CN109553596A - 一种半胱氨酸荧光探针及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种半胱氨酸荧光探针及其制备方法，该种荧光探针与半胱氨酸发生选择性反应，丙烯酰基断裂，从而恢复荧光基团的荧光发射，实现对半胱氨酸的选择性检测；荧光基团受强的电子给、受体系影响，分子内电荷转移作用非常明显，能同时得到长波长的荧光发射和较大的斯托克斯位移，继而有效降低背景干扰信号，提高成像质量，本发明提供的荧光探针发射波长为636nm，斯托克是位移为158nm，具有选择性强、灵敏度高和成像优异的特点。

Description

一种半胱氨酸荧光探针及其制备方法
技术领域
本发明涉及化学分析技术领域，具体涉及一种半胱氨酸荧光探针及其制备方法。
背景技术
细胞内广泛存在着三种小分子硫醇类氨基酸，包括半胱氨酸，同型半胱氨酸和谷胱甘肽，它们参与了大量重要的生物过程。其中，半胱氨酸在蛋白质的合成、新陈代谢和解毒作用等过程中扮演了非常重要的角色，并且与很多疾病的发生息息相关，如生长迟缓、水肿、肝损伤，心血管疾病和阿尔兹海默病等。同时，这三种硫醇氨基酸在结构上有相似的地方，因此，在活细胞中选择性地检测半胱氨酸有很大的意义并且很有挑战性，将会对一些疾病的辅助诊断及预后提供有价值的信息。
荧光探针具有实时监测、操作方便和无创伤检测等优势，在生物检测领域引起了广泛的关注和研究。目前已见报道的半胱氨酸的荧光探针大多数发射波长较短，背景信号干扰强；少数探针发射红光或者近红外光，但是斯托克斯位移又太小，自吸收现象严重，以致于探针效果较差。因此，亟需一种荧光发射波长较长，斯托克斯位移较大的，选择性好，灵敏度高的半胱氨酸荧光探针。
发明内容
本发明的目的在于，针对上述现有技术的不足，提出一种半胱氨酸荧光探针及其制备方法，该种探针选择性好、灵敏度高。
本发明提出一种半胱氨酸荧光探针，具有如下所示的结构式：
。
一种半胱氨酸荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
（1）、将反应物1和反应物2加入到反应容器中；
（2）、再向反应容器中加入催化剂和溶剂进行反应，反应后得到反应产物；
（3）、将所述反应产物进行纯化后，得到一种半胱氨酸荧光探针；
以下为该荧光探针的合成路线：
。
在细胞环境中，半胱氨酸的巯基能与该探针丙烯酰基中的双键进行亲核取代反应，同时半胱氨酸的氨基能对该丙烯酰基的羰基发生进攻，从而将丙烯酰基以七元环内酰胺的形式从探针分子中断裂下来，从而恢复荧光基团的荧光发射，实现对半胱氨酸的选择性检测。
进一步地，反应需在惰性气体保护下进行。
进一步地，所述催化剂为三乙胺、二异丙基乙基胺、醋酸铵、吡啶和哌啶中的一种或多种。
进一步地，所述溶剂为有机溶剂。
进一步地，所述有机溶剂为甲醇、乙醇、丙醇、二氯甲烷、三氯甲烷、四氢呋喃和乙腈中的一种或多种。
进一步地，反应温度为20-80℃，反应时间为3-24h。
进一步地，所述反应物1、反应物2和催化剂的投料摩尔比为1:1-1.5:0.05-1。
进一步地，步骤（3）中采用硅胶柱层析法进行纯化。
本发明的一种半胱氨酸荧光探针及其制备方法，该种荧光探针与半胱氨酸先后发生亲核取代反应和分子内成环反应，使得丙烯酰基从分子中断裂，从而恢复荧光基团的荧光发射，实现对半胱氨酸的选择性检测；荧光基团受分子内强的给、受电子体的作用，分子内电荷转移现象非常明显，能同时得到长波长的荧光发射和较大的斯托克斯位移，继而有效降低背景干扰信号，提高成像质量。本发明提供的荧光探针发射波长为636nm，斯托克是位移为158nm，具有选择性强、灵敏度高和成像优异的特点。
附图说明
图1为本发明荧光探针的[C25H17N3O3Na]+质谱图；
图2为本发明荧光探针干扰性对比及选择性测试结果示意图；
图3为本发明荧光探针对MCF-7活细胞内半胱氨酸的荧光成像图。
具体实施方式
为下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外，本领域技术人员对本发明所做的各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所要求保护的范围内。本发明实施例中的配比均为以重量计。
实施例1
请参见图1。氩气保护下，将反应物1（0.23 g, 1.02 mmol）和反应物2（0.20 g, 1.05mmol）在Schlenk管中混合，并加入醋酸铵（0.005 g, 0.05 mmol）做催化剂，然后加入2 mL四氢呋喃和0.5 mL乙醇作反应溶剂，20 ℃下搅拌24h。旋蒸除掉溶剂后，用硅胶柱层析提纯，淋洗剂为二氯甲烷/丙酮（20/1，v/v）。得到一种半胱氨酸荧光探针0.29 g，收率75%。ESI-HRMS: [M+Na]+, [C25H15NO4Na]+, Calculated: 416.0899; Found: 416.0881。
实施例2
氩气保护下，反应物1（0.15 g, 0.66 mmol）和反应物2（0.16 g, 0.853 mmol）在Schlenk管中混合，并加入醋酸铵（0.05 g, 0.65 mmol）做催化剂，然后加入2 mL四氢呋喃和0.5 mL甲醇作反应溶剂，60 ℃下搅拌过夜。旋蒸除掉溶剂后，用硅胶柱层析提纯，淋洗剂为二氯甲烷/丙酮（20/1，v/v）。得到一种半胱氨酸荧光探针0.21 g，收率78%。ESI-HRMS: [M+Na]+, [C25H15NO4Na]+, Calculated: 416.0899; Found: 416.0883。
实施例3
氩气保护下，反应物1（0.34 g, 1.52 mmol）和反应物2（0.41 g, 1.45 mmol）在Schlenk管中混合，并加入醋酸铵（0.12 g, 1.61 mmol）做催化剂，然后加入2.5 mL乙醇作反应溶剂，80℃下搅拌3h。旋蒸除掉溶剂后，用硅胶柱层析提纯，淋洗剂为二氯甲烷/丙酮（20/1，v/v）。得到一种半胱氨酸荧光探针0.45 g，收率78%。ESI-HRMS: [M+Na]+,[C25H15NO4Na]+, Calculated: 416.0899; Found: 416.0907。
实施例4
测定本发明所得荧光探针检测的抗干扰性及选择识别能力。
通过本发明所得的荧光探针分别进行干扰性测试，其中Vc为维生素C，H2O2为双氧水，t-BuOOH为叔丁基过氧化氢，NaClO为次氯酸钠，Gly为甘氨酸，Glu为谷氨酸，His为组氨酸，Pro为脯氨酸，Lys为赖氨酸，Na2S为硫化钠，GSH为谷胱甘肽，Hcy为同型半胱氨酸，Cys为半胱氨酸。
从图2中可以看出在存在不同的干扰试剂下，探针对半胱氨酸具有较强的选择性以及抗干扰能力。
实施例5
为了考察本发明荧光探针对细胞内半胱氨酸（Cys）的检测性能，我们将探针用于活细胞内半胱氨酸的荧光成像实验。如附图3所示，6组实验分别为：对照组（MCF-7细胞）；MCF-7细胞用探针培养40分钟；MCF-7细胞用Cys培养1小时后，再用探针培养40分钟；MCF-7细胞用Hcy培养1小时后，再用探针培养40分钟；MCF-7细胞用GSH培养1小时后，再用探针培养40分钟；MCF-7细胞用NEM（N-乙基马来酰亚胺，一种硫醇氨基酸的清除剂）培养1小时后，再用探针培养40分钟；其中，探针的浓度为10 μM，Cys，Hcy，GSH浓度分别为100 μM，NEM浓度为1mM。激发波长488 nm，荧光收集波长为600-700 nm，比例尺20 μm。跟控制组相比，经探针培养的细胞可见明亮的红色荧光。而且，仅当细胞经半胱氨酸（Cys）培养后，荧光会明显增强；经同型半胱氨酸（Hcy）和谷胱甘肽（GSH）培养后，荧光强度几乎不变。当细胞内的硫醇氨基酸被NEM清除后，荧光强度基本消失。可见，探针对硫醇氨基酸有选择性响应，而且只对半胱氨酸有响应，且细胞成像亮度高、质量好。
以上对本发明的实施例进行了示例性说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依据本发明申请范围的均等变化与改进等，均应归属于本发明的专利涵盖范围之内。

Claims (9)

1.一种半胱氨酸荧光探针，其特征在于，具有如下所示的结构式：
。
2.如权利要求1所述的一种半胱氨酸荧光探针的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）、将反应物1和反应物2加入到反应容器中；
（2）、再向反应容器中加入催化剂和溶剂进行反应，反应后得到反应产物；
（3）、将所述反应产物进行纯化后，得到一种半胱氨酸荧光探针；
以下为该荧光探针的合成路线图：
。
3.如权利要求2所述的一种半胱氨酸荧光探针的制备方法，其特征在于：反应需在惰性气体保护下进行。
4.如权利要求2所述的一种半胱氨酸荧光探针的制备方法，其特征在于：所述催化剂为三乙胺、二异丙基乙基胺、醋酸铵、吡啶和哌啶中的一种或多种。
5.如权利要求2所述的一种半胱氨酸荧光探针的制备方法，其特征在于：所述溶剂为有机溶剂。
6.如权利要求5所述的一种半胱氨酸荧光探针的制备方法，其特征在于：所述有机溶剂为甲醇、乙醇、丙醇、二氯甲烷、三氯甲烷、四氢呋喃和乙腈中的一种或多种。
7.如权利要求2所述的一种半胱氨酸荧光探针的制备方法，其特征在于：反应温度为20-80℃，反应时间为3-24h。
8.如权利要求2所述的一种半胱氨酸荧光探针的制备方法，其特征在于：所述反应物1、反应物2和催化剂的投料摩尔比为1:1-1.5:0.05-1。
9.如权利要求2所述的一种半胱氨酸荧光探针的制备方法，其特征在于：步骤（3）中采用硅胶柱层析法进行纯化。
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