CN110143966A - 一种螺吡喃-萘酰亚胺衍生物及其合成方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种螺吡喃‑萘酰亚胺衍生物及其合成方法和应用，所述衍生物的中文名称为N‑(2‑(6‑叠氮基‑1,3‑二氧代‑1H‑苯并[de]异喹啉‑2(3H)‑基)乙基)‑3‑(3'，3'‑二甲基‑6‑硝基螺[色烯‑2,2'‑二氢吲哚]‑1'‑基)丙酰胺，英文名称为N‑(2‑(6‑azido‑1,3‑dioxo‑1H‑benzo[de]isoquinolin‑2(3H)‑yl)ethyl)‑3‑(3',3'‑dimethyl‑6‑nitrospiro[chromene‑2,2'‑indolin]‑1'‑yl)propanamide，命名为NSP，该试剂在紫外光照射下可转化为其异构体NMR。检测方法是在pH为7.4的PBS‑C2H5OH(1:1,v/v)的缓冲溶液中，通过荧光分光光度计分别定量地检测硫化氢和二氧化硫的含量。该检测过程简便、灵敏、快速，检测结果准确。

Description

一种螺吡喃-萘酰亚胺衍生物及其合成方法和应用
技术领域
本发明涉及螺吡喃衍生物，具体属于一种螺吡喃-萘酰亚胺衍生物及其合成方法，以及该衍生物在区分检测硫化氢和二氧化硫中的应用。
背景技术
生物体内的活性硫化物(RSS)包括二氧化硫(SO2)，硫化氢(H2S)，生物硫醇(Cys，Hcy和GSH)和多硫化物(RS-SH)等等。内源性的硫化氢已被证实与许多生理和病理过程相关，例如调节血管张力、心肌收缩、神经传导和胰岛素分泌等。细胞异常的硫化氢浓度会引起动脉和肺动脉高压、阿尔茨海默氏症、胃粘膜损伤和肝硬化等疾病。然而，在分子水平的作用机理迄今仍未阐明。此外生物医学研究表明，内源性硫化氢可以在NADPH氧化酶的作用下代谢生成二氧化硫，大量研究表明二氧化硫在心血管系统发挥着重要的作用，能通过抑制Erk/MAPK信号通路抑制血管平滑肌细胞的增殖。除了生理活性外，二氧化硫还具有多种病理活性，如抗菌、抗高血压、抗氧化以及对心肌缺血再灌注损伤的保护作用等，内源性产生的二氧化硫可以增强细胞抗氧化作用，并且在信号传导过程中起重要作用。由于二氧化硫和硫化氢及其相似的生物化学性质，在复杂的细胞生理环境中对二者的区分识别将有助于阐明二者在生理、病理等生命活动过程中的重要作用。
针对以上存在的问题，设计选择性好、灵敏度高、具有低细胞毒性的荧光探针用于区分检测检测活细胞和组织内硫化氢二氧化硫水平变化，已成为当前生物医学发展中具有挑战性的前沿课题之一。
在本发明中，合成了一种基于螺吡喃-萘酰亚胺的化合物，通过探针与硫化氢和二氧化硫在反应前后双通道荧光变化，实现对硫化氢和二氧化硫的区分检测。
发明内容
本发明的目的是提供一种螺吡喃-萘酰亚胺衍生物及其合成方法，以及将该衍生物用于硫化氢和二氧化硫区分检测，且检测方法简单，操作方便，选择性好，灵敏度高。
本发明提供的一种螺吡喃-萘酰亚胺衍生物，中文名称为N-(2-(6-叠氮基-1,3-二氧代-1H-苯并[de]异喹啉-2(3H)-基)乙基)-3-(3'，3'-二甲基-6-硝基螺[色烯-2,2'-二氢吲哚]-1'-基)丙酰胺，英文名称为N-(2-(6-azido-1,3-dioxo-1H-benzo[de]isoquinolin-2(3H)-yl)ethyl)-3-(3',3'-dimethyl-6-nitrospiro[ch romene-2,2'-indolin]-1'-yl)propanamide，命名为NSP，结构式为：
本发明提供的一种螺吡喃-萘酰亚胺衍生物NSP的合成方法，步骤为：
(1)按摩尔比为1：1.5-2.5将2,3,3-三甲基-3H-吲哚和3-溴丙酸在无水乙腈中混合，将混合物在85℃加热反应12小时后，减压除去溶剂，所得残渣用乙醚洗涤三次除去未反应原料，残余物用体积比1:5的二氯甲烷与丙酮重结晶得到浅紫色粉末状产物，即1-(2-羧乙基)-2,3,3-三甲基-3H-吲哚-1-溴化物；
(2)按摩尔比为1：1-1.5将1-(2-羧乙基)-2,3,3-三甲基-3H-吲哚-1-溴化物和5-硝基水杨醛在无水乙醇中混合，混合物在85℃搅拌回流6-8小时，然后冷却至室温，过滤、洗涤、真空干燥得到淡黄色固体，即3-(3'，3'-二甲基-6-亚硝基螺[色烯-2,2'-二氢吲哚]-1'-基)丙酸；
(3)将4-溴-1,8-萘二甲酸酐溶解在N，N-二甲基甲酰胺中，向悬浊液中缓慢滴加叠氮化钠的水溶液，混合物在室温下搅拌回流10小时。反应完成后将混合物倒入冰水混合物，所得沉淀经过滤，洗涤、真空干燥得到淡黄色固体，即4-叠氮基-1,8-萘二甲酸酐,其中4-溴-1,8-萘二甲酸酐和叠氮化钠的摩尔比为1：2-3；
(4)按摩尔比为1：4-5将4-叠氮基-1,8-萘二甲酸酐和乙二胺溶解在无水乙醇中，混合物在85℃搅拌回流12小时，然后冷却至室温，过滤收集滤液减压旋干，以体积比20:1的二氯甲烷和甲醇作洗脱剂经硅胶柱色谱分离，纯化得即2-(2-氨基乙基)-6-叠氮基-1H-苯并[de]异喹啉-1,3(2H)-二酮；
(5)将3-(3'，3'-二甲基-6-亚硝基螺[色烯-2,2'-二氢吲哚]-1'-基)丙酸，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，1-羟基苯并三唑混合溶解于无水N，N-二甲基甲酰胺中，混合物在0℃氩气保护下反应0.5小时，然后向反应体系中加入2-(2-氨基乙基)-6-叠氮基-1H-苯并[de]异喹啉-1,3(2H)-二酮，三乙胺，混合物在室温下反应24小时。反应结束后将混合物倒入冰水混合物，所得沉淀经过滤，洗涤、真空干燥得粗产物，粗产物用体积比30:1的二氯甲烷和甲醇作洗脱剂经硅胶柱色谱分离，得得到浅黄色粉末状目标物N-(2-(6-叠氮基-1,3-二氧代-1H-苯并[de]异喹啉-2(3H)-基)乙基)-3-(3'，3'-二甲基-6-硝基螺[色烯-2,2'-二氢吲哚]-1'-基)丙酰胺(NSP)，其中3-(3'，3'-二甲基-6-亚硝基螺[色烯-2,2'-二氢吲哚]-1'-基)丙酸，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，1-羟基苯并三唑和2-(2-氨基乙基)-6-叠氮基-1H-苯并[de]异喹啉-1,3(2H)-二酮的摩尔比为1：2-3：2-2：0.8-1。
作为优选：
所述的步骤(1)中2,3,3-三甲基-3H-吲哚和3-溴丙酸的摩尔比为1：2。
所述的步骤(2)中1-(2-羧乙基)-2,3,3-三甲基-3H-吲哚-1-溴化物和5-硝基水杨醛的摩尔比为1：1.1。
所述的步骤(3)中4-溴-1,8-萘二甲酸酐和叠氮化钠的摩尔比为1：2。
所述的步骤(4)中4-叠氮基-1,8-萘二甲酸酐和乙二胺的摩尔比为1：4。
所述的步骤(5)中3-(3'，3'-二甲基-6-亚硝基螺[色烯-2,2'-二氢吲哚]-1'-基)丙酸，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，1-羟基苯并三唑和2-(2-氨基乙基)-6-叠氮基-1H-苯并[de]异喹啉-1,3(2H)-二酮的摩尔比为1：2：2：0.8。
本发明合成的NSP可用于硫化氢和二氧化硫检测的区分检测。
本发明提供的一种检测硫化氢的方法，步骤为：
(1)配制pH＝7.4、浓度为10mM的PBS缓冲溶液，用硫化钠配制2mM的硫化氢水溶液，将螺吡喃-萘酰亚胺衍生物NSP溶于DMSO配制成2mM的溶液；
(2)取2mL的C2H5OH/PBS(v/v＝1:1,pH＝7.4)溶液、10μL NSP的DMSO溶液加到一个荧光比色皿中，在荧光分光光度仪上检测，随着待测样硫化氢的加入，540nm处的荧光强度逐渐增强；
(3)用蒸馏水配制2mM的硫化钠溶液，按体积比1:1将PBS缓冲溶液和C2H5OH溶液加到2mL荧光比色皿中，逐渐加入硫化氢溶液的体积为0、10、20、30、40、50、60、70、80、90μL，同时在荧光光谱仪上测定540nm处荧光强度为209、845、1590、2211、2729、3205、3716、4070、4734、5003，以硫化氢浓度为横坐标，以荧光强度F为纵坐标绘制图，得到硫化氢浓度的工作曲线；线性回归方程为：F540＝53.187c+437.745，c的单位为10-6mol/L；
(4)测定样品溶液时，将测得的荧光强度代入线性回归方程，即可求得硫化氢的浓度。
本发明提供的一种检测二氧化硫检测的方法，步骤为：
(1)配制pH＝7.4、浓度为10mM的PBS缓冲溶液，用亚硫酸钠配制2mM的二氧化硫水溶液，将螺吡喃-萘酰亚胺衍生物NSP溶于DMSO配制成2mM的溶液；
(2)取2mL的C2H5OH/PBS(v/v＝1:1,pH＝7.4)溶液、10μL NSP的DMSO溶液加到一个荧光比色皿中，用紫外光对荧光比色皿进行照射并在在荧光分光光度仪上检测，随着紫外光照射时间增加，630nm处的荧光强度逐渐增强。在此基础上向荧光比色皿中加入亚硫酸钠，随着待测样亚硫酸钠的加入，630nm处的荧光强度逐渐减弱；
(3)用蒸馏水配制2mM的二氧化硫的水溶液，按体积比1:1将PBS缓冲溶液和C2H5OH溶液加到2mL荧光比色皿中，紫外光照射150秒后，逐渐加入硫化钠溶液的体积为0、8、16、24、32、40、48、56，同时在荧光光谱仪上测定630nm处荧光强度为205、174、144、113、97、81、57、27，以二氧化硫浓度为横坐标，以荧光强度F为纵坐标绘制图，得到硫化钠浓度的工作曲线；线性回归方程为：F630＝-3.029c+197.083，c的单位为10-6mol/L；
(4)测定样品溶液时，将测得的荧光强度代入线性回归方程，即可求得二氧化硫的浓度。
与现有技术相比，本发明具有如下优点和效果：
1、本发明螺吡喃-萘酰亚胺衍生物合成简单，成本低廉；
2、本发明螺吡喃-萘酰亚胺衍生物能实现对硫化氢和二氧化硫的区分检测，检测结果灵敏度高，选择性好；
3、本发明检测手段简单，只需要借助荧光光谱仪即可实现；
4、本发明采用双通道检测，检测信号明显且专一性强。
附图说明
图1实施例1制备的螺吡喃-萘酰亚胺衍生物NSP的核磁氢谱图
图2实施例1制备的螺吡喃-萘酰亚胺衍生物NSP的核磁碳谱图
图3实施例1制备的螺吡喃-萘酰亚胺衍生物NSP的质谱图
图4螺吡喃-萘酰亚胺衍生物NSP与硫化氢作用的荧光发射图
图5螺吡喃-萘酰亚胺衍生物NSP与各种分析物的荧光柱状图
图6螺吡喃-萘酰亚胺衍生物NSP测定硫化氢的工作曲线
图7螺吡喃-萘酰亚胺衍生物NSP测定硫化氢样品的荧光发射图
图8螺吡喃-萘酰亚胺衍生物NSP测定硫化氢细胞成像图
图9螺吡喃-萘酰亚胺衍生物NSP与紫外光作用的荧光发射图
图10螺吡喃-萘酰亚胺衍生物NMR与二氧化硫的荧光发射图
图11螺吡喃-萘酰亚胺衍生物NMR与各种分析物的荧光柱状图
图12螺吡喃-萘酰亚胺衍生物NMR测定二氧化硫的工作曲线
图13螺吡喃-萘酰亚胺衍生物NMR测定二氧化硫样品的荧光发射图
图14螺吡喃-萘酰亚胺衍生物NMR测定二氧化硫细胞成像图
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。
实施例1
NSP的制备和表征
将2,3,3-三甲基-3H-吲哚(3.18g,20mmol)和3-溴丙酸(6.08g,40mmol)在30mL无水乙腈中混合，将混合物在85℃加热反应12小时；反应完成后减压除去溶剂，所得残渣用20mL乙醚洗涤三次除去未反应原料，残余物用体积比二氯甲烷(5mL)与丙酮(25mL)重结晶得到浅紫色粉末状产物(3.78g,产率:57.7％)。1H NMR(600MHz,DMSO)δ12.69(s,1H),7.99(d,J＝4.3Hz,1H),7.85(d,J＝4.0Hz,1H),7.65–7.59(m,2H),4.66(t,J＝6.8Hz,2H),2.99(t,J＝6.9Hz,2H),2.86(s,3H),1.53(s,6H).13C NMR(151MHz,DMSO)δ198.40(s),172.01(s),142.23(s),141.32(s),129.82(s),129.39(s),123.95(s),116.04(s),54.73(s),43.99(s),31.57(s),22.34(s),14.82(s).
将1-(2-羧乙基)-2,3,3-三甲基-3H-吲哚-1-溴化物(3.27g,10mmol)，5-硝基水杨醛(1.83g,11mmol)和三乙胺(1.7mL,12mmol)在70mL无水乙醇中混合，混合物在85℃搅拌回流6-8小时，然后冷却至室温，过滤、洗涤、真空干燥得到暗黄色固体(3.03g,产率:83.7％)。1HNMR(600MHz,DMSO)δ12.22(s,1H),8.22(s,1H),8.00(d,J＝9.0Hz,1H),7.21(d,J＝10.4Hz,1H),7.12(d,J＝7.0Hz,2H),6.87(d,J＝9.0Hz,1H),6.80(t,J＝7.3Hz,1H),6.67(d,J＝7.7Hz,1H),6.00(d,J＝10.4Hz,1H),3.49(dt,J＝14.8,7.4Hz,1H),3.41–3.35(m,1H),2.61–2.53(m,1H),2.48–2.41(m,1H),1.19(s,3H),1.08(s,3H).13C NMR(151MHz,DMSO)δ173.33(s),159.55(s),146.58(s),141.02(s),136.12(s),128.63(s),128.11(s),126.19(s),123.27(s),122.25(s),119.69(s),119.32(s),115.97(s),107.11(s),106.97(s),52.89(s),33.63(s),26.05(s),19.93(s).
将4-溴-1,8-萘二甲酸酐(2.77mg,10mmol)溶解在50mL N，N-二甲基甲酰胺中，向悬浊液中缓慢滴加叠氮化钠(1.3g,20mmol)的水溶液，混合物在室温下搅拌回流10小时。反应完成后将混合物倒入50mL冰水中，所得沉淀经过滤，洗涤、真空干燥得到暗黄色固体(1.54g,产率:64％)。1H NMR(600MHz,DMSO)δ8.56(dd,J＝7.3,0.9Hz,1H),8.53–8.51(m,1H),8.51–8.49(m,1H),7.91(dd,J＝8.3,7.4Hz,1H),7.80(d,J＝8.0Hz,1H).13C NMR(151MHz,DMSO)δ161.18(s),160.60(s),144.61(s),133.79(s),131.26(s),129.97(s),128.11(s),124.08(s),119.73(s),116.83(s),115.25(s).
将4-叠氮基-1,8-萘二甲酸酐(1.195g,5mmol)和乙二胺(1.2g,20mmol)溶解在50mL无水乙醇中，混合物在85℃搅拌回流12小时，然后冷却至室温，过滤收集滤液减压旋干，以体积比20:1的二氯甲烷和甲醇作洗脱剂经硅胶柱色谱分离，纯化得淡黄色固体粉末(0.48g,产率:43.3％)。
将3-(3'，3'-二甲基-6-亚硝基螺[色烯-2,2'-二氢吲哚]-1'-基)丙酸(0.363g,1mmol)，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(0.52g,4mmol)，1-羟基苯并三唑(0.76g,4mmol)混合溶解于10mL无水N，N-二甲基甲酰胺中，混合物在0℃氩气保护下反应0.5小时，然后向反应体系中加入2-(2-氨基乙基)-6-叠氮基-1H-苯并[de]异喹啉-1,3(2H)-二酮(0.225g,0.8mmol)，三乙胺(0.30mL)，混合物在室温下反应24小时。反应结束后将混合物倒入50mL冰水混合物，所得沉淀经过滤，洗涤、真空干燥得粗产物，粗产物用体积比30:1的二氯甲烷和甲醇作洗脱剂经硅胶柱色谱分离，得得到浅黄色粉末(0.52g,产率：82％)。1H NMR(600MHz,DMSO)δ8.48(d,J＝7.3Hz,1H),8.42(dd,J＝8.1,5.9Hz,2H),8.20(d,J＝2.8Hz,1H),8.03(t,J＝6.1Hz,1H),8.00(dd,J＝9.0,2.8Hz,1H),7.87–7.82(m,1H),7.74(d,J＝8.0Hz,1H),7.17(d,J＝10.4Hz,1H),7.11–7.04(m,2H),6.85(d,J＝9.0Hz,1H),6.78(t,J＝7.4Hz,1H),6.57(d,J＝7.7Hz,1H),5.95(d,J＝10.4Hz,1H),4.09(td,J＝6.0,2.5Hz,2H),3.42–3.36(m,1H),3.35(d,J＝7.5Hz,2H),3.24(dd,J＝8.8,5.8Hz,1H),2.28(ddd,J＝14.8,8.8,6.4Hz,1H),2.22–2.15(m,1H),1.17(s,3H),1.05(s,3H).(图1)13C NMR(151MHz,DMSO)δ159.61(s),146.66(s),144.77(s),140.95(s),140.11(s),136.06(s),134.66(s),131.52(s),130.89(s),130.12(s),128.97(s),128.76–128.58(m),128.24(dd,J＝70.0,14.9Hz),126.87(s),126.13(s),125.91(s),123.35(d,J＝35.0Hz),122.32(s),122.16(s),120.41(s),119.50(s),119.29(s),115.89(s),106.94(s),52.94(s),36.75(s),35.13(s),26.04(s),21.30(s),19.88(s).(图2)ESI-MS m/z:[M+H]+Calcd for644.2252,Found 644.2252(图3).
实施例2
配制pH＝7.4、浓度为10mM的PBS缓冲溶液，配制2mM NSP的DMSO溶液，配制2mM硫化氢水溶液；取2mL C2H5OH/PBS(v/v＝1:1,pH＝7.4)溶液、10μL NSP的DMSO溶液加到一个荧光比色皿中，取硫化氢的水溶液，逐渐用微量进样器加到此比色皿中，加样的同时在荧光分光光度仪上检测，随着硫化氢的加入，540nm的荧光强度逐渐增强。荧光发射图见图4。
实施例3
配制pH＝7.4、浓度为10mM的PBS缓冲溶液，配制2mM NSP的DMSO溶液，配制2mM硫化氢水溶液；在荧光比色皿中，各加入2mL的C2H5OH/PBS(v/v＝1:1,pH＝7.4)溶液和10μL NSP的DMSO溶液，再分别加入10倍当量的其它分析物和硫化氢：NSP，Cys,Hcy,GSH,SO4 2-,SCN-,S2O3 2-,S2O5 2-,AcO-,CO3 2-,NO3 -,SO3 2-,S2-,的水溶液，在荧光分光光度仪上检测，绘制不同分析物对应的540nm处荧光强度柱状图(见图5)。硫化氢使得检测体系在540nm处荧光强度明显升高，其它的分析物基本没有引起检测体系荧光强度的变化。
实施例4
配制pH＝7.4、浓度为10mM的PBS缓冲溶液，配制2mM NSP的DMSO溶液，配制2mM硫化氢水溶液；在10个比色皿中各加入2mL的C2H5OH/PBS(v/v＝1:1,pH＝7.4)溶液和10μL NSP的DMSO溶液，然后分别加入硫化氢溶液的体积为0、10、20、30、40、50、60、70、80、90μL，同时在荧光光谱仪上测定540nm处荧光强度为209、845、1590、2211、2729、3205、3716、4070、4734、5003，以硫化氢浓度为横坐标，以荧光强度为纵坐标绘制图，得到硫化氢浓度的工作曲线；线性回归方程为：F540＝53.187c+437.745，c的单位为10-6mol/L；见图6。
实施例5
配制pH＝7.4、浓度为10mM的PBS缓冲溶液，配制2mM NSP的DMSO溶液，配制2mM硫化氢水溶液；在荧光比色皿中，各加入2mL的C2H5OH/PBS(v/v＝1:1,pH＝7.4)溶液和10μL NSP的DMSO溶液，取硫化氢的溶液80μL，用微量进样器加到此比色皿中，同时在荧光光谱仪上测定540nm荧光强度为4734，通过实施例4的线性回归方程，求得c＝80.77×10-6mol/L。偏差为0.95％。见图7。
实施例6
配制pH＝7.4、浓度为10mM的PBS缓冲溶液，配制2mM NSP的DMSO溶液，配制2mM硫化氢水溶液；把10μL NSP的DMSO溶液加入到2mL的PBS中；将探针溶液加入HepG-2细胞培养液中，使得其浓度为10μM，与HepG-2细胞在37℃下，反应15min，体系在荧光成像仪下几乎没有荧光；然后再加入外源的硫化氢，使其浓度为分别为50μM，在37℃下，反应15min，体系在荧光成像仪下显示绿色荧光,见图8。
实施例7
配制pH＝7.4、浓度为10mM的PBS缓冲溶液，配制2mM NSP的DMSO溶液，在10个比色皿中各加入2mL的C2H5OH/PBS(v/v＝1:1,pH＝7.4)溶液和10μL NSP的DMSO溶液，然后将荧光比色皿置于紫外光下分别照射0、30、60、90、120、150秒，同时在荧光分光光度仪上检测，随着紫外光照射时间增加，630nm的荧光强度逐渐增强。荧光发射图见图9。
实施例8
配制pH＝7.4、浓度为10mM的PBS缓冲溶液，配制2mM NSP的DMSO溶液，配制2mM硫化氢水溶液；取2mL C2H5OH/PBS(v/v＝1:1,pH＝7.4)溶液、10μL NSP的DMSO溶液加到一个荧光比色皿中，将荧光比色皿置于紫外光下照射150秒，然后取二氧化硫的水溶液，逐渐用微量进样器加到此比色皿中，加样的同时在荧光分光光度仪上检测，随着二氧化硫的加入，630nm的荧光强度逐渐减弱。荧光发射图见图10。
实施例9
配制pH＝7.4、浓度为10mM的PBS缓冲溶液，配制2mM NSP的DMSO溶液，配制2mM二氧化硫水溶液；在荧光比色皿中加入2mL的C2H5OH/PBS(v/v＝1:1,pH＝7.4)溶液和10μL NSP的DMSO溶液，将荧光比色皿置于紫外光下照射150秒，再分别加入10倍当量的其它分析物和二氧化硫：NMR，Cys，Hcy，GSH，SO4 2-，SCN-，S2O3 2-，SO4 2-，AcO-，CO3 2-，NO3 -，S2-，SO3 2-的水溶液，在荧光分光光度仪上检测，绘制不同分析物对应的630nm处荧光强度柱状图(见图11)。二氧化硫使得检测体系在630nm处荧光强度明显升高，其它的分析物基本没有引起检测体系荧光强度的变化。
实施例10
配制pH＝7.4、浓度为10mM的PBS缓冲溶液，配制2mM NSP的DMSO溶液，配制2mM二氧化硫水溶液；在8个比色皿中各加入2mL的C2H5OH/PBS(v/v＝1:1,pH＝7.4)溶液和10μL NSP的DMSO溶液，分别加入二氧化硫溶液的体积为0、8、16、24、32、40、48、56，同时在荧光光谱仪上测定635nm处荧光强度为205、174、144、113、97、81、57、27，以二氧化硫浓度为横坐标，以荧光强度F为纵坐标绘制图，得到硫化钠浓度的工作曲线；线性回归方程为：F635＝-3.029c+197.083，c的单位为10-6mol/L；见图12。
实施例11
配制pH＝7.4、浓度为10mM的PBS缓冲溶液，配制2mM NSP的DMSO溶液，配制2mM二氧化硫水溶液；在荧光比色皿中加入2mL的C2H5OH/PBS(v/v＝1:1,pH＝7.4)溶液和10μL NSP的DMSO溶液，取二氧化硫的溶液30μL，用微量进样器加到此比色皿中，同时在荧光光谱仪上测定630nm荧光强度为101.67，通过实施例4的线性回归方程，求得c＝31.49×10-6mol/L。偏差为4.7％，见图13。
实施例12
配制pH＝7.4、浓度为10mM的PBS缓冲溶液，配制2mM NSP的DMSO溶液，配制2mM二氧化硫的水溶液；把10μL NSP的DMSO溶液加入到2mL的PBS中；将探针溶液加入HepG-2细胞培养液中，使得其浓度为10μM，与HepG-2细胞在37℃下，反应15min，体系在荧光成像仪下几乎没有荧光；将HepG-2在紫外光环境下照射3min，体系在荧光成像仪下显示红色荧光，然后再加入外源的二氧化硫，使其浓度为分别为50μM，在37℃下，反应15min，体系在荧光成像仪下几乎没有荧光,见图14。

Claims (10)

1.一种螺吡喃-萘酰亚胺衍生物NSP，其特征在于，结构式为：
2.如权利要求1所述的一种螺吡喃-萘酰亚胺衍生物NSP的合成方法，其特征在于，步骤如下：
(1)按摩尔比为1：1.5-2.5将2,3,3-三甲基-3H-吲哚和3-溴丙酸在无水乙腈中混合，将混合物在85℃加热反应12小时后，减压除去溶剂，所得残渣用乙醚洗涤三次除去未反应原料，残余物用体积比1:5的二氯甲烷与丙酮重结晶得到浅紫色粉末状产物，即1-(2-羧乙基)-2,3,3-三甲基-3H-吲哚-1-溴化物；
(2)按摩尔比为1：1-1.5将1-(2-羧乙基)-2,3,3-三甲基-3H-吲哚-1-溴化物和5-硝基水杨醛在无水乙醇中混合，混合物在85℃搅拌回流6-8小时，然后冷却至室温，过滤、洗涤、真空干燥得到淡黄色固体，即3-(3'，3'-二甲基-6-亚硝基螺[色烯-2,2'-二氢吲哚]-1'-基)丙酸；
(3)将4-溴-1,8-萘二甲酸酐溶解在N，N-二甲基甲酰胺中，向悬浊液中缓慢滴加叠氮化钠的水溶液，混合物在室温下搅拌回流10小时。反应完成后将混合物倒入冰水混合物，所得沉淀经过滤，洗涤、真空干燥得到淡黄色固体，即4-叠氮基-1,8-萘二甲酸酐,其中4-溴-1,8-萘二甲酸酐和叠氮化钠的摩尔比为1：2-3；
(4)按摩尔比为1：4-5将4-叠氮基-1,8-萘二甲酸酐和乙二胺溶解在无水乙醇中，混合物在85℃搅拌回流12小时，然后冷却至室温，过滤收集滤液减压旋干，以体积比20:1的二氯甲烷和甲醇作洗脱剂经硅胶柱色谱分离，纯化得即2-(2-氨基乙基)-6-叠氮基-1H-苯并[de]异喹啉-1,3(2H)-二酮；
(5)将3-(3'，3'-二甲基-6-亚硝基螺[色烯-2,2'-二氢吲哚]-1'-基)丙酸，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，1-羟基苯并三唑混合溶解于无水N，N-二甲基甲酰胺中，混合物在0℃氩气保护下反应0.5小时，然后向反应体系中加入2-(2-氨基乙基)-6-叠氮基-1H-苯并[de]异喹啉-1,3(2H)-二酮，三乙胺，混合物在室温下反应24小时。反应结束后将混合物倒入冰水混合物，所得沉淀经过滤，洗涤、真空干燥得粗产物，粗产物用体积比30:1的二氯甲烷和甲醇作洗脱剂经硅胶柱色谱分离，得得到浅黄色粉末状目标物N-(2-(6-叠氮基-1,3-二氧代-1H-苯并[de]异喹啉-2(3H)-基)乙基)-3-(3'，3'-二甲基-6-硝基螺[色烯-2,2'-二氢吲哚]-1'-基)丙酰胺(NSP)，其中3-(3'，3'-二甲基-6-亚硝基螺[色烯-2,2'-二氢吲哚]-1'-基)丙酸，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，1-羟基苯并三唑和2-(2-氨基乙基)-6-叠氮基-1H-苯并[de]异喹啉-1,3(2H)-二酮的摩尔比为1：2-3：2-2：0.8-1。
3.如权利要求2所述的NSP的合成方法，其特征在于，所述的步骤(1)中2,3,3-三甲基-3H-吲哚和3-溴丙酸的摩尔比为1：2。
4.如权利要求2所述的NSP的合成方法，其特征在于，所述的步骤(2)中1-(2-羧乙基)-2,3,3-三甲基-3H-吲哚-1-溴化物和5-硝基水杨醛的摩尔比为1：1.1。
5.如权利要求2所述的NSP的合成方法，其特征在于，所述的步骤(3)中4-溴-1,8-萘二甲酸酐和叠氮化钠的摩尔比为1：2。
6.如权利要求2所述的NSP的合成方法，其特征在于，所述的步骤(4)中4-叠氮基-1,8-萘二甲酸酐和乙二胺的摩尔比为1：4。
7.如权利要求2所述的NSP的合成方法，其特征在于，所述的步骤(5)中3-(3'，3'-二甲基-6-亚硝基螺[色烯-2,2'-二氢吲哚]-1'-基)丙酸，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，1-羟基苯并三唑和2-(2-氨基乙基)-6-叠氮基-1H-苯并[de]异喹啉-1,3(2H)-二酮的摩尔比为1：2：2：0.8。
8.如权利要求1所述的一种螺吡喃-萘酰亚胺衍生物NSP在硫化氢和二氧化硫检测中的应用。
9.一种检测硫化氢的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)、配制pH＝7.4、浓度为10mM的PBS缓冲溶液，用硫化钠配制2mM的硫化氢水溶液，将螺吡喃-萘酰亚胺衍生物NSP溶于DMSO配制成2mM的溶液；
(2)、取2mL的C2H5OH/PBS(v/v＝1:1,pH＝7.4)溶液、10μL NSP的DMSO溶液加到一个荧光比色皿中，在荧光分光光度仪上检测，随着待测样硫化氢的加入，540nm处的荧光强度逐渐增强；
(3)、用蒸馏水配制2mM的硫化钠溶液，按体积比1:1将PBS缓冲溶液和C2H5OH溶液加到2mL荧光比色皿中，逐渐加入硫化氢溶液的体积为0、10、20、30、40、50、60、70、80、90μL，同时在荧光光谱仪上测定540nm处荧光强度为209、845、1590、2211、2729、3205、3716、4070、4734、5003，以硫化氢浓度为横坐标，以荧光强度F为纵坐标绘制图，得到硫化氢浓度的工作曲线；线性回归方程为：F540＝53.187c+437.745，c的单位为10-6mol/L；
(4)、测定样品溶液时，将测得的荧光强度代入线性回归方程，即可求得硫化氢的浓度。
10.一种检测二氧化硫的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)、配制pH＝7.4、浓度为10mM的PBS缓冲溶液，用亚硫酸钠配制2mM的二氧化硫水溶液，将螺吡喃-萘酰亚胺衍生物NSP溶于DMSO配制成2mM的溶液；
(2)、取2mL的C2H5OH/PBS(v/v＝1:1,pH＝7.4)溶液、10μL NSP的DMSO溶液加到一个荧光比色皿中，用紫外光对荧光比色皿进行照射并在在荧光分光光度仪上检测，随着紫外光照射时间增加，630nm处的荧光强度逐渐增强。在此基础上向荧光比色皿中加入亚硫酸钠，随着待测样亚硫酸钠的加入，630nm处的荧光强度逐渐减弱；
(3)、用蒸馏水配制2mM的二氧化硫的水溶液，按体积比1:1将PBS缓冲溶液和C2H5OH溶液加到2mL荧光比色皿中，紫外光照射150秒后，逐渐加入硫化钠溶液的体积为0、8、16、24、32、40、48、56，同时在荧光光谱仪上测定630nm处荧光强度为205、174、144、113、97、81、57、27，以二氧化硫浓度为横坐标，以荧光强度F为纵坐标绘制图，得到硫化钠浓度的工作曲线；线性回归方程为：F630＝-3.029c+197.083，c的单位为10-6mol/L；
(4)、测定样品溶液时，将测得的荧光强度代入线性回归方程，即可求得二氧化硫的浓度。
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