CN106432190B

CN106432190B - 一类含2-氨基嘧啶的萘酰亚胺化合物，其制备方法及应用

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Publication number: CN106432190B
Application number: CN201510470648.XA
Authority: CN
Inventors: 李晓莲; 范丽丽; 李晓宇
Original assignee: Dalian University of Technology
Current assignee: Dalian University of Technology
Priority date: 2015-08-04
Filing date: 2015-08-04
Publication date: 2019-04-30
Anticipated expiration: 2035-08-04
Also published as: CN106432190A

Abstract

本发明公开一类含2‑氨基嘧啶的萘酰亚胺化合物，其制备方法及应用，所述衍生物具有通式T的结构，其中R选自含杂原子的六元环、‑NHCH₂CH₂OH、‑NHCH₂CH₂N(CH₃)₂和‑NHCH₂CH₂CH₂CH₃中的一种，所述杂原子为N、O和S原子中的至少一种，所述含杂原子的六元环中有至少一个N原子，且R通过N原子与通式T中的母核连接。本发明的化合物通过在萘酰亚胺衍生物母体上接入2‑氨基嘧啶基团制备，该类衍生物对乳腺癌和宫颈癌等多种不同组织来源的肿瘤细胞具有抑制生长的活性，而对人体正常细胞的抑制活性较小，在制备抑制肿瘤细胞生长药物中具有广阔的前景。

Description

一类含2-氨基嘧啶的萘酰亚胺化合物，其制备方法及应用

技术领域

本发明涉及一类抗肿瘤含2-氨基嘧啶的萘酰亚胺类化合物，属于有机合成技术领域。

背景技术

研究发现萘酰亚胺衍生物具有良好的抗癌活性，其中Amonafide(N-(β-二甲基氨基乙基)-3-胺基-1,8-萘酰亚胺)(Malviya V K,Liu P Y,Alberts D S,etal.Am.J.Clin.Oncol.,1992,15:41-44.)和Mitonafide(N-(β-二甲基氨基乙基)-3-硝基-1,8-萘酰亚胺)(Brana M.F,Santos A.,Roldan C.M.,et al.Eur.J.Med.Chem.Chim.Ther.,1981,16,207-212)是非常著名的两个化合物，已经进入二期临床试验。该类化合物能够有效地抑制肿瘤细胞的生长，其作用机理是嵌插入DNA的碱基对之间，在拓扑异构酶Ⅱ的介入下诱导DNA链的断裂，影响DNA正常的生理功能，从而达到抑制癌细胞增殖的作用。但是，在对Mitonafide的临床试验中，发现它有非常严重的中枢神经系统(CNS)毒性，并且其临床活性有限；Amonafide在临床试验中的表现也不尽如人意，引起骨髓抑制、呕吐、皮疹以及中等程度的静脉炎等副作用。

氨基嘧啶是具有抗肿瘤活性的潜在药效团，科研人员对其抗肿瘤的药效关系进行了大量研究。Sviripa等设计合成了一系列含氨基嘧啶药效团的抗肿瘤药物分子，一些在体内和体外抗肿瘤实验中展示了较高的细胞毒性，对各种肝癌和结肠癌细胞有好的抑制活性并且口服用药生物利用率高。Xitao Li等也对含氨基嘧啶基团的化合物的构效关系进行了研究，很多结构表现出好的抗肿瘤活性。

发明内容

本发明的目的是在萘酰亚胺活性位点接入氨基嘧啶基团，以此来扩展萘酰亚胺类药物的种类，并得到更加有效、毒副作用小的抗肿瘤药物。通过在萘酰亚胺母体上引入2-氨基嘧啶基团，设计合成了一类含2-氨基嘧啶的萘酰亚胺衍生物。其目的是：通过氨基缩合、胺基取代等反应合成一类含2-氨基嘧啶的萘酰亚胺衍生物，一方面希望改善母体的溶解性，另一方面希望通过引入2-氨基嘧啶改变母体的电子分布情况，影响与DNA的作用方式，实验证明其对体外肿瘤细胞生长具有抑制能力。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案是：一类含2-氨基嘧啶的萘酰亚胺化合物，所述化合物具有通式T的结构：

通式T中：R选自含杂原子的六元环、-NHCH₂CH₂OH、-NHCH₂CH₂N(CH₃)₂和-NHCH₂CH₂CH₂CH₃中的一种，所述杂原子为N、O和S原子中的至少一种，所述含杂原子的六元环中有至少一个N原子，且R通过N原子与通式T中的母核连接。

进一步的，所述含杂原子的六元环选自中的一种。

进一步的，本发明所述化合物最优选为：N-(2’-(N’-嘧啶胺基)-乙基)-4-哌啶基-1,8-萘酰亚胺、N-(2’-(N’-嘧啶胺基)-乙基)-4-吗啉基-1,8-萘酰亚胺、N-(2’-(N’-嘧啶胺基)-乙基)-4-硫吗啉基-1,8-萘酰亚胺或N-(2’-(N’-嘧啶胺基)-乙基)-4-吡咯烷基-1,8-萘酰亚胺。

本发明的另一技术目的在于提供所述化合物的制备方法，包括以下步骤：以4-溴-1,8萘酐(化合物1)为起始原料，与相应的胺反应得相应中间体4-胺基-1,8萘酐衍生物(化合物2)，化合物2与乙二胺经氨基缩合反应得N-(2’-胺基乙基)-4-胺基-1,8-萘酰亚胺衍生物(化合物3)，化合物3再与2-溴嘧啶经取代反应得到所述化合物。

合成路线如下：

本发明的另一技术目的在于提供所述化合物在制备抑制肿瘤细胞生长药物中的应用，所述的肿瘤细胞包括乳腺癌MCF-7细胞和人宫颈癌Hela细胞。

将上述合成的含2-氨基嘧啶的萘酰亚胺类化合物分别用四氮唑盐还原法对乳腺癌MCF-7细胞和人宫颈癌Hela细胞进行体外抑制肿瘤细胞生长活性的测定，并同时进行以上化合物对HL7702人正常肝细胞的体外抑制细胞生长活性的测定。

所述四氮唑盐还原法实验步骤如下：

1、接种细胞

分别将乳腺癌MCF-7细胞、人宫颈癌Hela细胞和HL7702人正常肝细胞收集到培养基中，将细胞稀释每孔接种约5000个细胞，最外围加入200μLPBS，提供充足的水分保证细胞的生长环境，将培养板放至CO₂培养箱中温育一到两天。

2、添加药物

当细胞培育至对数生长期时即可加药物，用培养基将本发明所述化合物分别稀释成2μM、20μM、40μM、80μM四个梯度浓度，向细胞中加入药物，每个药物浓度设置4个复孔，减小误差，并设置对照组，放回CO₂培养箱中，培育24h。

3、存活细胞数的检测

在所有孔中均加入20μL MTT，放到CO₂培养箱中温育4h；弃去孔中的溶液加入200μL DMSO，溶解形成的结晶。在酶标仪上测定各孔吸光度记录结果，按下列公式计算出被测物的IC₅₀值。

本发明的有益效果：

本发明通过在萘酰亚胺母体接入2-氨基嘧啶基团，设计合成了一类含2-氨基嘧啶的萘酰亚胺类化合物，该类化合物对乳腺癌和宫颈癌等多种不同组织来源的肿瘤细胞具有抑制生长的活性，而对人体正常细胞的抑制活性较小，具有较好的选择性，在制备抑制肿瘤细胞生长药物中具有广阔的前景。

具体实施方式

下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

实施例1

N-(2’-(N’-嘧啶胺基)-乙基)-4-哌啶基-1,8-萘酰亚胺(化合物T1)的合成：

(1)4-哌啶基-1.8-萘酐(中间体2)合成

在100mL两口瓶中加入5g(18.1mmol)的4-溴-1,8萘酐，加入40mL乙二醇单甲醚搅拌溶解，将2mL(20.2mmol)哌啶加入反应体系，加热至回流，磁力搅拌4h后停止反应，室温下冷却，将冷水加入反应液中，析出黄色沉淀，过滤后干燥，用硅胶柱层析提纯(洗脱液为CH₂Cl₂)得黄色固体4.77g，产率：93.6％。

(2)N-(2’-胺基乙基)-6-哌啶基-1,8-萘酰亚胺(中间体3)的合成

在100mL两口瓶中，加入20mL无水乙醇和20mL(0.3mol)乙二胺，磁力搅拌下，将4g(14.2mmol)的4-哌啶基-1,8-萘酐分批缓慢加入混合溶液中，升温至90℃反应1h。TLC跟踪至反应完全，加热停止，冷却后将反应体系倒入冷水中，静置析出黄色沉淀，抽滤，烘干。烘干后的固体盐酸水溶液重结晶，干燥得黄色产物2.45g。产率：57.4％。

(3)化合物T1的合成

在50mL两口瓶中，加入1.0g(3.1mmol)中间体3，加入20mL乙醇搅拌使溶解，再向反应瓶中加入0.49g(3.1mmol)2-溴嘧啶，磁力搅拌，加热至乙醇回流，反应3h，停止加热，冷却后将500mL左右冷水加入中反应体系，析出黄色沉淀，抽滤，水洗后烘干。硅胶柱层析提纯(洗脱液为CH₃OH:CH₂Cl₂＝1:22)得黄绿色固体0.95g。产率：76.7％。熔点：143.2-143.9℃。

+ESI MS(M+H):C₂₃H₂₃N₅O₂,计算值：401.19，实测值：401.28。

¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ8.57(dd,J＝7.3,1.1Hz,1H),8.49(d,J＝8.1Hz,1H),8.38(dd,J＝8.4,1.1Hz,1H),8.25(s,2H),7.72(dd,J＝5.7,3.3Hz,1H),7.66(dd,J＝8.4,7.3Hz,1H),7.53(dd,J＝5.7,3.3Hz,0H),7.16(d,J＝8.1Hz,1H),4.55–4.48(m,2H),4.31(t,J＝6.7Hz,1H),3.81(s,2H),3.29–3.17(m,4H),1.72(dq,J＝9.0,6.7Hz,4H),1.53–1.37(m,2H).

¹³C NMR(126MHz,CDCl₃)δ167.70(s,1H),165.00(s,2H),164.49(s,2H),162.45(s,2H),157.85(s,10H),157.41(s,2H),132.91(s,5H),131.22(s,6H),130.90(s,4H),130.70(s,5H),130.01(s,2H),128.85(s,3H),126.21(s,2H),125.31(s,5H),122.94(s,2H),114.69(s,5H),54.54(s,11H),40.70(s,5H),39.37(s,5H),26.24(s,11H),24.36(s,5H).

实施例2

N-(2’-(N’-嘧啶胺基)-乙基)-4-吗啉基-1,8-萘酰亚胺(化合物T2)的合成：

除步骤(1)中用吗啉代替哌啶外，其他同实施例1的操作，得目标化合物T2。

+ESI MS(M+H):C₂₂H₂₁N₅O₃,计算值：403.16，实测值：403.22。

¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ8.59(d,J＝7.2Hz,1H),8.52(d,J＝8.0Hz,1H),8.37(d,J＝8.3Hz,1H),8.23(d,J＝3.7Hz,2H),7.73–7.69(m,1H),7.23(d,J＝8.1Hz,1H),6.49(t,J＝4.8Hz,1H),6.03(s,1H),4.51(t,J＝5.9Hz,2H),3.83(dd,J＝11.6,5.7Hz,2H),3.54–3.45(m,4H),3.05–2.89(m,4H).

¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ164.97(s,1H),164.50(s,1H),162.35(s,1H),157.97(s,9H),155.87(s,2H),132.92(s,4H),131.53(s,4H),130.32(s,4H),130.05(s,1H),126.05(d,J＝23.8Hz,5H),123.20(s,1H),116.99(s,1H),115.05(s,4H),110.60(s,2H),67.07(s,8H),53.55(s,14H),40.78(s,2H),39.49(s,3H)

实施例3

N-(2’-(N’-嘧啶胺基)-乙基)-4-硫吗啉基-1,8-萘酰亚胺(化合物T3)的合成：

除步骤(1)中用硫吗啉代替哌啶外，其他同实施例1的操作，得目标化合物T3。

+ESI MS(M+H):C₂₂H₂₁N₅O₂S,计算值：419.14，实测值：419.20。

¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ8.59(d,J＝7.2Hz,1H),8.52(d,J＝8.0Hz,1H),8.37(d,J＝8.3Hz,1H),8.23(d,J＝3.7Hz,2H),7.73–7.69(m,1H),7.23(d,J＝8.1Hz,1H),6.49(t,J＝4.8Hz,1H),6.03(s,1H),4.51(t,J＝5.9Hz,2H),3.83(dd,J＝11.6,5.7Hz,2H),3.51–3.42(m,4H),2.89–2.34(m,4H).

¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ164.90(s,3H),164.41(s,3H),162.09(s,3H),157.85(s,13H),156.91(s,3H),132.77(s,7H),131.49(s,8H),130.07(d,J＝23.1Hz,10H),129.56(s,1H),126.52(s,5H),125.98(s,7H),123.09(s,3H),116.98(s,3H),115.99(s,7H),110.57(s,8H),55.60(s,14H),53.49(s,10H),40.70(s,8H),39.40(s,7H),28.18(s,13H).

实施例4

N-(2’-(N’-嘧啶胺基)-乙基)-4-吡咯烷基-1,8-萘酰亚胺(化合物T4)的合成：

除步骤(1)中用四氢吡咯代替哌啶外，其他同实施例1的操作，得目标化合物T4。

+ESI MS(M+H):C₂₂H₂₁N₅O₂,计算值：387.17，实测值：387.22。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.58(dd,J＝7.8,4.5Hz,2H),8.42(d,J＝8.6Hz,1H),8.24(d,J＝4.0Hz,2H),7.55–7.49(m,1H),6.80(d,J＝8.7Hz,1H),6.48(t,J＝4.8Hz,1H),6.04(s,1H),4.51(t,J＝5.8Hz,2H),3.84–3.80(m,2H),3.72(d,J＝7.0Hz,4H),2.10(t,J＝6.3Hz,4H).

¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ165.47(s,8H),164.61(s,10H),162.38(s,8H),157.99(s,48H),152.86(s,9H),133.83(s,21H),132.23(s,23H),131.44(s,31H),122.86(d,J＝49.7Hz,30H),122.55–122.48(m,1H),122.42(s,8H),110.49(d,J＝10.1Hz,26H),108.62(d,J＝4.9Hz,18H),53.32(s,65H),41.12(s,14H),39.33(s,18H),26.22(s,44H)

实施例5

体外抑制肿瘤细胞和正常细胞生长活性测定：

用四氮唑盐(microculture tetrozolium，MTT)还原法对Hela宫颈癌细胞、MCF-7乳腺癌细胞和HL7702人正常肝细胞进行体外抑制细胞生长活性测定。

四氮唑盐(MTT)还原法的具体操作是：

(1)接种细胞、培养细胞：当细胞处于对数生长期时，用胰蛋白酶将贴壁生长的细胞消化下来，收集到含血清的培养基中并稀释细胞悬液浓度为大约4×10⁵～6×10⁵个/mL。将上述培养液接种到无菌96孔板中，每孔加入100μL细胞悬液(每孔大约5000个细胞)，最外围每孔加入200μL的PBS缓冲液，为细胞生长环提供充足的水分环境。将接种后的培养板放至37℃、5％CO₂环境的培养箱中温育24h，当细胞处于对数生长期时即可加药物。

(2)添加药物：用培养基将药物稀释成2μM，20μM，40μM，80μM四个梯度浓度。每个浓度设置4个复孔来减小误差。每孔加入100μL药物溶液(此时药物浓度稀释一倍)，对照组设置8～10个复孔，对照组不加药物用培养基代替。培养板放回培养箱中温育，使药物作用24h。

(3)检测存活细胞数：取出培养板，每孔加入20μL MTT。放回培养箱中培养4h。吸出所有孔中的培养基和MTT，注意不要吸走孔底部的紫色结晶。每孔中加入200μL DMSO溶解甲臜结晶，在摇床上震荡10分钟。将96孔板放入酶标仪中测定每个孔吸光度。波长为490nm，570nm，625nm。计算细胞生长抑制率和IC₅₀值。

对化合物T1～4的体外生测结果如下：

表1.化合物T1-4对Hela，MCF-7和HL7702细胞株的IC₅₀值

从表1可以看出化合物T1-4对肿瘤细胞株Hela、MCF-7都表现出良好的抑制增殖效果，对正常细胞HL7702的抑制活性较小，具有选择性。

Claims

1.一类含2-氨基嘧啶的萘酰亚胺化合物，其特征在于，所述化合物具有通式T的结构：

T

通式T中：R选自含杂原子的六元环、、-NHCH₂CH₂OH、-NHCH₂CH₂N(CH₃)₂和-NHCH₂CH₂CH₂CH₃中的一种，所述杂原子为N、O和S原子中的至少一种，所述含杂原子的六元环中有至少一个N原子，且R通过N原子与通式T中的母核连接。

2.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，所述含杂原子的六元环选自、、和中的一种。

3.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，所述化合物是：N-(2’-(N’-嘧啶胺基)-乙基)-4-哌啶基-1,8-萘酰亚胺、N-(2’-(N’-嘧啶胺基)-乙基)-4-吗啉基-1,8-萘酰亚胺、N-(2’-(N’-嘧啶胺基)-乙基)-4-硫吗啉基-1,8-萘酰亚胺或N-(2’-(N’-嘧啶胺基)-乙基)-4-吡咯烷基-1,8-萘酰亚胺。

4.权利要求1所述的化合物的制备方法，其合成路线如下：

其中R的定义同权利要求1中的R。

5.权利要求1所述化合物在制备抑制乳腺癌MCF-7细胞和人宫颈癌Hela细胞生长药物中的应用。