgNO3活化的硅胶柱层析分离。所述硅胶柱层析分离中采用的洗脱液为：石油醚和乙酸乙酯按照体积比4:1混合的混合溶剂。
式I所示化合物中R＝氨基的化合物的制备方法，包括下述步骤：
将式I所示化合物中R＝羟基的化合物与甲磺酰氯反应使羟基活化，然后再用叠氮钠取代生成叠氮，最后用三苯基膦还原，得到式I所示化合物中R＝氨基的化合物。
式I所示化合物中R＝酯基的化合物的制备方法，包括下述步骤：
将式I所示化合物中R＝羟基的化合物与相应的羰基化合物进行取代反应，得到式I所示化合物中R＝酯基的化合物。
R＝酰胺基的化合物制备方法和使用类比于R＝酯基的化合物。使用R＝氨基的化合物与相应的羰基化合物进行取代反应，得到式I所示化合物中R＝酰胺基的化合物。
本发明的再一个目的是提供上述式I所示β-石竹烯衍生物的应用。
本发明所提供的应用是式I所示β-石竹烯衍生物作为生物正交反应子在逆电子需求的狄尔斯-阿尔德反应(IEDDA)中的应用。
所述逆电子需求的狄尔斯-阿尔德反应具体为缺电子双烯体四嗪参与的逆电子需求的狄尔斯-阿尔德反应。
本发明的发明人通过实验验证了，该反应子具有良好的反应性，稳定性，原料易得性，同时具有一定的反应速率。在相应的蛋白标记和细胞标记实验中证明了本反应子的应用性，为相关的生物正交反应子开发提供了新的思路。
对于本发明，功能基团为β-石竹烯反式四九元环母核，R＝羟基以及由此制成的活化酯起到生物标记分子连接作用，由此可以类比得出在羟基，酯基处使用氨基以及类似的制备成酰胺基团同样可以起到相同的生物标记分子连接作用；同时从羟基底物也可以经过简单反应步骤衍生化得到氨基底物，所以该化合物同样属于本发明的保护范围。
附图说明
图1为背景技术中逆电子需求D-A反应中常见的亲双烯体反应子。
图2为实施例1制备化合物6及中间体5的反应流程图(β-石竹烯与四嗪反应的机理)。
图3为实施例2制备化合物12的反应流程图。
图4为实施例3中β-石竹烯及其衍生物的细胞毒性测试结果图。
图5为实施例4中β-石竹烯衍生物分别在存在巯基，氨基，强酸强碱的条件下处理的核磁监测结果图。
图6为β-石竹烯与化合物2在甲醇：水＝9；1混合溶剂中反应二级动力学常数测定。
图7为β-石竹烯衍生物与化合物2在甲醇：水＝9；1混合溶剂中反应二级动力学常数测定。
图8为β-石竹烯衍生物对BSA蛋白进行修饰后做使用荧光染料对蛋白标记免疫印迹法效果图。
图9为β-石竹烯衍生物对BSA蛋白进行修饰后做使用生物素对蛋白标记免疫印迹法效果图。
图10为β-石竹烯衍生物对BSA蛋白进行修饰后使用荧光染料对蛋白标记时间依赖性效果图。
图11为β-石竹烯衍生物对BSA蛋白进行修饰后使用荧光染料对蛋白标记浓度依赖性效果图。
图12为实施例9中的细胞标记模式图。
图13为实施例9中激光扫描共焦显微镜技术拍摄的SKBR3人乳腺癌细胞在使用β-石竹烯修饰过的曲妥珠单抗预孵育后使用四嗪-Cy5荧光探针标记:d)β-石竹烯修饰过的曲妥珠单抗预孵育后使用四嗪-Cy5荧光探针标记e)普通曲妥珠单抗预孵育后使用四嗪-Cy5荧光探针标记f)四嗪-Cy5荧光探针标记。
图14为实施例9中使用流式细胞术定量得到的标记结果图。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明的方法进行说明，但本发明并不局限于此，凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、
反应流程图见图2。
中间体
(6aR,8aS)-1-methoxy-4a,7,7-trimethyl-9-methylene-1,4-di(pyridin-2-yl)-2,4a,5,6,6a,7,8,8a,9,10,11,11a-dodecahydro-1H-cyclobuta[5,6]cyclonona[1,2-d]pyridazine(5)的合成
反应流程图见图2。
将化合物1β-石竹烯(33.7mg,0.165mmol)溶于干燥甲醇溶液(3ml)中，室温下向其中加入四嗪化合物2(35.3mg，0.150mmol).室温下搅拌四小时，黄色褪去，表明四嗪原料消耗完毕。减压下悬干溶剂，残余物通过柱色谱分离(二氯甲烷：甲醇＝20：1，v/v)，得到淡黄色油状液体53.2mg。
结构确证数据：1H NMR(400MHz,MeOD)δ8.61(dd,J＝4.9,0.9Hz,1H),8.55(d,J＝4.5Hz,1H),7.90–7.85(m,2H),7.73(d,J＝8.0Hz,1H),7.46–7.43(m,1H),7.42–7.38(m,2H),4.94(s,1H),4.63(s,1H),3.27(dd,J＝9.0,2.1Hz,1H),2.98(s,3H),2.35(dd,J＝17.8,9.8Hz,1H),1.99–1.91(m,1H),1.91–1.86(m,1H),1.85–1.80(m,1H),1.78(d,J＝10.5Hz,1H),1.71–1.59(m,2H),1.52(dd,J＝10.4,7.8Hz,1H),1.48–1.37(m,2H),1.29–1.17(m,2H),1.02(s,3H),0.97(s,3H),0.96(s,3H).13C NMR(101MHz,MeOD)δ159.29,157.53,155.08,152.36,149.27,138.55,137.65,126.70,124.95,124.65,124.42,111.03,101.38,93.31,59.81,50.37,44.36,43.98,39.46,39.12,37.51,37.09,35.36,30.20,25.77,25.39,22.17,18.99.
化合物
(6aR,8aS)-4a,7,7-trimethyl-9-methylene-1,4-di(pyridin-2-yl)-4a,5,6,6a,7,8,8a,9,10,11-de cahydro-2H-cyclobuta[5,6]cyclonona[1,2-d]pyridazine(6)的合成
将化合物1β-石竹烯(33.7mg,0.165mmol)溶于干燥甲醇溶液(3ml)中，室温下向其中加入四嗪化合物2(35.3mg,0.150mmol).室温下搅拌四小时，黄色褪去，表明四嗪原料消耗完毕，在甲醇溶液中继续搅拌3天，减压下悬干溶剂，残余物通过柱色谱分离(二氯甲烷：甲醇＝20：1，v/v)，得到淡黄色固体63.9mg，产率96％。
结构确证数据：1H NMR(400MHz,MeOD)δ8.61(d,J＝4.8Hz,1H),8.47(d,J＝4.5Hz,1H),7.90(td,J＝7.7,1.7Hz,1H),7.76–7.66(m,2H),7.59(d,J＝7.8Hz,1H),7.41(dd,J＝6.7,5.0Hz,1H),7.28–7.18(m,1H),5.49(s,1H),4.63(s,1H),4.42(s,1H),2.99–2.88(m,1H),2.78(td,J＝12.0,4.1Hz,1H),2.52(ddd,J＝14.4,5.5,2.0Hz,1H),2.49–2.41(m,1H),2.05(m,1H),1.99(m,2H),1.78–1.66(m,1H),1.61–1.57(m,1H),1.55(s,3H),1.44(d,J＝10.2Hz,1H),1.41–1.36(m,1H),1.36–1.30(m,1H),1.07(s,3H),0.93(s,3H).13C NMR(101MHz,MeOD)δ159.24,155.93,155.38,150.12,148.59,145.29,138.35,137.23,133.87,125.98,124.52,124.40,123.38,116.25,111.17,54.79,47.46,44.67,41.70,39.33,36.06,34.95,34.91，30.78，29.01，28.02，27.47，22.18.
发明人以β-石竹烯1作为模型底物，进行了相应的模型研究。β-石竹烯-四嗪发生逆电子D-A反应，结构经过释放一分子氮气使反应进行下去。反应在质子性溶剂中具有更快的反应速率，捕捉到的中间体5证明了这一点。
实施例2化合物12的合成
化合物(4R,6R)-4,12,12-trimethyl-9-methylene-5-oxatricyclo[8.2.0.04,6]dodecane(7)的合成
其反应流程图见图3
将化合物1β-石竹烯(5.5ml,5g,24.45mol)溶于干燥的二氯甲烷溶液(35ml)中，室温下加入15％的NaHCO3(68ml)，搅拌均匀后缓慢加入mCPBA(7.4g,36.675mmol)，搅拌两小时后，用15％NaOH溶液(100ml)淬灭反应，有机相用饱和食盐水洗涤(100ml×3)，所得有机相用无水硫酸钠干燥，重结晶得到白色固体3.48g(化合物7)，产率66％。
结构确证数据：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.97(s,1H),4.86(s,1H),2.88(dd,J＝10.6,4.2Hz,1H),2.62(dd,J＝18.8,9.5Hz,1H),2.34(ddd,J＝12.6,8.1,4.4Hz,1H),2.25(ddd,J＝16.7,8.1,4.3Hz,1H),2.15–2.05(m,2H),1.76(t,J＝9.9Hz,1H),1.67(d,J＝8.3Hz,1H),1.65–1.61(m,2H),1.49–1.27(m,3H),1.20(s,3H),1.01(s,3H),0.98(s,3H).13CNMR(101MHz,CDCl3)δ152.00,112.90,63.90,59.96,50.92,48.89,39.92,39.31,34.17,30.35,30.04,29.96,27.36,21.77,17.15.
化合物
((1R，4R，6R，9S，10S)-4，12，12-trimethyl-5-oxatricyclo[8.2.0.04,6]dodecan-9-yl)methanol(8)的合成
氮气保护条件下，将化合物7(1.388g,6.30mmol)溶于干燥THF溶液(20ml)中，冰浴中使用注射器缓慢滴加9-BBN(0.5M in THF,18.9ml,9.45mmol)，冰浴搅拌8小时，缓慢加入10％NaOH溶液(10.3ml)，H2O2溶液(30％in H2O,10.3ml)室温搅拌2小时，减压悬干部分THF后，加入二氯甲烷(30ml),有机相用二氯甲烷萃取3次(30ml×3)，所得有机相使用无水硫酸钠干燥，柱色谱分离(石油醚：乙酸乙酯＝4:1。v/v)，得到白色固体1.356g,收率90％。
结构确证数据：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ3.55(dt,J＝9.9,3.8Hz,1H),3.27(td,J＝10.3,6.9Hz,1H),3.01(dd,J＝9.7,5.2Hz,1H),2.11(ddd,J＝12.8,4.2,2.6Hz,1H),2.06–1.92(m,2H),1.87–1.72(m,2H),1.64(dt,J＝15.0,3.9Hz,1H),1.55(t,J＝9.1Hz,1H),1.50–1.38(m,4H),1.38–1.31(m,2H),1.27(s,3H),1.00(td,J＝13.2,3.2Hz,1H),0.93(s,3H),0.92(s,3H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ66.44,61.74,59.53,53.15,46.21,45.61,40.70,39.65,34.18,30.03,29.85,28.16,27.89,21.97,16.39.
化合物
tert-butyldimethyl(((1R,4R,6R,9S,10S)-4,12,12-trimethyl-5-oxatricyclo[8.2.0.04,6]dodec an-9-yl)methoxy)silane(9)的合成
将化合物8(1.356g,5.69mmol)溶于干燥二氯甲烷溶液(18ml)中，室温条件下，加入化合物咪唑(774.7mg,11.38mmol)，TBSCl(943.5mg，6.26mmol)，室温下搅拌10小时，溶剂减压悬干，柱色谱分离(石油醚：乙酸乙酯＝4:1)，得到白色固体1.614g,收率82％。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ3.51–3.45(m,1H),3.15(dd,J＝9.4,7.9Hz,1H),3.01(dd,J＝9.8,5.0Hz,1H),2.09(dd,J＝4.3,2.6Hz,1H),2.01–1.91(m,2H),1.79–1.68(m,2H),1.66–1.63(m,1H),1.61(t,J＝3.9Hz,1H),1.53(t,J＝9.0Hz,1H),1.49–1.41(m,2H)，1.40–1.32(m，2H)，1.31(s，1H)，1.27(s，3H)，1.02(dd，J＝12.7，2.9Hz，1H)，0.92(s3H),0.91(s,3H),0.88(s,9H),0.02(d,J＝1.2Hz,6H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ66.17,61.98,59.52,53.10,46.38,45.79,40.79,39.68,34.26,30.03,29.74,28.17,27.93,26.03,25.99,21.99,16.44,-5.18,-5.29.
化合物((1S,2S,9R,E)-6,10,10-trimethylbicyclo[7.2.0]undec-5-en-2-yl)methanol(11)的合成
将化合物9(1.614g,4.58mmol)溶于干燥乙醇溶液(27ml)中，加入活化的锌铜偶(11.8g,91.5mmol)，加热回流3天。使用硅藻土过滤后，悬干溶剂，得到油状液体1.476g，不经分离纯化，直接加入TBAF(1.0M in THF,39.3ml)，搅拌3小时，减压悬干溶剂，使用10％AgNO3活化的硅胶柱层析分离(石油醚：乙酸乙酯＝4：1洗脱剂共200ml，纯乙酸乙酯200ml)。得到白色针状固体700mg，两步总收率为69％。
结构确证数据：`H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.50(s,1H),3.51(d,J＝9.8Hz,1H),3.29(s,1H),2.35(br s,1H),2.04(m,1H),1.95(m,1H),1.72(m,4H),1.63(s,3H),1.53–1.46(m,2H),1.43–1.36(m,2H),1.29(m,2H),1.25(s,1H),0.93(s,3H),0.91(s,3H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ136.76,122.86,66.91,54.06,47.36,45.77,40.67,40.46,33.34,33.01,30.18,29.94,29.83,26.49,22.66,16.41.
化合物
2,5-dioxopyrrolidin-1-yl(((1S,2S,9R,E)-6,10,10-trimethylbicyclo[7.2.0]undec-5-en-2-yl)methyl)carbonate(12)的合成
将化合物11(10.0mg,0.045mmol)溶于干燥乙腈溶液(1ml)，室温下分别加入DSC(N,N'-二琥珀酰亚胺基碳酸酯)(17.2mg,0.067mmol)，三乙胺(0.02ml,0.135mmol)，搅拌过夜。减压悬干溶剂，柱层析分离(石油醚：乙酸乙酯＝2：1)，得到无色油状液体15.9mg，收率97％。
结构确证数据：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.48(s,1H),4.23(d,J＝9.3Hz,1H),3.98(t,J＝7.1Hz,1H),2.83(s,4H),2.35(m,1H),2.05(m,1H),1.95(s,1H),1.77–1.70(m,3H),1.63(s,3H),1.58(m,2H),1.51(m,2H),1.37(m,3H),0.94(s,3H),0.92(s,3H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ168.83,151.87,137.30,122.34,75.97,54.04,45.24,44.09,40.58,40.26,33.37,32.89,30.13,29.84,26.03,25.60,22.57,16.45.
实施例3、β-石竹烯及其衍生物(化合物11)的细胞毒性测试
将Hela细胞使用β-石竹烯和化合物11的不同浓度(5μM,10μM,25μM,50μM,100μM,250μM,500μM)甲醇溶液孵育，经过24小时后使用MTT法测量细胞生存情况，实验结果如图4所示，本实验分别重复了三次。
由图4可知，在最高达到500μm浓度下，细胞的生长仍无明显不良影响，这个实验证明β-石竹烯及其衍生物作为反应子毒性轻微。
实施例4、β-石竹烯衍生物(化合物11)稳定性测试
设计了三个不同的实验测试β-石竹烯衍生物(化合物11)的稳定性。为了检测β-石竹烯衍生物11的稳定性，我们将其配成氘代甲醇溶液，室温下，使用核磁检测其氢谱变化。A)化合物11(6.2mg in 0.6ml,46mM)和L-半胱氨酸甲酯(9.6mg in 0.6ml,92mM)的氘代甲醇(0.6ml)溶液。B)化合物11(6.2mg in 0.8ml,35mM)和三氟乙酸(0.2ml)的氘代甲醇(0.6ml)溶液。C)化合物11(4.8mg in 0.6ml,36mM)和NaOH(13.5mg in 0.6ml,560mM)的氘代甲醇(0.6ml)溶液。所有的样品在混匀后，使用定时核磁监测观察化合物11的变化情况，数据如图5所示。
由图5可知，化合物11没有明显变化，证明了β-石竹烯体系的生物相容性。
实施例5、
一级动力学速率测定
四嗪反应的一级动力学速率kobs通过加入过量的双键测定。测量4-5个不同浓度亲双烯体双键下四嗪2紫外吸收程度变化。kobs使用Originlab 9.0软件的对数函数功能计算紫外吸收曲线变化趋势求出，公式为Y＝(Y0-plateau)*exp(-kobs*time(s))+plateau。
二级速率常数测定
为了测定二级速率常数，将kobs和化合物11的浓度做线性回归，得到的直线方程斜率为二级速率常数k2。实验的严密性使用直线系数R2表示。
四嗪2与11在甲醇中二级速率常数的测定
β-石竹烯衍生物(化合物11)与二吡啶四嗪在甲醇中反应是通过在20℃条件下测量四嗪在535.5nm处的吸光度变化测定二级动力学常数的。二吡啶四嗪与化合物11分别溶于甲醇，混合，开始计时。所得混合溶液四嗪终浓度为2Mm，过量的β-石竹烯衍生物(化合物11)浓度为20，25,30,40Mm。机器设定每30s测定一次吸收数据。所有的实验被重复3次，最终使用Originlab 9.0软件处理数据。
结果如图6所示。β-石竹烯衍生物(化合物11)在纯甲醇中二级动力学常数分别为0.05±0.003。
四嗪2与11在甲醇(90％)-水(10％)溶液中二级速率常数的测定
β-石竹烯衍生物(化合物11)与二吡啶四嗪在甲醇(90％)-水(10％)溶液中反应是通过在20℃条件下测量四嗪在535.5nm处的吸光度变化测定二级动力学常数的。四嗪2与化合物11分别溶于甲醇，混合为甲醇(90％)-水(10％)溶液，开始计时。所得混合溶液四嗪终浓度为2Mm，过量的β-石竹烯衍生物11浓度为20,25,30,35,40Mm。机器设定每30s测定一次吸收数据。所有的实验被重复3次，最终使用Originlab9.0软件处理数据。
结果如图7所示。β-石竹烯衍生物(化合物11)在甲醇-水9/1体系中二级动力学常数为0.09±0.005。
实施例6
本发明还使用化合物11与常见的生物正交反应子5-降冰片烯-2-甲醇进行了速率竞争实验。
用过快速将反应物混合，核磁检测分析产物比例的方法得到反应子的相对速率。将1当量二吡啶四嗪2与1当量5-降冰片烯-2-甲醇，1当量化合物11混合，发现产物比例为1:(1.2+1.7)，计算化合物11的二级反应速率常数。
通过对产物的核磁鉴定，证明本反应子与5-降冰片烯-2-甲醇具有相当的反应性。5-降冰片烯-2-甲醇的二级反应速率常数为2.2±0.1，本反应子二级反应速率常数相当于为0.76±0.1。
尽管本反应子与已报道最快的反应反式环辛烯体系反应性仍有不足，但依然快于施陶丁格反应(k2＝0.25×10-2M-1s-1 in 5％H2O/CH3CN),二氟环辛炔，叠氮参与的张力驱动的1,3偶极环加成反应(k2＝7.6×10-2M-1s-1in CH3CN)和o-甲基喹啉与乙烯基醚的反应(k2＝1.5±0.1×10-3M-1s-1，H2O/CH3CN(5:1))；与降冰片烯参与的IEDDA相当，已经具有足够的应用价值[D.M.Patterson,L.A.Nazarova,B.Xie,D.N.Kamber and J.A.Prescher,Journalof the American Chemical Society 2012,134,18638-18643]。
生物实验部分
实施例7、蛋白修饰实验
使用13(Tz-FITC)和14(Tz-biotin)标记β-石竹烯修饰的BSA蛋白。(A)使用化合物12修饰BSA蛋白上的赖氨酸残基；(B)免疫印迹试验检测H460细胞裂解液溶液环境下对BSA的生物素标记；(C)蛋白印迹法检测标记BSA蛋白荧光的时间依赖性；(D)蛋白印迹法检测标记BSA蛋白荧光的浓度依赖性。对于B-D，蛋白上样通过考马色亮蓝染色法确定。
蛋白标记
为了验证本发明提供的反应子的应用性，我们首先进行了蛋白质修饰实验[Q.Li,T.Dong,X.Liu and X.Lei,Journal of the American Chemical Society 2013,135,4996-4999.]。牛血清蛋白BSA是生物正交验证实验中常见的蛋白。通过标准实验手段将BSA蛋白(10mg/mL)和化合物12(150μM)处理，制备牛血清蛋白复合物。之后将β-石竹烯修饰的BSA蛋白分别使用13或14在25℃条件下处理不同时间。通过对BSA上赖氨酸侧链的修饰，如图(图8A)所示，使用化合物12给蛋白标记上了相应的化学报告基团。免疫印迹法
以十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶制胶，每孔加载等量的蛋白质。电泳后，凝胶转移到硝化纤维素膜上。膜每次使用含有0.1％Tween 20的PBS(PBST)洗涤10分钟。用5％脱脂牛奶溶液封闭1小时，然后用试剂盒(SuperSignalTM West Dura Extended DurationSubstrateanti-biotin,HRP-linked antibody，购自Cell Signaling Technology公司)中辣根过氧化酶标记的biotin抗体处理膜1小时，随后用PBST洗膜3次×10分钟。最后，使用增强的化学发光(GE Healthcare)来观察发光印记。
检测凝胶荧光检测BSA标记情况
化合物12修饰的BSA蛋白样品使用化合物13(1.5-150μM)或者DMSO处理。经过0-90分钟后，修饰的BSA蛋白样品通过使用DC Protein Assay kit(BioRad)处理分析。蛋白样品(5μg)通过凝胶电泳法分离，使用Dual-FL机器检测荧光。荧光在495nm蓝光入射激发，检测537nm绿光激发。总蛋白上样通过考马色亮蓝染色法确定。
通过荧光素探针的实验(图8C,D)发现，该反应具有良好的剂量依赖性和时间依赖性。在细胞裂解液条件下(图8B)进行相应的生物素探针标记，反应成功，同样发现该反应具有非常好的专一性。
实施例8、
β-石竹烯修饰的BSA蛋白在细胞裂解液中稳定性测定
化合物12修饰的BSA蛋白(50μL,4.5mg/mL in PBS)溶液分别加入200μL H460(2mg/mL)或CHO(1.2mg/mL)细胞裂解液，终溶液中修饰BSA蛋白浓度为0.9mg/ml。四嗪14(5μL,27mM.)加入溶液，反应器轻摇0.5小时。
结果如图9所示。由图9可知，经过修饰的BSA蛋白在细胞裂解液中稳定性良好。
IEDDA反应使用β-石竹烯标记BSA蛋白的时间依赖性
化合物12修饰的BSA蛋白(500μL,2mg/mL in PBS)使用四嗪13(即Tz-FITC)(25μL,3mM in DMSO.)分别孵育90,30,15,5,2,1和0分钟，之后加入3,6-吡啶-s-四嗪2(2μL,500mMin DMSO,300equiv.)终止反应。混合物轻摇1小时，以13000转的转速离心2分钟。取出部分溶液(200μL of 2mg/ml)，加入40μL缓冲液(5x)，加热到95摄氏度5分钟，取5.8μL进行SDS-凝胶电泳。检测荧光染料FITC的荧光，凝胶上的总蛋白通过考马色亮蓝染色法确定。
结果如图10所示。由图9可知，经过修饰的BSA蛋白在标记过程有良好的时间依赖性。
IEDDA反应使用β-石竹烯标记BSA蛋白的浓度依赖性
化合物12修饰的BSA蛋白(1000μL,2mg/mL in PBS)使用四嗪13(即Tz-FITC)(25μL,0.03-3mM in DMSO.)分别配成终浓度为1.5,5,15,50and 150μM，轻摇90分钟；之后分别加入3,6-吡啶-s-四嗪2(2μL,5-500mM in DMSO,300equiv.)终止反应。混合物轻摇1小时，以13000转的转速离心2分钟。取出部分溶液(200μL of 2mg/ml)，加入40μL缓冲液(5x)，加热到95摄氏度5分钟，取5.8μL进行SDS-凝胶电泳。检测荧光染料FITC的荧光，凝胶上的总蛋白通过考马色亮蓝染色法确定。
结果如图11所示。由图11可知，经过修饰的BSA蛋白在标记中有良好的浓度依赖性。
实施例9、细胞实验
SKBR-3人乳腺肿瘤细胞使用加入10％胎牛血清蛋白和青霉素-链霉素溶液的DMEM培养液，在含5％二氧化碳培养箱中37℃条件下孵育。
抗体标记
人源抗HER抗原的曲妥珠单抗PBS溶液中加入125μMβ-石竹烯活化酯(化合物12)反应3小时，抗体分离后透析纯化。对照组抗体使用同样来源但不加入β-石竹烯活化酯的PBS缓冲液处理。
细胞标记和显像
标准实验操作(d)SKBR-3人乳腺肿瘤细胞在37℃条件下使用200nm修饰的曲妥珠单抗PBS溶液处理30分钟后，加入10％胎牛血清汉克平衡盐溶液洗两次。随后加入四嗪-Cy5探针终浓度为50μM的10％胎牛血清汉克平衡盐溶液溶液处理30分钟后，加入10％胎牛血清汉克平衡盐溶液洗两次。加入horchest染料染细胞核30分钟，加入10％胎牛血清汉克平衡盐溶液洗两次，使用共聚焦显微镜观察细胞。
结果如图12所示。图中(a)只用PBS处理细胞并用horchest染色；(b)只使用普通曲妥珠单抗处理细胞并用horchest染色；(c)只用修饰的曲妥珠单抗PBS溶液并用horchest染色；(d)使用修饰的曲妥珠单抗处理细胞，加入四嗪-Cy5探针处理，并用horchest染色；(e)使用普通曲妥珠单抗处理细胞，加入四嗪-Cy5探针处理，并用horchest染色；(f)只加入四嗪-Cy5探针处理，并用horchest染色。
相应的实验结果(图3d)与(图3e,3f)相比，(图3d)显示了特异的Cy5信号红色，证明β-石竹烯活化酯(化合物12)在标记到细胞表面后，仍能有效的与四嗪反应，本实验证明本反应子参与的IEDDA反应可以在活细胞体系下进行。
流式细胞术
使用流式细胞术来检测SKBR-3人乳腺肿瘤细胞表面的Cy5探针荧光标记。
结果如图14所示。由图14可知，使用β-石竹烯结构进行抗体细胞标记具有很好的特异性。
Claims (10)
1.结构通式如式I所示的β-石竹烯衍生物：
其中，R选自下述任意一种基团：羟基、氨基、酯基和酰胺基。
2.权利要求1所述式I所示化合物中R＝羟基的化合物的制备方法，包括下述步骤：
1)在碱存在下，使化合物1β-石竹烯与间氯过氧苯甲酸进行反应，得到化合物7；
2)在惰性气氛中，使化合物7和9-硼双环[3.3.1]壬烷进行反应1，然后向其中加入NaOH和H2O2进行反应2，得到化合物8；
3)将化合物8、咪唑和叔丁基二甲基氯硅烷进行反应，得到化合物9；
4)将化合物9在锌铜偶的作用下进行还原反应，然后加入TBAF(四丁基氟化铵)脱除硅烷保护基，得到式I所示化合物中R＝羟基的化合物。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述步骤1)中，所述反应在溶剂中进行，所述溶剂可为二氯甲烷；所述β-石竹烯与间氯过氧苯甲酸的摩尔比为1：1.5。所述反应的反应温度为室温，反应时间为2-5小时；
所述碱为NaHCO3；
所述步骤1)中反应结束后，还包括下述步骤：用质量浓度为10-15％的NaOH溶液淬灭反应，有机相用饱和食盐水洗涤，所得有机相用无水硫酸钠干燥。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于：所述步骤2)中，所述反应在溶剂中进行，所述溶剂为四氢呋喃；
所述化合物7和9-硼双环[3.3.1]壬烷的摩尔比为1：1.5。
所述反应1的反应温度为0℃，反应时间为8-12小时。
所述NaOH的加入量为每mmol化合物7加入1.6ml；所述H2O2的加入量为每mmol化合物7加入1.6ml；
所述反应2的反应温度为室温，反应时间为2-4小时；
所述步骤2)中反应2结束后，还包括下述步骤：减压悬干部分溶剂后，加入二氯甲烷，有机相用二氯甲烷萃取，所得有机相使用无水硫酸钠干燥，柱色谱分离。
5.根据权利要求2-4中任一项所述的方法，其特征在于：所述步骤3)中，所述反应在溶剂中进行，所述溶剂为二氯甲烷；
所述化合物8、咪唑和叔丁基二甲基氯硅烷的摩尔比为1：2：1.2；
所述反应的反应温度为室温，反应时间为10-20小时；
所述步骤3)中反应结束后，还包括下述步骤：溶剂减压悬干，柱色谱分离。
6.根据权利要求2-5中任一项所述的方法，其特征在于：所述步骤4)中，所述反应在溶剂中进行，所述溶剂为乙醇；
所述化合物9与锌铜偶的摩尔比为1：20-50；所述还原反应条件为：加热回流48-72小时。
所述TBAF的加入量为每mmol化合物9加入5-10mmol；
所述步骤4)中脱除硅烷保护基后，还包括下述步骤：减压悬干溶剂，使用质量分数为10％AgNO3活化的硅胶柱层析分离。所述硅胶柱层析分离中采用的洗脱液为：石油醚和乙酸乙酯按照体积比4:1混合的混合溶剂。
7.权利要求1所述式I所示化合物中R＝氨基的化合物的制备方法，包括下述步骤：
将式I所示化合物中R＝羟基的化合物与甲磺酰氯反应使羟基活化，然后再用叠氮钠取代生成叠氮，最后用三苯基膦还原，得到式I所示化合物中R＝氨基的化合物。
8.权利要求1所述式I所示化合物中R＝酯基或R＝酰胺基的化合物的制备方法，包括下述步骤：
将式I所示化合物中R＝羟基或R＝氨基的化合物与相应的羰基化合物进行取代反应，得到式I所示化合物中R＝酯基化合物或R＝酰胺基的化合物。
9.权利要求1所述式I所示化合物作为生物正交反应子在逆电子需求的狄尔斯-阿尔德反应中的应用；
所述逆电子需求的狄尔斯-阿尔德反应为缺电子双烯体四嗪参与的逆电子需求的狄尔斯-阿尔德反应。
10.一种应用于逆电子需求的狄尔斯-阿尔德反应的生物正交反应子，包括权利要求1所述式I所示化合物；
所述逆电子需求的狄尔斯-阿尔德反应为缺电子双烯体四嗪参与的逆电子需求的狄尔斯-阿尔德反应。
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