CN105130896A

CN105130896A - 一类含硫脲取代基的萘酰亚胺衍生物，其制备方法及应用

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Publication number: CN105130896A
Application number: CN201510472333.9A
Authority: CN
Inventors: 李晓莲; 范丽丽; 徐强; 冯一粟
Original assignee: Dalian University of Technology
Current assignee: Dalian University of Technology
Priority date: 2015-08-04
Filing date: 2015-08-04
Publication date: 2015-12-09
Anticipated expiration: 2035-08-04
Also published as: CN105130896B

Abstract

本发明公开一类含硫脲取代基的萘酰亚胺衍生物，其制备方法及应用，所述衍生物具有通式Y的结构，其中R选自含杂原子的六元环、-NHCH₂CH₂OH、-NHCH₂CH₂N(CH₃)₂和-NHCH₂CH₂CH₂CH₃中的一种，所述杂原子为N、O和S原子中的至少一种，所述含杂原子的六元环中有至少一个N原子，且R通过N原子与通式T中的母核连接。本发明的化合物通过在萘酰亚胺活性位点接入胺基硫脲基团制备，该类衍生物对乳腺癌和宫颈癌等多种不同组织来源的肿瘤细胞具有抑制生长的活性，而对人体正常细胞的抑制活性较小，在制备抑制肿瘤细胞生长药物中具有广阔的前景。

Description

一类含硫脲取代基的萘酰亚胺衍生物，其制备方法及应用

技术领域

本发明涉及一类抗肿瘤含硫脲取代基萘酰亚胺衍生物，属于有机合成技术领域。

背景技术

研究发现萘酰亚胺衍生物具有良好的抗癌活性，其中Amonafide(N-(β-二甲基氨基乙基)-3-胺基-1,8-萘酰亚胺)(MalviyaVK,LiuPY,AlbertsDS,etal.Am.J.Clin.Oncol.,1992,15:41-44.)和Mitonafide(N-(β-二甲基氨基乙基)-3-硝基-1,8-萘酰亚胺)(BranaM.F,SantosA.,RoldanC.M.,etal.Eur.J.Med.Chem.Chim.Ther.,1981,16,207-212)是非常著名的两个化合物，已经进入二期临床试验。该类化合物能够有效地抑制肿瘤细胞的生长，其作用机理是嵌插入DNA的碱基对之间，在拓扑异构酶Ⅱ的介入下诱导DNA链的断裂，影响DNA正常的生理功能，从而达到抑制癌细胞增殖的作用。但是，在对Mitonafide的临床试验中，发现它有非常严重的中枢神经系统(CNS)毒性，并且其临床活性有限；Amonafide在临床试验中的表现也不尽如人意，引起骨髓抑制、呕吐、皮疹以及中等程度的静脉炎等副作用。

氨基胍、胺基脲、氨肟、异羟肟、羟基氨基脲等基团被研究用于抗肿瘤药物，这些化合物具有相同的结构特征(NHC(＝X)NHOH,X＝O,NH,S)，这个结构及相似结构被确认为抗肿瘤活性药物的基本药效团，其衍生物表现出非常好的肿瘤抑制活性。

发明内容

本发明的目的是在萘酰亚胺活性位点接入胺基硫脲基团，以此来扩展萘酰亚胺类药物的种类，并得到更加有效、毒副作用小的抗肿瘤药物。通过胺基取代、氨基缩合等反应在萘酰亚胺母体上引入胺基、胺基硫脲，设计合成一类含硫脲取代基的萘酰亚胺衍生物，一方面希望改善母体的溶解性，另一方面希望通过引入含硫脲取代基改变母体的电子分布情况，影响与DNA的作用方式，实验证明其对体外肿瘤细胞生长具有抑制能力。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案是：一类含硫脲取代基的萘酰亚胺衍生物，具有通式Y的结构：

通式Y中：R选自含杂原子的六元环、-NHCH₂CH₂OH、-NHCH₂CH₂N(CH₃)₂和-NHCH₂CH₂CH₂CH₃中的一种，所述杂原子为N、O和S原子中的至少一种，所述含杂原子的六元环中有至少一个N原子，且R通过N原子与通式T中的母核连接。

进一步的，所述含杂原子的六元环选自和中的一种。

进一步的，本发明所述衍生物最优选为：N-硫脲-6-哌啶基-1,8-萘酰亚胺、N-硫脲-6-吗啉基-1,8-萘酰亚胺、N-硫脲-6-硫吗啉基-1,8-萘酰亚胺或N-硫脲-6-吡咯烷基-1,8-萘酰亚胺。

本发明的另一技术目的在于提供所述衍生物的制备方法，包括以下步骤：以4-溴-1,8萘酐(化合物1)为起始原料，与相应的胺反应得相应中间体4-胺基-1,8萘酐衍生物(化合物2)，4-胺基-1,8萘酐衍生物与胺基硫脲(化合物3)发生氨基缩合反应生成所述衍生物。

进一步的，所述制备方法中4-溴-1,8萘酐与相应的胺反应时采用的溶剂为乙二醇单甲醚，4-胺基-1,8萘酐衍生物与胺基硫脲反应时使用的溶剂为DMF。

合成路线如下：

本发明的另一技术目的在于提供所述衍生物在制备抑制肿瘤细胞生长药物中的应用，所述的肿瘤细胞包括乳腺癌MCF-7细胞和人宫颈癌Hela细胞。

将上述合成的含硫脲取代基的萘酰亚胺衍生物分别用四氮唑盐还原法对乳腺癌MCF-7细胞和人宫颈癌Hela细胞进行体外抑制肿瘤细胞生长活性的测定，并同时进行以上化合物对HL7702人正常肝细胞的体外抑制细胞生长活性的测定。

所述四氮唑盐还原法实验步骤如下：

1、接种细胞

分别将乳腺癌MCF-7细胞、人宫颈癌Hela细胞和HL7702人正常肝细胞收集到培养基中，将细胞稀释每孔接种约5000个细胞，最外围加入200μLPBS，提供充足的水分保证细胞的生长环境，将培养板放至CO₂培养箱中温育一到两天。

2、添加药物

当细胞培育至对数生长期时即可加药物，用培养基将本发明所述化合物分别稀释成2μM、20μM、40μM、80μM四个梯度浓度，向细胞中加入药物，每个药物浓度设置4个复孔，减小误差，并设置对照组，放回CO₂培养箱中，培育24h。

3、存活细胞数的检测

在所有孔中均加入20μLMTT，放到CO₂培养箱中温育4h；弃去孔中的溶液加入200μLDMSO，溶解形成的结晶。在酶标仪上测定各孔吸光度记录结果，按下列公式计算出被测物的IC₅₀值。

本发明的有益效果：

本发明通过在萘酰亚胺活性位接入胺基硫脲基团制备了一类含硫脲取代基的萘酰亚胺衍生物，该类衍生物对乳腺癌和宫颈癌等多种不同组织来源的肿瘤细胞具有抑制生长的活性，而对人体正常细胞的抑制活性较小，在制备抑制肿瘤细胞生长药物中具有广阔的前景。

附图说明

本发明附图1幅

图1.化合物Y1～4的粘度测试结果。

具体实施方式

下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

实施例1

N-硫脲-6-哌啶基-1,8-萘酰亚胺(化合物Y1)合成：

(1)4-哌啶基-1.8-萘酐合成

在100mL两口瓶中加入5g(18.1mmol)的4-溴-1,8萘酐，加入40mL乙二醇单甲醚搅拌溶解，将2mL(20.2mmol)哌啶加入反应体系，加热至回流，磁力搅拌4h后停止反应，室温下冷却，将冷水加入反应液中，析出黄色沉淀，过滤后干燥，用硅胶柱层析提纯(洗脱液为CH₂Cl₂)得黄色固体4.77g，产率：93.6％。

(2)化合物Y1的合成

在50mL两口瓶中，加入0.5g(1.8mmol)4-哌啶基-1.8-萘酐，0.2g(2.2mmol)的氨基硫脲，0.05g的碳酸钾，用30mLDMF溶解，磁力搅拌，升温至回流反应12h，将反应停止，冷却到室温，将500mL左右冷水加入反应液中，析出黄色沉淀，抽滤，水洗后干燥，硅胶柱层析提纯(洗脱液为甲醇：二氯甲烷＝1:20)，得黄色固体0.21g(化合物Y1)，产率：33.8％。熔点：178.8-179.7℃。

+ESIMS(M+H):C₁₈H₁₈N₄O₂S,计算值：354.12，实测值：354.12。

¹HNMR(400MHz,DMSO)δ9.72(s,1H),8.47(dd,J＝13.5,7.8Hz,2H),8.40(d,J＝8.1Hz,1H),7.93(d,J＝29.5Hz,2H),7.83(t,J＝7.9Hz,1H),7.34(d,J＝8.2Hz,1H),3.22(d,J＝4.2Hz,4H),1.83(s,4H),1.68(d,J＝5.5Hz,2H).

¹³CNMR(101MHz,DMSO)δ182.22(s,1H),162.73(s,3H),162.11(s,3H),157.50(s,4H),132.93(s,7H),131.33(d,J＝9.1Hz,15H),130.04(s,3H),126.31(s,7H),126.05(s,6H),123.80(s,3H),116.10(s,3H),115.39(s,9H),54.46(s,20H),26.15(s,20H),24.30(s,9H).

实施例2

N-硫脲-6-吗啉基-1,8-萘酰亚胺(化合物Y2)合成：

除步骤(1)中用吗啉代替哌啶外，其他同实施例1的操作，得目标化合物Y2，黄色固体，产率30.1％。熔点：188.9-190.2℃。

+APIMS(M-H):C₁₇H₁₆N₄O₃S,计算值：356.09，实测值：356.10。

¹HNMR(400MHz,DMSO)δ9.66(s,1H),8.52(dd,J＝15.4,7.7Hz,2H),8.43(d,J＝8.1Hz,1H),7.95(d,J＝32.2Hz,2H),7.86–7.82(m,1H),7.39(d,J＝8.2Hz,1H),3.91(d,J＝5.3Hz,4H),3.23(d,J＝4.5Hz,4H).

¹³CNMR(101MHz,DMSO)δ182.20(s,1H),162.68(s,1H),162.11(s,1H),156.22(s,1H),132.86(s,2H),131.35(s,4H),130.02(d,J＝16.4Hz,1H),126.57(s,2H),125.82(s,1H),123.83(s,1H),116.93(s,1H),115.51(s,2H),66.62(s,5H),53.51(s,5H).

实施例3

N-硫脲-6-硫吗啉基-1,8-萘酰亚胺(化合物Y3)合成

除步骤(1)中用硫吗啉代替哌啶外，其他同实施例1的操作，得目标化合物Y3，黄色固体，产率32.5％。熔点：162.4-163.8℃。

+ESIMS(M+H):C₁₇H₁₆N₄O₂S₂,计算值：372.07，实测值：372.01。

¹HNMR(400MHz,DMSO)δ9.66(s,1H),δ8.50(d,J＝6.8Hz,2H),8.42(d,J＝8.1Hz,1H),7.95(d,J＝32.7Hz,2H),7.85(t,J＝7.8Hz,1H),7.41(d,J＝8.2Hz,1H),3.46(s,4H),2.96(d,J＝4.7Hz,4H).

¹³CNMR(101MHz,DMSO)δ182.21(s,1H),162.68(s,2H),162.10(s,2H),157.26(s,2H),132.78(s,4H),131.33(d,J＝14.0Hz,6H),129.92(s,1H),126.73(s,3H),126.33(s,1H),123.83(s,2H),117.08(s,2H),116.56(s,4H),55.72(s,9H),27.65(s,9H).

实施例4

N-硫脲-6-吡咯烷基-1,8-萘酰亚胺(化合物Y4)合成

除步骤(1)中用吡咯烷代替哌啶外，其他同实施例1的操作，得目标化合物Y4，黄色固体，产率33.5％。熔点：165.2-166.1℃。

+ESIMS(M+H):C₁₇H₁₆N₄O₂S,计算值：340.10，实测值：340.03。

¹HNMR(400MHz,DMSO)δ9.66(s,1H),8.77(d,J＝8.6Hz,1H),8.44(d,J＝7.2Hz,1H),8.25(d,J＝8.7Hz,1H),7.87(d,J＝33.3Hz,2H),7.66–7.61(m,1H),6.92(d,J＝8.8Hz,1H),3.78(s,4H),2.02(s,4H).

¹³CNMR(101MHz,DMSO)δ182.16(s,1H),163.03(s,1H),161.87(s,2H),152.98(s,2H),133.56(s,4H),133.29(s,3H),131.34(d,J＝18.8Hz,6H),123.65(s,4H),122.66(d,J＝52.6Hz,3H),122.39–122.17(m,1H),109.85(s,2H),108.91(s,3H),53.41(s,9H),26.05(s,8H).

实施例5

体外抑制肿瘤细胞和正常细胞生长活性测定：

用四氮唑盐(microculturetetrozolium，MTT)还原法对Hela宫颈癌细胞、MCF-7乳腺癌细胞和HL7702人正常肝细胞进行体外抑制细胞生长活性测定。

四氮唑盐(MTT)还原法的具体操作是：

(1)接种细胞、培养细胞：当细胞处于对数生长期时，用胰蛋白酶将贴壁生长的细胞消化下来，收集到含血清的培养基中并稀释细胞悬液浓度为大约4×10⁵～6×10⁵个/mL。将上述培养液接种到无菌96孔板中，每孔加入100μL细胞悬液(每孔大约5000个细胞)，最外围每孔加入200μL的PBS缓冲液，为细胞生长环提供充足的水分环境。将接种后的培养板放至37℃、5％CO₂环境的培养箱中温育24h，当细胞处于对数生长期时即可加药物。

(2)添加药物：用培养基将药物稀释成2μM，20μM，40μM，80μM四个梯度浓度。每个浓度设置4个复孔来减小误差。每孔加入100μL药物溶液(此时药物浓度稀释一倍)，对照组设置8～10个复孔，对照组不加药物用培养基代替。培养板放回培养箱中温育，使药物作用24h。

(3)检测存活细胞数：取出培养板，每孔加入20μLMTT。放回培养箱中培养4h。吸出所有孔中的培养基和MTT，注意不要吸走孔底部的紫色结晶。每孔中加入200μLDMSO溶解甲臜结晶，在摇床上震荡10分钟。将96孔板放入酶标仪中测定每个孔吸光度。波长为490nm，570nm，625nm。计算细胞生长抑制率和IC₅₀值。

对化合物Y1～4的体外生测结果如下：

表1.化合物Y1～4对Hela，MCF-7和HL7702细胞株的IC₅₀值

从表1可以看出化合物Y1～4对肿瘤细胞株Hela、MCF-7都表现出良好的抑制增殖效果，而其对正常细胞HL7702的抑制活性较小，具有选择性。

实施例6

化合物与细胞DNA作用方式的确定

溶液粘度对溶质分子长度变化比较敏感，所以粘度测试是确定药物分子与DNA结合方式的一种有效方法。若药物与CT-DNA以嵌插方式结合，药物分子破坏了碱基对的链接，使DNA双螺旋链部分解旋和变长，溶液粘度增加；若药物以非嵌插结合(静电吸引或沟槽结合)方式与CT-DNA作用，DNA链长度不会发生明显变化，溶液粘度也不会明显变化。

具体实验过程如下：

牛胸腺DNA溶于Tris-HCl(30mM，pH7.5)缓冲溶液中，4℃下保存，全部溶解后，在超声仪中震荡10分钟，用PVDF膜(孔径0.45μM)过滤，以滤去不溶物。配制的小牛胸腺DNA浓度100μM。粘度测定在乌氏粘度计上进行，放置于恒温水域槽中，水浴保持恒温25℃。吸取l0mL小牛胸腺DNA(100μM)置于粘度计中，用秒表记录滴下时间。滴加浓度为10^-3M的Y1-4化合物溶液，使其浓度和DNA浓度的比值逐渐增加，用吸耳球鼓泡以混匀溶液。记录化合物滴下时间，每个化合物溶液滴下时间重复测量三次，每次相差不得超过0.2秒，取平均值。以(η/η_o)^1/3相对于化合物与DNA的浓度比值R(R＝C_化合物/C_DNA)比值作图，其中η表示滴加化合物后DNA的相对运动粘度，η_o表示没有化合物时DNA的相对运动粘度。

图1为药物Y1-4的粘度测试结果。由图可见DNA溶液的粘度随着药物浓度增加，呈增大的趋势，说明药物分子主要以嵌插结合方式与DNA作用。通过粘度变化对比，可以看出化合物Y4与DNA的作用最强。

Claims

1.一类含硫脲取代基的萘酰亚胺衍生物，其特征在于，所述衍生物具有通式Y的结构：

2.根据权利要求1所述的衍生物，其特征在于，所述含杂原子的六元环选自中的一种。

3.根据权利要求1所述的衍生物，其特征在于所述衍生物是：N-硫脲-6-哌啶基-1,8-萘酰亚胺、N-硫脲-6-吗啉基-1,8-萘酰亚胺、N-硫脲-6-硫吗啉基-1,8-萘酰亚胺或N-硫脲-6-吡咯烷基-1,8-萘酰亚胺。

4.一种权利要求1所述衍生物的制备方法，包括以下步骤：以4-溴-1,8萘酐为起始原料，与相应的胺反应得相应中间体4-胺基-1,8萘酐衍生物，4-胺基-1,8萘酐衍生物与胺基硫脲发生氨基缩合反应生成所述衍生物。

5.根据权利要求4所述衍生物的制备方法，其特征在于4-溴-1,8萘酐与相应的胺反应时采用的溶剂为乙二醇单甲醚。

6.根据权利要求4所述衍生物的制备方法，其特征在于4-胺基-1,8萘酐衍生物与胺基硫脲反应时使用的溶剂为DMF。

7.权利要求1所述衍生物在制备抑制肿瘤细胞生长药物中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于所述的肿瘤细胞包括乳腺癌MCF-7细胞和人宫颈癌Hela细胞。