CN110804039B

CN110804039B - 一类含邻苯二甲酰亚胺的1，8-萘酐类衍生物，其药学可接受的盐及其抗肿瘤药物应用

Info

Publication number: CN110804039B
Application number: CN201911109948.XA
Authority: CN
Inventors: 李晓莲; 侯晓玲
Original assignee: Dalian University of Technology
Current assignee: Dalian University of Technology
Priority date: 2019-11-13
Filing date: 2019-11-13
Publication date: 2020-08-14
Anticipated expiration: 2039-11-13
Also published as: CN110804039A

Abstract

本发明公开了一类含邻苯二甲酰亚胺类的1,8‑萘酐类衍生物、其制备方法及应用，属于生物有机合成领域。本发明含邻苯二甲酰亚胺的1,8‑萘酐类衍生物是在1,8‑萘酐上引入有抗癌活性的邻苯二甲酰亚胺药效团，以提高分子的抗肿瘤活性和选择性。本发明所述的含邻苯二甲酰亚胺的1,8‑萘酐类衍生物的制备方法，是用哌啶基取代萘酐末端的Br合成4‑哌啶基‑1，8‑萘酐,以提高其生物活性，以醇胺为桥链将萘酰亚胺母体与以不同链氨N取代的邻苯二甲酰胺药效团通过酯化反应连接到一起，研究药物分子的构效关系，合成了对体外肿瘤细胞生长有抑制力的一类含邻苯二甲酰亚胺类的1,8‑萘酐类衍生物。

Description

一类含邻苯二甲酰亚胺的1，8-萘酐类衍生物，其药学可接受的盐及其抗肿瘤药物应用

技术领域

本发明涉及生物有机合成领域中的一类含邻苯二甲酰亚胺类的1，8-萘酐类衍生物的合成及应用。

背景技术

DNA靶向抗肿瘤药物一直是医药化学和分子生物学的研究热点。DNA嵌入剂可以嵌入DNA碱基对中，改变其构象，导致DNA链解旋增长，改变DNA复制过程，表现出显著的抗肿瘤活性。萘酰亚胺类化合物作为DNA嵌入剂已经被广泛地用于抗肿瘤、抗病毒、抗锥体虫等。Brana研究组最早报道的艾莫纳菲(Amonafide)和米托纳菲(Mitonafide)对Hela细胞的IC50值分别是0.47μM和8.80μM，现已进入临床II期试验。但是二者毒性较大，临床应用受限。因此，为了降低毒性，提高抗肿瘤活性对萘酰亚胺母环进行修饰成为了研究热点。邻苯二甲酰亚胺衍生物具有抗炎、抗癫痫、抗菌、抗肿瘤等生物活性，由于其具有抗血管生成作用以及抑制TNF-α产生的作用,在抗肿瘤和免疫性疾病领域具有临床应用价值。

发明内容

本发明提供一类含邻苯二甲酰亚胺类的1，8-萘酐类衍生物的合成及应用。目的是在1，8-萘酐上引入有抗癌活性的邻苯二甲酰亚胺类药效团，以提高分子的生物学活性，从而增加抗肿瘤效果。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案是：一类含邻苯二甲酰亚胺类的抗肿瘤1，8-萘酐类衍生物，其药学可接受的盐，其化学分子结构通式如下：

通式A中:

R选自N,N-二乙基乙二胺基、N,N-二甲基乙二胺基、N,N-二甲基丙二胺基、N,N-二乙基-1,3-丙二胺基、N-氨乙基哌嗪基；

即为

本发明所述的含邻苯二甲酰亚胺类的1，8-萘酐类衍生物，一方面以4-溴-1，8-萘酐为起始原料，在萘酐4位引入哌啶基，合成4-哌啶基-1，8-萘酐。继续与正丙醇胺进行氨基缩合反应合成中间体N-(3’-羟基-丙基)-4-哌啶基-1，8-萘酐。另一方面从4-羧基邻苯二甲酸酐开始，与不同脂肪胺反应分别合成中间体N-(N,N-二乙基乙二胺基)-5-羧基邻苯二甲酰亚胺，N-(N,N-二甲基乙二胺基)-5-羧基邻苯二甲酰亚胺和N-(N,N-二甲基丙二胺基)-5-羧基邻苯二甲酰亚胺、N-(N,N-二乙基-1,3-丙二胺基)-5-羧基邻苯二甲酰亚胺、N-(N-氨乙基哌嗪基)-5-羧基邻苯二甲酰亚胺。最后，中间体N-(3’-羟基-丙基)-4-哌啶基-1，8-萘酐与上述邻苯二甲酰亚胺中间体缩合成酯生成目标化合物。

所述的脂肪胺选自N，N-二乙基乙二胺、N，N-二甲基乙二胺、N，N-二甲基丙二胺、N,N-二乙基-1,3-丙二胺、N-氨乙基哌嗪。

上述的含苯二甲酰亚胺类的抗肿瘤1，8-萘酐类衍生物的合成路线如下：

用上述合成的含邻苯二甲酰亚胺类的1，8-萘酐类衍生物用MTT还原法对乳腺癌MCF-7细胞、人宫颈癌Hela细胞、肝癌HepG2细胞和正常肝细胞HL7702进行体外抑制肿瘤细胞生长活性的测定，结果表明，该类化合物对乳腺癌、人宫颈癌、肝癌等癌细胞具有抑制生长的效果，对正常细胞的抑制较弱，具有较好的选择性。

本发明提供上述衍生物、其药学可接受的盐为活性成分制备的高效的DNA靶向抗肿瘤药物。

本发明提供上衍生物、其药学可接受的盐在制备抑制肿瘤细胞药物中的应用。

进一步地，在上述技术方案中，所述的肿瘤细胞为乳腺癌MCF-7细胞、人宫颈癌Hela细胞和肝癌HepG2细胞。

用四氮唑盐还原法对乳腺癌MCF-7细胞、人宫颈癌Hela细胞、肝癌HepG2细胞和正常肝细胞HL7702以4000-5000个/孔接种于96孔培养板内，培养12h后加入梯度浓度药液100μL/孔，对每个肿瘤细胞株，设置5个复孔，另设无细胞调零孔；肿瘤细胞在37℃、5％CO₂条件下培养24h后，加5mg/mL的MTT液继续培养4h后，加入DM76SO溶解结晶，然后用酶标仪测OD值。

附图说明

图1为化合物N3与不同浓度的DNA相互作用的紫外吸收光谱图；

图2为化合物N3与不同浓度DNA相互作用的荧光发射光谱图。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1

目标化合物N1的合成：

(1)中间体1 4-哌啶基-1，8-萘酐的合成：

取2.77g(10mmol)4-溴-1,8-萘酐置于100mL的双颈圆底烧瓶中，加入40mL乙二醇单甲醚作为溶剂，加入0.92mL(10mmol)哌啶，升温至125℃，搅拌并回流3小时，冷却至室温，倒入200mL水中析出沉淀，抽滤，干燥，得到2.6g产物，产率92.44％，熔点：176.0-177.5℃。

(2)中间体2 N-(3’-羟基-丙基)-4-哌啶基-1，8-萘酐的合成：

取2.5g(8.8mmol)4-哌啶基-1,8-萘酐置于100mL的双颈圆底烧瓶中，加入30mL无水乙醇作为溶剂，搅拌并加入正丙醇胺0.74mL(9.68mmol)，升温回流3小时，冷却至室温，倒入150mL水中析出沉淀，抽滤，干燥，得到2.3g产物，产率77.11％。

(3)中间体3 N-(N,N-二乙基乙二胺基)-5-羧基邻苯二甲酰亚胺的合成：

取1.9g(10mmol)4-羧基邻苯二甲酸酐置于100mL的双颈圆底烧瓶中，加入30mL冰醋酸作为溶剂，搅拌并滴加N,N-二乙基乙二胺1.39mL(10mmol)，升温回流6小时，冷却至室温，析出沉淀，抽滤，水洗，干燥，得到1.8g产物，产率62.06％。

(4)终产物N1的合成：

称取3.18g(10mmol)中间体2(N-(3’-羟基-丙基)-4-哌啶基-1，8-萘酐),2.9g(10mmol)中间体3(N-(N,N-二乙基乙二胺基)-5-羧基邻苯二甲酰亚胺)和1.2g(10mmol)4-二甲氨基吡啶(DMAP)置于100mL的双颈圆底烧瓶中，加入30mL无水二氯甲烷作为溶剂，搅拌并加入6.2g(30mmol)N二环己基碳二甲胺(DCC)，室温搅拌24小时，产物使用硅胶柱层析法进行分离提纯，洗脱剂为二氯甲烷：甲醇＝30:1，得到3.3g终产物N1，产率54.23％，熔点：212.5-214.4℃。

+ESI HRMS(M+H):C₃₅H₃₈N₄O₆,计算值：610.2791，实测值：611.2865。

1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.52(dd,J＝7.8,5.2Hz,2H),8.44(d,J＝8.1Hz,1H),8.38(d,J＝5.0Hz,2H),8.30(s,1H),7.76–7.71(m,1H),7.66–7.61(m,1H),7.13(d,J＝8.1Hz,1H),4.51(t,J＝5.5Hz,4H),4.41(dd,J＝11.3,6.7Hz,5H),3.80(dd,J＝11.5,6.8Hz,4H),3.21(d,J＝4.9Hz,4H),2.74(s,2H),2.60(dd,J＝7.1,1.9Hz,6H),2.30(d,J＝6.3Hz,4H),

实施例2

目标化合物N2的合成：

(1)中间体1 4-哌啶基-1，8-的合成：

(2)中间体2 N-(3’-羟基-丙基)-4-哌啶基-1，8-萘酐的合成：

(3)中间体4 N-(N,N-二甲基乙二胺基)-5-羧基邻苯二甲酰亚胺的合成：

取1.9g(10mmol)4-羧基邻苯二甲酸酐置于100mL的双颈圆底烧瓶中，加入30mL冰醋酸作为溶剂，搅拌并滴加N,N-二甲基乙二胺1.10mL(10mmol)，升温回流6小时，冷却至室温，析出沉淀，抽滤，水洗，干燥，得到1.7g产物，产率66.51％。

(4)终产物N2的合成：

称取3.18g(10mmol)中间体2(N-(3’-羟基-丙基)-4-哌啶基-1，8-萘酐),2.6g(10mmol)中间体4(N-(N,N-二甲基乙二胺基)-5-羧基邻苯二甲酰亚胺)和1.2g(10mmol)4-二甲氨基吡啶(DMAP)置于100mL的双颈圆底烧瓶中，加入30mL无水二氯甲烷作为溶剂，搅拌并加入6.2g(30mmol)N二环己基碳二甲胺(DCC)，室温搅拌24小时，产物使用硅胶柱层析法进行分离提纯，洗脱剂为二氯甲烷：甲醇＝30:1，得到3.3g终产物N2，产率56.55％，熔点：202.1-203.6℃。

+ESI HRMS(M+H):C₃₃H₃₄N₄O₆,计算值：582.2478，实测值：583.2536。

1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.54(d,J＝7.1Hz,1H),8.46(d,J＝8.1Hz,1H),8.40(d,J＝5.4Hz,1H),8.35(d,J＝8.9Hz,1H),8.28(d,J＝8.0Hz,1H),7.74(d,J＝7.7Hz,1H),7.65(t,J＝7.8Hz,1H),7.14(d,J＝8.1Hz,1H),4.50(t,J＝5.9Hz,3H),4.40(t,J＝6.3Hz,3H),4.12(q,J＝7.1Hz,2H),3.86(t,J＝5.9Hz,3H),3.22(s,4H),2.69(s,2H),2.31–2.26(m,3H),1.89(s,4H),1.72(s,2H).

实施例3

目标化合物N3的合成：

(1)中间体1 4-哌啶基-1，8-的合成：

(2)中间体2 N-(3’-羟基-丙基)-4-哌啶基-1，8-萘酐的合成：

(3)中间体5 N-(N,N-二甲基乙二胺基)-5-羧基邻苯二甲酰亚胺的合成：

取1.9g(10mmol)4-羧基邻苯二甲酸酐置于100mL的双颈圆底烧瓶中，加入30mL冰醋酸作为溶剂，搅拌并滴加N,N-二甲基乙二胺1.27mL(10mmol)，升温回流6小时，冷却至室温，析出沉淀，抽滤，水洗，干燥，得到1.9g产物，产率68.84％。

(4)终产物N3的合成：

称取3.18g(10mmol)中间体2(N-(3’-羟基-丙基)-4-哌啶基-1，8-萘酐),2.8g(10mmol)中间体5(N-(N,N-二甲基乙二胺基)-5-羧基邻苯二甲酰亚胺)和1.2g(10mmol)4-二甲氨基吡啶(DMAP)置于100mL的双颈圆底烧瓶中，加入30mL无水二氯甲烷作为溶剂，搅拌并加入6.2g(30mmol)N二环己基碳二甲胺(DCC)，室温搅拌24小时，产物使用硅胶柱层析法进行分离提纯，洗脱剂为二氯甲烷：甲醇＝30:1，得到3.1g终产物N3，产率52.01％，熔点205.1-206.7℃。

+ESI HRMS(M+H):C₃₄H₃₆N₄O₆,计算值：596.2635，实测值：597.2697

1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.55–8.52(m,1H),8.45(d,J＝8.1Hz,1H),8.39(d,J＝7.7Hz,1H),8.35(d,J＝7.8Hz,1H),8.30(s,1H),7.75(d,J＝7.7Hz,1H),7.67–7.61(m,1H),7.14(d,J＝8.1Hz,1H),4.51(dd,J＝8.0,4.0Hz,3H),4.41(dd,J＝12.2,6.6Hz,3H),3.76(td,J＝7.2,3.2Hz,3H),3.48(s,2H),3.21(d,J＝4.9Hz,4H),2.42(t,J＝7.4Hz,3H),2.33–2.28(m,2H),1.92–1.84(m,6H),1.73(d,J＝5.1Hz,2H).

表征1 N系列化合物紫外吸收光谱与荧光发射光谱

由于化合物N₁、N₂、N₃均有黄色荧光，本实验对N系列三个化合物进行了光谱测试，经荧光测试，以二氯甲烷为溶剂，化合物N₁的荧光量子产率为0.358，化合物N₂的荧光量子产率为0.395，化合物N₃的荧光量子产率为0.227。

表一为三个化合物在不同极性溶剂中的最大吸收波长λ_abs(nm)，最大发射波长λ_em(nm)，斯托克斯位移Δλ(nm)。

表1 N系列化合物在不同极性溶剂中的光谱数据

表征2 N系列化合物与DNA作用紫外吸收光谱与荧光发射光谱

本实验对N系列三个化合物进行了全部测试，由于化合物N3在体外抗肿瘤测试中表现出了优良的抗肿瘤增殖特性。在这里以N3为例来说明N系列化合物与DNA的相互作用。图1为化合物N3与不同浓度的DNA相互作用的紫外吸收光谱图。图2为化合物N3与不同浓度DNA相互作用的荧光发射光谱图。由图1、图2可知N3与DNA发生了嵌插作用。图1中化合物N3与不同浓度的DNA混合之后吸收峰的强度降低，吸收峰的位置发生了微弱的红移。从一定程度上说明含邻苯二甲酰亚胺的萘酰亚胺衍生物部分能与DNA发生嵌插作用。同样图2中可以看到随着DNA浓度的增加，化合物N3的荧光逐渐增强，此外化合物N3荧光峰的位置也随着DNA浓度增加而发生了蓝移。因此含邻苯二甲酰亚胺的萘酰亚胺衍生物部分能与DNA发生嵌插作用，抑制DNA的复制，从而抑制肿瘤细胞的增殖。

应用例1：体外抗肿瘤活性抑制实验

为了检测目标化合物的潜在抗肿瘤活性，本实验采用MTT比色法进行了体外抗肿瘤活性测试。MTT全称为3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，是一种黄颜色的染料。MTT比色法是一种检测活细胞存活和生长的方法，它的检测原理是存在于活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为非水溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)并且沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中沉积的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm、570nm、625nm波长处测定其光吸收值，可间接地反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，甲瓒的沉积量与细胞的数目是成正比的。目前该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。

本实验选用人体乳腺癌细胞MCF-7，人体宫颈癌细胞Hela细胞、肝癌细胞HepG2和正常肝细胞HL7702进行体外抗肿瘤活性的测试。实验步骤如下：

(1)接种细胞从液氮中取出相应细胞株的冻存管，对细胞株进行细胞复苏，之后加入培养液培养并且传代，待到细胞生长到对数期之后，用培养液稀释细胞悬浮液，取无菌96孔板接种细胞，内60个孔内每孔加入100μL细胞悬浮液，约5000个细胞。外围36个加入PBS缓冲液。之后将96孔板置于37℃，5％CO₂条件的恒温培养箱中培养12小时，保证细胞贴壁生长。

(2)加药取母液浓度为1×10^-3mol/L的化合物溶液(溶剂为DMSO)稀释成五个梯度浓度，分别为50μM、20μM、10μM、5μM、1μM，每孔加入100μL药物(由于孔中原有100μL培养液，故而实际作用的药物浓度是说配置药物浓度的一半)，每个药物浓度设置5个复孔以减小误差。最外侧设置空白对照空，只加入100μL培养液。加药结束之后将96孔板置于37℃，5％CO₂条件的恒温培养箱中培养24小时。

(3)MTT还原MTT粉末用PBS配制为5mg/mL的溶液，在避光条件下，每孔加入20μLMTT溶液，置于培养箱中作用4小时，之后用移液枪小心地吸出上清液，每孔加入150μLDMSO溶解甲瓒结晶。将处理好的96孔板置于水平摇床震荡10分钟，在酶联免疫检测仪测定490nm、570nm、625nm下各个孔的吸光值。

(4)IC₅₀计算目标化合物对于细胞生长的IC₅₀值是指细胞被抑制一半时抑制剂的浓度，其计算采用寇式改良公式：lgIC₅₀＝Xm-I[P-(3-Pm-Pn)/4]，其中Xm＝lg(最大浓度)，I＝lg(最大浓度/相邻浓度)，P＝抑制率之和，Pm＝最大抑制率，Pn＝最小抑制率。

表2化合物N1-3对MCF-7、Hela、HepG2和HL7702细胞株的IC₅₀值

化合物N1、N2、N3对MCF-7、Hela、HepG2癌细胞系和肝细胞非癌性细胞系的细胞毒性IC₅₀在表2表明，化合物N3对MCF-7、Hela、HepG2癌细胞系的IC₅₀分别为31.3μM、23.3μM、48.3μM，而对正常的的肝癌细胞HL7702为136μM，具有较好的选择性。化合物N2对MCF-7、HelaHepG2癌细胞系的IC₅₀分别为39.5μM、32.2μM、35.4μM，对肿瘤细胞展现了很好地抑制效果，而且对正常的肝癌细胞HL770的IC₅₀为211μM，对癌细胞和正常细胞展现出较好地选择性。

Claims

1.由式A表示的一类含邻苯二甲酰亚胺的1，8-萘酐类衍生物，其药学可接受的盐：

通式A中:

R选自

2.以权利要求1所述衍生物、其药学可接受的盐为活性成分制备的高效的DNA靶向抗肿瘤药物。

3.如权利要求1所述的衍生物、其药学可接受的盐在制备抑制肿瘤细胞药物中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述的肿瘤细胞为乳腺癌MCF-7细胞、人宫颈癌Hela细胞和肝癌HepG2细胞。