CN112010838B - 一种基于萘酰亚胺-吲哚衍生物的细胞内质网荧光探针及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于萘酰亚胺‑吲哚衍生物类的细胞内质网荧光探针及其应用。本发明所述荧光探针是一种萘酰亚胺‑吲哚衍生物类染料,荧光量子产率高、双光子吸收截面积大,其结构通式如式Ⅰ所示。本发明合成工艺简便,反应条件温和,产率较高;原料易得,制备成本低廉;所述内质网荧光探针定位特异性高,可用于活细胞或活体的时间分辨荧光成像和双光子荧光成像。
Description
技术领域
本发明属于小分子荧光材料领域,涉及一种基于萘酰亚胺-吲哚衍生物类的细胞内质网荧光探针及其应用。
背景技术
内质网(endoplasmic reticulum,ER)是由细胞质中单位膜围成的小管(tubule),小泡(vesicle)或扁囊(cisternae)连接成的三维网状膜系统,约占细胞内膜面积的二分之一,内质网形态和组成具有高度多样性和动态性,与细胞的类型和状态密切相关。内质网是真核细胞中重要细胞器,参与细胞的多个生理过程,细胞内蛋白质后修饰与加工(如糖基化、羟基化等)、新生肽链的折叠、组装和运输,细胞内的磷脂、胆固醇等脂类的合成代谢、糖原的合成、以及钙离子的储存等均与内质网的功能有关,因此,内质网对维持细胞生理活动和功能具有重要意义。蛋白异常表达、病毒感染、抑制剂以及钙调节异常等内外诱导因子都可导致内质网应激,从而诱发神经退行性疾病、糖尿病和癌症等多种疾病。因此,对内质网形态、分布的实时动态成像和示踪,可帮助深入理解内质网在细胞生理过程中的作用以及相关疾病发生、发展机制。
有机小分子荧光探针因其高灵敏度,特异性,快速响应和简单易得而成为生物传感和生物成像的强大工具。目前使用较多的商用内质网荧光探针为DiOC6(3,3’-dihexyloxacarbocyanine iodide)和ER-Tracker系列,但DiOC6内质网定位选择性不高,低浓度时主要定位线粒体;而ER-Tracker探针靶向内质网上的钾离子通道蛋白的磺脲类(sulphonylurea)受体,影响细胞内正常生理活动,且价格昂贵。近年来,活细胞中靶向内质网结构的新型有机荧光探针已有报道,但探针数量远远不够,无法满足对内质网研究的需要,且这些探针普遍存在合成步骤繁琐、分子量大、结构复杂、定位特异性不高、干扰内质网正常生理功能、以及荧光背景干扰大、无法用于活细胞长时间成像等问题。双光子染料利用长波长的近红外光作为激发光,光漂白和光毒性小,适用于活细胞成像。萘酰亚胺是优秀的双光子染料,其荧光量子产率高、双光子吸收截面积大。吲哚是重要的杂环化合物,吲哚衍生物在自然界分布广泛,吲哚衍生物常与生命活动密切相关,如N-乙酰基-5-甲氧基色胺(CAS号:73-31-4),即褪黑素(又称为褪黑激素、美拉酮宁、抑黑素、松果腺素),是一种胺类激素,具有抗衰老、调节免疫、抗肿瘤等多种生理功能。目前以1,8-萘二甲酰亚胺为荧光母体的吲哚衍生物作为高特异性内质网荧光探针还未见报道,因此,设计合成这类1,8-萘二甲酰亚胺-吲哚类衍生物,利用该类探针对内质网进行荧光成像或双光子荧光成像,对内质网形态和分布进行实时观察,对于研究内质网的生理过程及内质网相关疾病发生、发展机制,具有重要研究意义和价值。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于萘酰亚胺-吲哚衍生物类的细胞内质网荧光探针及其应用。本发明提供的1,8-萘二甲酰亚胺-吲哚衍生物荧光背景小、双光子吸收截面大、内质网定位特异性高。
本发明提供的基于萘酰亚胺-吲哚衍生物类的细胞内质网荧光探针,也即式Ⅰ所示化合物,
所述式Ⅰ中,R1和R2独立选自H、基团a至基团f中任意一种;
R3和R4独立地选自H和基团a中任意一种;
所述基团a为含有N、O、S或卤素的碳原子数为1~9的直链、支链或成环的烷基;
所述基团b为含有取代基的所述基团a;
所述基团c为碳原子数为6~10的芳基;
所述基团d为含有取代基的碳原子数为6~10的芳基;
所述基团e为含有N、O、S或卤素的碳原子数为1~9的直链、支链或成环的杂环基;
所述基团f为含有取代基的所述基团e;
所述取代基选自羟基、胺基、巯基、碳原子数1-6的烷氧基、羰基和卤素中的一种。
上述式Ⅰ中,所述基团e为含有N、O或S的五元、六元或七元杂环或苯并杂环基;
所述芳基为苯基或萘基;
更具体的,所述碳原子数为1~9的直链、支链或成环的烷基中,碳原子数具体为1、2、3、4、5、6、7、8或9;
所述碳原子数1-6的烷氧基中,碳原子数具体为1、2、3、45或6;
再具体的,所述R1和R2选自H、碳原子数为1-6的烷氧基或-O-C6H5中任意一种;更具体为H或甲氧基或-O-C6H5;
所述R3和R4选自-(CH2)2-、-(CH2)2-NHCO-(CH2)3-或-NH-(CH2)3-CONH-(CH2)2-;
所述式Ⅰ所示化合物具体为式Ⅱ至式Ⅵ所示化合物中任意一种:
本发明提供的制备所述式I所示化合物的方法,包括:
将式Ⅶ所示化合物、亲核试剂和缚酸剂于溶剂中进行亲核取代反应,得到所述式Ⅰ所示化合物;
所述式Ⅶ中,R1和R3的定义与式Ⅰ中的定义相同。
上述方法中,所述亲核试剂为氨基-吲哚衍生物;具体选自5-甲氧基色胺、色胺、5-甲基色胺、5-氟色胺、5-氯色胺、2-甲基色胺、6-甲氧基色胺、5-羟色胺、7-甲基色胺和5-苄氧基色胺中任意一种;
所述缚酸剂为碱盐;具体选自碳酸钾、碳酸钠、氢氧化钠、氢氧化钾、氢化钠和氢化钾中任意一种;
所述亲核取代反应在溶剂中进行;所述溶剂具体选自二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺,N,N-二甲基乙酰胺的至少一种;
所述式Ⅶ所示化合物与氨基-吲哚衍生物的投料摩尔比为1:1.5-2.5;具体为1:2;
所述式Ⅶ所示化合物与碱盐的投料摩尔比为1:1.5-4;具体为1:2.6;
所述亲核取代反应步骤中,温度为20℃-120℃;具体为85℃;时间为4-24h;具体为12h。
所述方法还包括:在所述亲核取代反应步骤之后,将反应体系干燥和纯化;所述纯化具体为用柱层析分离和高效液相色谱纯化;
具体的,所述用柱层析分离步骤中,淋洗液为二氯甲烷:甲醇=100:1(v/v);
所述高效液相色谱纯化步骤中,色谱柱为Promisil-C18柱(250mm×4.6mm,20μm),流动相为甲醇-水,梯度洗脱,洗脱程序:0-25min,甲醇40%-95%,25-30min,甲醇95%;检测波长为450nm;柱温为25℃;体积流量为1.0mL·min-1;进样量为100μL。
本发明还要求保护一种试剂盒,由式Ⅰ所示化合物和溶剂组成;
所述式Ⅰ所示化合物在所述溶剂中的浓度为0.1~100μM;
所述溶剂具体为PBS缓冲液、HEPES缓冲液、细胞培养基或二甲基亚砜。
上述试剂盒中,所述细胞培养基为RPMI-1640和DMEM。
另外,上述本发明提供的式Ⅰ所示化合物或所述试剂盒在活细胞、固定细胞、组织或活体中内质网荧光成像或双光子荧光成像的应用,也属于本发明的保护范围。
本发明还要求保护上述式I所示化合物或试剂盒在制备活细胞、固定细胞、组织或活体中内质网荧光成像或双光子荧光成像的产品中的应用;
具体的,所述活细胞为癌细胞;具体为HeLa细胞(人宫颈癌细胞)、A549细胞(人肺癌细胞)、DU145细胞(人前列腺癌)、U87-MG(恶性神经胶质瘤/胶质母细胞瘤)和SH-SY5Y细胞(人神经母细胞瘤);
所述固定细胞为应用甲醛、戊二醛、甲醇、乙醇、丙酮中的一种或多种固定剂所固定的细胞。
本发明还要求保护制备式Ⅰ时所用中间体化合物,也即式Ⅶ所示化合物,
所述式Ⅶ中,R1和R3的定义与式Ⅰ中的定义相同。
本发明提供的制备式VI所示化合物的方法,包括:将4-卤代-1,8-萘二酐与氨基-吲哚衍生物在溶剂中加热回流进行酰基化反应而得。
上述方法中,所述4-卤代-1,8-萘二酐为4-氟-1,8-萘二酐、4-氯-1,8-萘二酐、4-溴-1,8-萘二酐或4-碘-1,8-萘二酐;
所述氨基-吲哚衍生物具体可为5-羟基甲氧基色胺;
所述溶剂为醇类溶剂;具体选自甲醇、乙醇、苯甲醇和乙二醇中至少一种;
所述4-溴-1,8-萘二酐与氨基-吲哚衍生物的投料摩尔比为1:1-1.5;
所述酰基化反应步骤中,温度为78-85℃;时间为2-8h。
本发明具有如下有益效果:
1、本发明所述内质网荧光探针,定位特异性高,适合活细胞或活体的时间分辨荧光成像和双光子荧光成像,具有广阔的应用前景。
2、本发明仅需两步合成,工艺简便;反应条件温和,无需催化剂,产率较高,两步最终产率可达50%;原料易得,制备成本低廉,成本远远低于市售内质网探针市场价。本发明涉及到的原料4-溴-1,8-萘二酐成本价格为395元/500克(纯度96%,上海毕得医药科技有限公司),吲哚类衍生物如色胺成本价格为468元/100克(纯度97%,上海韶远试剂有限公司),5-甲氧基色胺成本为39元/100克(纯度97%,上海阿拉丁生化科技股份有限公司),其他原料便宜易得,应用本发明所得1,8-萘二甲酰亚胺-吲哚类衍生物的细胞内质网探针原料成本仅为0.001-0.005元/100微克;而市售内质网探针ER-TrackerTM Green(BODIPYTM FLGlibenclamide)市场价为5297.00元/100微克。本发明合成工艺简便,合成原料价格低廉,易于推广。
附图说明
图1为实施例1荧光探针采用的合成线路图。
图2为实施例1荧光探针在DMSO中的核磁共振谱图(氢谱)。
图3为实施例1荧光探针在DMSO中的核磁共振谱图(碳谱)。
图4为实施例1荧光探针在不同溶剂中的紫外吸收光谱图。
图5为实施例1荧光探针在不同溶剂中的荧光发射光谱图。
图6为2.0μM的实施例1荧光探针分别与HeLa细胞(人宫颈癌细胞)、A549细胞(人肺癌细胞)、DU145细胞(人前列腺癌)、U87-MG(恶性神经胶质瘤/胶质母细胞瘤)和SH-SY5Y细胞(人神经母细胞瘤)孵育30min后在445nm激发的共聚焦荧光成像照片。
图7为实施例1荧光探针分别与市售细胞染色探针(内质网,溶酶体,线粒体,微丝和微管)在HeLa细胞内共孵育后的共聚焦荧光成像照片以及共定位情况分析,其中图(a)为2.0μM实施例1荧光探针染色HeLa细胞后在445nm激发下接收460-560nm的荧光照片;图(b)为市售细胞亚显微结构染色探针(内质网,溶酶体,线粒体,微丝和微管)染色HeLa细胞后在561nm激发下接收590-690nm的荧光照片;图(c)为实施例1荧光探针与市售探针共同染色HeLa细胞在445nm和561nm激发下的荧光照片;图(d)为实施例1荧光探针荧光与市售探针荧光的共定位分析和皮尔森相关系数。
图8为2.0μM实施例1荧光探针与不同浓度(0,0.1,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0和1.2μM)衣霉素处理24h后的HeLa活细胞孵育30min后在445nm激发下接收460-560nm的共聚焦荧光成像照片。
图9为实施例1荧光探针在HeLa活细胞内孵育的在800nm激发下双光子荧光成像照片,其中图(a)为不加荧光探针的空白细胞在800nm激发下双光子荧光成像照片;图(b)为2.0μM实施例1荧光探针与HeLa活细胞孵育30min的在800nm激发下接收495-540nm的双光子荧光成像照片。
图10为实施例1荧光探针对HeLa细胞的毒性实验。
图11为实施例2式Ⅲ至式Ⅵ所述荧光探针与市售细胞内质网染色探针在HeLa细胞内共孵育后的共聚焦荧光成像照片以及共定位情况分析,其中图(a)为2.0μM式Ⅲ至式Ⅵ所述荧光探针染色HeLa细胞后在445nm激发下接收460-560nm的荧光照片;图(b)为市售细胞内质网染色探针染色HeLa细胞后在561nm激发下接收590-690nm的荧光照片;图(c)为实施例2式Ⅲ至式Ⅵ所述荧光探针与市售内质网探针共同染色HeLa细胞在445nm和561nm激发下的荧光照片;图(d)为实施例2式Ⅲ至式Ⅵ所述荧光探针与市售探针荧光的共定位分析和皮尔森相关系数。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述,但本发明并不限于以下实施例。所述方法如无特别说明均为常规方法。所述原材料如无特别说明均能从公开商业途径获得。
实施例1、式Ⅱ所述荧光探针定位细胞内质网
一、式Ⅱ所述探针的合成
如图1所示,按照如下步骤合成:
将290mg(1.05mmol)的4-溴-1,8-萘二酐加入到15mL的乙醇和25mL的单颈圆底烧瓶中。在75℃-85℃回流10分钟后,当温度冷却时,缓慢加入200mg(1.05mmol)5-甲氧基色胺。然后将反应物再搅拌2小时进行酰基化反应,溶液变澄清时停止。加入大量水以沉淀产物。真空过滤,收集过滤的固体,用水和乙醇洗涤各洗涤2次,真空干燥。得到产物,N-甲氧基色胺-4-溴-1,8-萘二甲酰亚胺,为淡黄色固体(90%收率)。
N-甲氧基色胺-4-溴-1,8-萘二甲酰亚胺(50mg,0.11mmol),5-甲氧基色胺(42mg,0.22mmol)和K2CO3(40mg,0.29mmol)将其溶于2mL DMSO中。混合物在85℃下搅拌12小时进行亲核取代反应。冷却溶剂、减压蒸发,得到粗产物。
将粗产物溶于二氯甲烷中,并通过硅胶色谱法(CH2Cl2/MeOH,v/v,100:1)纯化,得到化合物为黄色固体(53%收率)。然后,通过高效液相色谱进一步纯化化合物。高效液相色谱分离纯化步骤为色谱柱为Promisil-C18柱(250mm×4.6mm,20μm),流动相为甲醇-水,梯度洗脱,洗脱程序:0-25min,甲醇40%-95%,25-30min,甲醇95%;检测波长为450nm;柱温为25℃;体积流量为1.0mL·min-1;进样量为100μL,高效液相色谱仪(HPLC)为SPD-20A检测器和LC-20AT双泵(岛津,日本)。
利用核磁共振谱(氢谱和碳谱,分别如图2和图3所示)和质谱结构验证数据如下:1HNMR(500MHz,DMSO-d6)δ10.69(d,J=18.8Hz,2H),8.70(d,J=8.5Hz,1H),8.48(d,J=7.2Hz,1H),8.32(d,J=8.5Hz,1H),7.92(t,J=5.4Hz,1H),7.69(t,J=7.8Hz,1H),7.27(d,J=2.2Hz,1H),7.26–7.22(m,3H),7.18(d,J=2.0Hz,1H),7.03(d,J=2.2Hz,1H),6.89(d,J=8.7Hz,1H),6.73(ddd,J=8.7,6.4,2.4Hz,2H),4.34–4.22(m,2H),3.76(s,3H),3.73–3.65(m,5H),3.12(t,J=7.3Hz,2H),3.02–2.94(m,2H).13C NMR(126MHz,DMSO-d6)δ164.29,163.43,153.51,153.48,151.07,134.83,131.93,131.82,131.20,130.03,129.08,128.12,128.04,124.74,124.14,123.88,122.44,120.67,112.56,111.89,111.64,111.51,108.10,104.40,100.92,100.48,55.74,55.47,44.25,24.41,24.35.MS(MALDI-TOF):exact masscalcd.for C34H30N4O4([M+H]+)requires m/z 558.23,found m/z 558.9(M+H)+,580.9(M+K)+。
二、式Ⅱ所述探针在不同溶剂中的紫外-可见吸收光谱和荧光发射光谱图
将上述步骤一制备得到的式Ⅱ所述分子溶解于二甲基亚砜DMSO中,配制得到浓度为10mM的母液。
将式Ⅱ所述荧光分子母液溶解在不同溶剂里(甲醇、乙醇、乙腈、乙酸乙酯、生理盐水PBS、二氯甲烷、水、二甲基亚砜、N,N’-二甲基甲酰胺),溶液终体积为600μL,终浓度为100μM,将探针溶液放置于石英皿中,在Hitachi U-2550型紫外可见吸收光谱仪(日本京都)上测其在350nm和550nm之间的紫外-可见(UV-Vis)吸收光谱,如图4所示,在不同有机溶剂中式Ⅱ所述探针的最大吸收波长略有不同,在二氯甲烷、乙腈和乙酸乙酯中最大吸收波长为430nm,在甲醇、乙醇、二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺中最大吸收波长为445nm,而在水中最大吸收波长为475nm,在生理盐水中几乎无吸收,说明随着有机溶剂极性增加式Ⅱ所述荧光分子呈现聚集倾向,最大吸收波长红移,在盐溶液中完全聚集。
将式Ⅱ所述荧光分子母液溶解在不同溶剂里(甲醇、乙醇、乙腈、乙酸乙酯、生理盐水PBS、二氯甲烷、水、二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺),探针溶液终体积为200μL,终浓度为2μM,将探针溶液放置于石英皿中,在Hitachi F-4600荧光光谱仪(日本京都)上用450nm的激发光测其在470-600nm的荧光发射光谱,如图5所示,式Ⅱ所述荧光分子在不同溶剂中的荧光强度从强到弱排列为:乙酸乙酯>二氯甲烷>乙腈>N,N’-二甲基甲酰胺>二甲基亚砜>乙醇>甲醇>水>生理盐水PBS。
三、式Ⅱ所述探针对活细胞内质网的激光共聚焦成像
(1)配制工作液
将式Ⅱ所述探针用二甲基亚砜DMSO配制成10mM母液,加入无血清培养基中分别配制2μM工作液。
(2)染色和细胞成像
HeLa(人宫颈癌细胞),A549(人非小细胞肺癌细胞)和DU145(人前列腺癌细胞)细胞购自中国科学院上海生物科学中心细胞库,U87-MG(恶性神经胶质瘤/胶质母细胞瘤细胞)和SH-SY5Y(神经母细胞瘤细胞)细胞购自中国医学科学院基础医学研究所细胞培养中心(中国,北京)。HeLa,A549及DU145细胞在RPMI-1640细胞培养基(Gibco公司,美国)中培养,培养基中都含10%胎牛血清(Gibco公司,美国)和1%青/链霉素(Gibco公司,美国)。U87-MG细胞在DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)细胞培养基(Gibco公司,美国)中培养,培养基中都含10%胎牛血清和1%青/链霉素。SH-SY5Y细胞在1640细胞培养基中培养,培养基中含15%灭活胎牛血清和1%青/链霉素。所有细胞在培养箱中37℃,5%CO2条件下常规培养。
HeLa细胞(密度为2×105个细胞/皿)接种在玻璃底共聚焦细胞培养皿(NESTBiotechnology Co.Ltd)中,培养24小时。将2μM的式Ⅱ所述探针与细胞在培养基中于37℃孵育30min,孵育后细胞用PBS生理盐水洗三次,随后加入1mL无血清的培养基待成像用。荧光成像通过Olympus FV3000共聚焦激光扫描显微镜观察。通过445nm蓝紫色泵浦激光器激发,收集460-560nm的荧光,使用100×油物镜获取图像(800×800像素)并由OlympusFV31S-SW viewer软件处理,如图6所示,式Ⅱ所述探针在HeLa细胞内有明亮的荧光信号。
A549细胞(密度为2×105个细胞/皿)接种在玻璃底共聚焦细胞培养皿(NESTBiotechnology Co.Ltd)中,培养24小时。将2μM的式Ⅱ所述探针与细胞在培养基中于37℃孵育30min,孵育后细胞用PBS生理盐水洗三次,随后加入1mL无血清的培养基待成像用。荧光成像通过Olympus FV3000共聚焦激光扫描显微镜观察。通过445nm蓝紫色泵浦激光器激发,收集460-560nm的荧光,使用100×油物镜获取图像(800×800像素)并由OlympusFV31S-SW viewer软件处理,如图6所示,式Ⅱ所述探针在A549细胞内有明亮的荧光信号。
DU145细胞(密度为2×105个细胞/皿)接种在玻璃底共聚焦细胞培养皿(NESTBiotechnology Co.Ltd)中,培养24小时。将2μM的式Ⅱ所述探针与细胞在培养基中于37℃孵育30min,孵育后细胞用PBS生理盐水洗三次,随后加入1mL无血清的培养基待成像用。荧光成像通过Olympus FV3000共聚焦激光扫描显微镜观察。通过445nm蓝紫色泵浦激光器激发,收集460-560nm的荧光,使用100×油物镜获取图像(800×800像素)并由OlympusFV31S-SW viewer软件处理,如图6所示,式Ⅱ所述探针在DU145细胞内有明亮的荧光信号。
U87-MG细胞(密度为2×105个细胞/皿)接种在玻璃底共聚焦细胞培养皿(NESTBiotechnology Co.Ltd)中,培养24小时。将2μM的式Ⅱ所述探针与细胞在培养基中于37℃孵育30min,孵育后细胞用PBS生理盐水洗三次,随后加入1mL无血清的培养基待成像用。荧光成像通过Olympus FV3000共聚焦激光扫描显微镜观察。通过445nm蓝紫色泵浦激光器激发,收集460-560nm的荧光,使用100×油物镜获取图像(800×800像素)并由OlympusFV31S-SW viewer软件处理,如图6所示,式Ⅱ所述探针在U87-MG细胞内有明亮的荧光信号。
SH-SY5Y细胞(密度为3×105个细胞/皿)接种在玻璃底共聚焦细胞培养皿(NESTBiotechnology Co.Ltd)中,培养24小时。将2μM的式Ⅱ所述探针与细胞在培养基中于37℃孵育30min,孵育后细胞用PBS生理盐水洗三次,随后加入1mL无血清的培养基待成像用。荧光成像通过Olympus FV3000共聚焦激光扫描显微镜观察。通过445nm蓝紫色泵浦激光器激发,收集460-560nm的荧光,使用100×油物镜获取图像(800×800像素)并由OlympusFV31S-SW viewer软件处理,如图6所示,式Ⅱ所述探针在SH-SY5Y细胞内有明亮的荧光信号。
四、式Ⅱ所述探针与细胞亚显微结构探针的细胞共定位实验
内质网染色探针(ER-Tracker Red),溶酶体染色探针(Lyso-Tracker Red),线粒体染色探针(Mito-Tracker Red),微管红色荧光探针(Tubulin-Tracker Red)购自碧云天生物技术公司(中国上海),上述探针为红色荧光,561nm激发。微丝抗体(Anti-Actinantibody[EPR16769])购自Abcam(ab179467),二抗(goat anti-rabbit IgG-PE)购自圣克鲁斯生物公司(sc-3739),PE为藻红蛋白,561nm激发。式Ⅱ所述探针用二甲基亚砜DMSO配制成10mM母液,加入无血清培养基中配制为2μM工作液。
与内质网染色探针(ER-Tracker Red)共染:内质网染色探针用稀释液按照1:1000的比例稀释成内质网染色探针工作液。HeLa细胞(密度为2×105个细胞/皿)接种在玻璃底共聚焦细胞培养皿(NEST Biotechnology Co.Ltd)中,培养24小时。将细胞与内质网染色探针工作液于37℃孵育30min,而后细胞与2μM的式Ⅱ所述探针在培养基中于37℃孵育30min,孵育后细胞用PBS生理盐水洗三次,随后加入1mL无血清的培养基待成像用。荧光成像通过Olympus FV3000共聚焦激光扫描显微镜观察。通过445nm蓝紫色泵浦激光器激发,收集460-560nm波段的式Ⅱ所述探针的荧光,通过561nm橙红色泵浦激光器激发,收集590-690nm波段的内质网染色探针的荧光,使用100×油物镜获取图像(800×800像素)并由OlympusFV31S-SW viewer软件处理。
与溶酶体染色探针(Lyso-Tracker Red)共染:溶酶体染色探针用无血清培养基按照1:10000的比例稀释成溶酶体染色探针工作液。HeLa细胞(密度为2×105个细胞/皿)接种在玻璃底共聚焦细胞培养皿(NEST Biotechnology Co.Ltd)中,培养24小时。将细胞与溶酶体染色探针工作液于37℃孵育30min,而后细胞与2μM的式Ⅱ所述探针在培养基中于37℃孵育30min,孵育后细胞用PBS生理盐水洗三次,随后加入1mL无血清的培养基待成像用。荧光成像通过Olympus FV3000共聚焦激光扫描显微镜观察。通过445nm蓝紫色泵浦激光器激发,收集460-560nm波段的式Ⅱ所述探针的荧光,通过561nm橙红色泵浦激光器激发,收集590-690nm波段的溶酶体染色探针的荧光,使用100×油物镜获取图像(800×800像素)并由Olympus FV31S-SW viewer软件处理。
与线粒体染色探针(Mito-Tracker Red)共染:线粒体染色探针用无血清培养基按照1:10000的比例稀释成线粒体染色探针工作液。HeLa细胞(密度为2×105个细胞/皿)接种在玻璃底共聚焦细胞培养皿(NEST Biotechnology Co.Ltd)中,培养24小时。将细胞与线粒体染色探针工作液于37℃孵育30min,而后细胞与2μM的式Ⅱ所述探针在培养基中于37℃孵育30min,孵育后细胞用PBS生理盐水洗三次,随后加入1mL无血清的培养基待成像用。荧光成像通过Olympus FV3000共聚焦激光扫描显微镜观察。通过445nm蓝紫色泵浦激光器激发,收集460-560nm波段的式Ⅱ所述探针的荧光,通过561nm橙红色泵浦激光器激发,收集590-690nm波段的线粒体染色探针的荧光,使用100×油物镜获取图像(800×800像素)并由Olympus FV31S-SW viewer软件处理。
与微丝抗体(Anti-Actin antibody)共染:微丝抗体用含有1-5%的牛血清白蛋白BSA的PBS按照1:50的比例稀释为一抗孵育工作液;二抗(goat anti-rabbit IgG-PE)用含有1-5%的牛血清白蛋白BSA的PBS按照1:100的比例稀释为二抗染色工作液。HeLa细胞(密度为2×105个细胞/皿)接种在玻璃底共聚焦细胞培养皿(NEST Biotechnology Co.Ltd)中,培养24小时。用PBS洗涤细胞2次,用PBS配制的3.7%甲醛溶液室温固定细胞约10-20min,用含0.05%Triton X-100的PBS洗涤2-3次。一抗孵育工作液与固定通透后的细胞室温避光孵育30-60min。PBS洗涤2-4次。而后细胞同时与2μM的式Ⅱ所述探针和二抗染色工作液在培养基中于37℃孵育30min,孵育后细胞用PBS洗3次,随后加入1mL无血清的培养基待成像用。通过445nm蓝紫色泵浦激光器激发,收集460-560nm波段的式Ⅱ所述探针的荧光,通过561nm橙红色泵浦激光器激发,收集590-690nm波段的微丝染色探针的荧光,使用100×油物镜获取图像(800×800像素)并由Olympus FV31S-SW viewer软件处理。
与微管染色探针(Tubulin-Tracker Red)共染:微管染色探针用含有1-5%的牛血清白蛋白BSA和0.1%Triton X-100的PBS按照1:50的比例稀释为染色工作液。HeLa细胞(密度为2×105个细胞/皿)接种在玻璃底共聚焦细胞培养皿(NEST Biotechnology Co.Ltd)中,培养24小时。用PBS洗涤细胞2次,用PBS配制的3.7%甲醛溶液室温固定细胞约10-20分钟,用含0.1%Triton X-100的PBS洗涤2-3次。染色工作液与固定通透后的细胞室温避光孵育30-60分钟。PBS洗涤2-4次。而后细胞与2μM的式Ⅱ所述探针在培养基中于37℃孵育30min,孵育后细胞用PBS洗三次,随后加入1mL无血清的培养基待成像用。通过445nm蓝紫色泵浦激光器激发,收集460-560nm波段的式Ⅱ所述探针的荧光,通过561nm橙红色泵浦激光器激发,收集590-690nm波段的微管染色探针的荧光,使用100×油物镜获取图像(800×800像素)并由Olympus FV31S-SW viewer软件处理。
式Ⅱ所述探针与细胞染色的共定位实验结果如图7所示,图(a)为2.0μM式Ⅱ所述探针染色HeLa细胞后在445nm激发下接收460-560nm的荧光成像照片,从图中可看到,式Ⅱ所述探针在活HeLa细胞和固定HeLa细胞里都有明亮荧光信号;图(b)为市售细胞亚显微结构染色探针(内质网,溶酶体,线粒体,微丝和微管)染色HeLa细胞后在561nm激发下接收590-690nm的荧光照片;图(c)为式Ⅱ所述探针与细胞亚显微结构染色探针共同染色HeLa细胞在445nm和561nm激发下的荧光照片;图(d)式Ⅱ所述探针与细胞亚显微结构染色探针的共聚焦成像共定位分析和皮尔森相关系数,式Ⅱ所述探针与细胞亚显微结构染色探针的皮尔森相关系数:与内质网探针为0.950,与溶酶体探针为0.006,与线粒体探针为0.148,与微丝探针为0.027,与微管探针为0.165。染色探针的共聚焦显微成像图共定位情况与皮尔森相关系数的关系为:0.8~1.0为极强相关、探针共定位情况非常好,0.6~0.8为强相关、探针共定位情况好,0.4~0.6为中等程度相关、探针有共定位,0.2~0.4位弱相关、探针不共定位,0.0~0.2为极弱相关或无相关、探针完全不共定位;说明了式Ⅱ所述探针与内质网染色探针共定位非常好,而与其他染色探针完全不共定位,表明式Ⅱ所述探针高特异性定位在细胞内质网。
五、式Ⅱ所述探针监控不同浓度衣霉素处理细胞后内质网的形态变化实验
HeLa细胞(密度为3×105个细胞/皿)分别接种在8个玻璃底共聚焦细胞培养皿(NEST Biotechnology Co.Ltd)中,待贴壁6h后,依次更换为含有不同浓度衣霉素(0,0.1,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0和1.2μM)的培养基,继续培养24小时。用PBS洗涤细胞2次,将细胞与2μM的式Ⅱ所述探针在培养基中于37℃孵育30min,孵育后细胞用PBS生理盐水洗三次,随后加入1mL无血清的培养基待成像用。荧光成像通过Olympus FV3000共聚焦激光扫描显微镜观察。通过445nm蓝紫色泵浦激光器激发,收集460-560nm波段的式Ⅱ所述探针的荧光信号,使用100×油物镜获取图像(800×800像素)并由Olympus FV31S-SW观察器软件处理。衣霉素是糖蛋白的抑制剂,能引起内质网应激,而导致内质网形态发生改变。如图8所示,随着衣霉素加药浓度的增加,细胞内的式Ⅱ所述探针的荧光信号强度保持不变,说明式Ⅱ所述探针能高特异性定位在药物刺激后细胞的内质网;其次,随着衣霉素加药浓度的增加,式Ⅱ所述探针的荧光信号逐渐向细胞核周位置集中,说明式Ⅱ所述探针可实时监控内质网的形态改变。
六、式Ⅱ所述探针对活细胞内质网的双光子荧光显微成像
HeLa细胞(密度为2×105个细胞/皿)接种在玻璃底共聚焦细胞培养皿(NESTBiotechnology Co.Ltd)中,培养24小时。将2μM的式Ⅱ所述探针与细胞在培养基中于37℃孵育30min,孵育后细胞用PBS生理盐水洗3次,随后加入1mL无血清的培养基待成像用。荧光成像通过Olympus FV1000共聚焦激光扫描显微镜观察。通过800nm激发,收集495-540nm波段的双光子荧光信号,使用60×水物镜获取图像,并由Olympus FV10-ASW 4.2viewer软件处理,如图9所示,图a)为HeLa细胞空白对照组照片,图b)为式Ⅱ所述探针与HeLa细胞的双光子荧光成像照片,式Ⅱ所述探针在HeLa细胞内明亮的双光子荧光信号,上述照片表明式Ⅱ所述探针可对活细胞内质网进行双光子荧光显微成像。
七、式Ⅱ所述探针对细胞的毒性实验
本发明使用CCK-8方法及HeLa细胞测定式Ⅱ所述探针的细胞毒性,具体步骤如下:
HeLa细胞以每孔5×103个细胞种在96孔板中,每孔100μL细胞培养基。培养6h待细胞贴壁后,加入不同体积的式Ⅱ所述探针分子母液到相应的孔中,使其终浓度分别为0.1μM,0.5μM,1.0μM,2.0μM,5.0μM,10μM和20μM,每个浓度平行做3个样品,以加入1μL的DMSO溶液组作为空白对照,继续培养24h。然后去除培养基,用PBS洗2遍,每孔加入100μL 10%CCK-8试剂,在37℃环境孵育0.5h。利用多功能酶标仪测定450nm波长的吸收值,按公式(1)计算得到细胞存活率。
细胞存活率=(An-A0)/(Ac-A0)×100%(1)
公式(1)中,Ac表示未加染料细胞组在450nm处的吸收值,An表示加染料处理细胞组在450nm处的吸收值;A0指不含细胞的空白培养基组450nm的吸收值。
实验结果如图10所示,0.1-2μM式Ⅱ所述探针与HeLa细胞孵育24小时,没有表现出明显的细胞毒性,表明式Ⅱ所述探针在可成像浓度范围内对细胞正常生理活动无影响,有作为荧光探针和双光子荧光探针实时监测活细胞内质网形态和分布变化的潜力。
实施例2、式Ⅲ至式Ⅵ所述荧光探针定位细胞内质网
一、式Ⅲ所述探针的合成
按照如下步骤合成:
将290mg(1.05mmol)的4-溴-1,8-萘二酐加入到15mL的乙醇和25mL的单颈圆底烧瓶中。在75℃-85℃回流10分钟后,当温度冷却时,缓慢加入280mg(1.05mmol)5-苄氧基色胺。然后将反应物再搅拌2小时进行酰基化反应,溶液变澄清时停止。加入大量水以沉淀产物。真空过滤,收集过滤的固体,用水和乙醇洗涤各洗涤2次,真空干燥。得到产物,N-苄氧基色胺-4-溴-1,8-萘二甲酰亚胺,为淡黄色固体(92%收率)。N-苄氧基色胺-4-溴-1,8-萘二甲酰亚胺(50mg,0.11mmol),5-苄氧基色胺(59mg,0.22mmol)和K2CO3(40mg,0.29mmol)将其溶于2mL DMSO中。混合物在85℃下搅拌12小时进行亲核取代反应。冷却溶剂、减压蒸发,得到粗产物。将粗产物溶于二氯甲烷中,并通过硅胶色谱法(CH2Cl2/MeOH,v/v,100:1)纯化,得到化合物为黄色固体(42%收率)。然后,通过高效液相色谱进一步纯化化合物。高效液相色谱分离纯化步骤为色谱柱为Promisil-C18柱(250mm×4.6mm,20μm),流动相为甲醇-水,梯度洗脱,洗脱程序:0-25min,甲醇40%-95%,25-30min,甲醇95%;检测波长为450nm;柱温为25℃;体积流量为1.0mL·min-1;进样量为100μL,高效液相色谱仪(HPLC)为SPD-20A检测器和LC-20AT双泵(岛津,日本)。MS(MALDI-TOF):exact mass calcd.for C44H34N4O4([M+H]+)requires m/z 628.26,found m/z 629.7(M+H)+。
二、式Ⅳ所述探针的合成
按照如下步骤合成:
将290mg(1.05mmol)的4-溴-1,8-萘二酐加入到15mL的乙醇和25mL的单颈圆底烧瓶中。在75℃-85℃回流10分钟后,当温度冷却时,缓慢加入168mg(1.05mmol)色胺。然后将反应物再搅拌2小时进行酰基化反应,溶液变澄清时停止。加入大量水以沉淀产物。真空过滤,收集过滤的固体,用水和乙醇洗涤各洗涤2次,真空干燥。得到产物,N-色胺-4-溴-1,8-萘二甲酰亚胺,为淡黄色固体(89%收率)。N-色胺-4-溴-1,8-萘二甲酰亚胺(50mg,0.11mmol),色胺(59mg,0.22mmol)和K2CO3(40mg,0.29mmol)将其溶于2mL DMSO中。混合物在85℃下搅拌12小时进行亲核取代反应。冷却溶剂、减压蒸发,得到粗产物。将粗产物溶于二氯甲烷中,并通过硅胶色谱法(CH2Cl2/MeOH,v/v,100:1)纯化,得到化合物为黄色固体(33%收率)。然后,通过高效液相色谱进一步纯化化合物。高效液相色谱分离纯化步骤为色谱柱为Promisil-C18柱(250mm×4.6mm,20μm),流动相为甲醇-水,梯度洗脱,洗脱程序:0-25min,甲醇40%-95%,25-30min,甲醇95%;检测波长为450nm;柱温为25℃;体积流量为1.0mL·min-1;进样量为100μL,高效液相色谱仪(HPLC)为SPD-20A检测器和LC-20AT双泵(岛津,日本)。MS(MALDI-TOF):exact mass calcd.for C32H26N4O2([M+H]+)requires m/z498.21,found m/z 499.5(M+H)+。
三、式Ⅴ所述探针的合成
将2.0g(7.22mmol)的4-溴-1,8-萘二酐加入到150mL的乙醇和250mL的单颈圆底烧瓶中。回流10分钟后,当温度冷却时,缓慢加入1.1g(8.38mmol)γ-氨基丁酸。再搅拌2小时进行酰基化反应,并在溶液变澄清时停止。加入大量水以沉淀产物。通过真空过滤收集沉淀物,用水和乙醇洗涤,并真空干燥。得到产物为白色固体(95%收率)。化合物N-氨基丁酸-4-溴-1,8-萘二甲酰亚胺(663mg,1.7mmol),γ-氨基丁酸(260mg,3.1mmol)和K2CO3(140mg,3.5mmol)将其溶于10mL DMSO中。将混合物在85℃下搅拌12小时进行亲核取代反应。然后,冷却溶剂并减压蒸发,得到粗产物。将粗产物溶于二氯甲烷中,并通过硅胶色谱法(CH2Cl2/MeOH,v/v,30:1)纯化,得到化合物为黄色固体(78%收率)。将第二步化合物(10.6mg,21.7nmol)与1-羟基苯并三唑HOBT(9.2mg,68.1nmol)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC(13mg,67.8nmol)溶解在2mL的DMF中。将混合物在室温下搅拌0.5小时。然后,将5-甲氧基色胺1:2.5当量加入混合物中。搅拌12小时后,减压蒸发溶剂,将粗产物溶于二氯甲烷中,通过硅胶色谱法(CH2Cl2/MeOH,v/v,30:1)纯化,得到化合物,为暗黄色固体(57%收率)。MS(MALDI-TOF):exact mass calcd.for C42H44N6O6([M+H]+)requires m/z728.33,found m/z 729.6(M+H)+。
四、式Ⅵ所述探针的合成
将2.0g(7.22mmol)的4-溴-1,8-萘二酐加入到150mL的乙醇和250mL的单颈圆底烧瓶中。回流10分钟后,当温度冷却时,缓慢加入1.1g(8.38mmol)γ-氨基丁酸。再搅拌2小时进行酰基化反应,并在溶液变澄清时停止。加入大量水以沉淀产物。通过真空过滤收集沉淀物,用水和乙醇洗涤,并真空干燥。得到产物为白色固体(95%收率)。化合物N-氨基丁酸-4-溴-1,8-萘二甲酰亚胺(663mg,1.7mmol),γ-氨基丁酸(260mg,3.1mmol)和K2CO3(140mg,3.5mmol)将其溶于10mL DMSO中。将混合物在85℃下搅拌12小时进行亲核取代反应。然后,冷却溶剂并减压蒸发,得到粗产物。将粗产物溶于二氯甲烷中,并通过硅胶色谱法(CH2Cl2/MeOH,v/v,30:1)纯化,得到化合物为黄色固体(78%收率)。将第二步化合物(10.6mg,21.7nmol)与1-羟基苯并三唑HOBT(9.2mg,68.1nmol)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC(13mg,67.8nmol)溶解在2mL的DMF中。将混合物在室温下搅拌0.5小时。然后,将5-苄氧基色胺以1:2.5当量加入混合物中。搅拌12小时后,减压蒸发溶剂,将粗产物溶于二氯甲烷中,通过硅胶色谱法(CH2Cl2/MeOH,v/v,30:1)纯化,得到化合物,为暗黄色固体(62%收率)。MS(MALDI-TOF):exact mass calcd.for C54H52N6O6([M+H]+)requires m/z880.39,found m/z 882.1(M+H)+。
五、式Ⅲ至式Ⅵ所述荧光探针与市售细胞内质网探针的细胞共定位实验
内质网染色探针(ER-Tracker Red)购自碧云天生物技术公司(中国上海),上述探针为红色荧光,561nm激发。式Ⅲ至式Ⅵ所述荧光探针用二甲基亚砜DMSO配制成10mM母液,加入无血清培养基中配制为2μM工作液。
与内质网染色探针(ER-Tracker Red)共染:内质网染色探针用稀释液按照1:1000的比例稀释成内质网染色探针工作液。HeLa细胞(密度为2×105个细胞/皿)接种在4个玻璃底共聚焦细胞培养皿(NEST Biotechnology Co.Ltd)中,培养24小时。将4皿细胞与内质网染色探针工作液于37℃孵育30min,而后每皿细胞分别与2μM的式Ⅲ至式Ⅵ所述荧光探针在培养基中于37℃孵育30min,孵育后细胞用PBS生理盐水洗三次,随后加入1mL无血清的培养基待成像用。荧光成像通过Olympus FV3000共聚焦激光扫描显微镜观察。通过445nm蓝紫色泵浦激光器激发,收集460-560nm波段的式Ⅲ至式Ⅵ所述荧光探针的荧光,通过561nm橙红色泵浦激光器激发,收集590-690nm波段的内质网染色探针的荧光,使用100×油物镜获取图像(800×800像素)并由Olympus FV31S-SW viewer软件处理。
式Ⅲ至式Ⅵ所述荧光探针与细胞内质网染色的共定位实验结果如图11所示,图(a)为2.0μM式Ⅲ至式Ⅵ所述荧光探针分别染色HeLa细胞后在445nm激发下接收460-560nm的荧光成像照片,从图中可看到,式Ⅲ至式Ⅵ所述荧光探针在活HeLa细胞里都有明亮荧光信号;图(b)为市售细胞内质网染色探针染色HeLa细胞后在561nm激发下接收590-690nm的荧光照片;图(c)为式Ⅲ至式Ⅵ所述荧光探针与细胞内质网染色探针共同染色HeLa细胞在445nm和561nm激发下的荧光照片;图(d)式Ⅲ至式Ⅵ所述荧光探针分别与细胞内质网染色探针的共聚焦成像共定位分析和皮尔森相关系数,式Ⅲ至式Ⅵ所述荧光探针与细胞内质网染色探针的皮尔森相关系数:式Ⅲ所述荧光探针与内质网探针为0.951,式Ⅳ所述荧光探针与内质网探针为0.953,式Ⅴ所述荧光探针与内质网探针为0.745,式Ⅵ所述荧光探针与内质网探针为0.710。染色探针的共聚焦显微成像图共定位情况与皮尔森相关系数的关系为:0.8~1.0为极强相关、探针共定位情况非常好,0.6~0.8为强相关、探针共定位情况好,0.4~0.6为中等程度相关、探针有共定位,0.2~0.4位弱相关、探针不共定位,0.0~0.2为极弱相关或无相关、探针完全不共定位;说明了式Ⅲ至式Ⅵ所述荧光探针与内质网染色探针共定位好,表明式Ⅲ至式Ⅵ所述荧光探针高特异性定位在细胞内质网。
Claims (18)
5.根据权利要求4所述的方法,其特征在于:所述缚酸剂为碱盐;
所述式Ⅶ所示化合物与亲核试剂的投料摩尔比为1:1.5-2.5;
所述式Ⅶ所示化合物与碱盐的投料摩尔比为1:1.5-4;
所述亲核取代反应步骤中,温度为20℃-120℃;时间为4-24h。
6.根据权利要求5所述的方法,其特征在于:所述缚酸剂选自碳酸钾、碳酸钠、氢氧化钠、氢氧化钾、氢化钠和氢化钾中任意一种;
所述溶剂选自二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺,N,N-二甲基乙酰胺的至少一种;
所述式Ⅶ所示化合物与亲核试剂的投料摩尔比为1:2;
所述式Ⅶ所示化合物与碱盐的投料摩尔比为1:2.6;
所述亲核取代反应步骤中,温度为85℃;时间为12h。
7.根据权利要求4-6任一项所述的方法,其特征在于:所述方法还包括:在所述亲核取代反应步骤之后,将反应体系干燥和纯化。
8.根据权利要求7所述的方法,其特征在于:所述纯化为用柱层析分离和高效液相色谱纯化。
9.一种试剂盒,由权利要求1-3任一项所述化合物和溶剂组成;
所述化合物在所述溶剂中的浓度为0.1~100μM。
10.根据权利要求9所述的试剂盒,其特征在于:所述溶剂为PBS缓冲液、HEPES缓冲液、细胞培养基或二甲基亚砜。
11.根据权利要求10所述的试剂盒,其特征在于:所述细胞培养基为RPMI-1640和DMEM。
12.权利要求1-3任一所述化合物或权利要求9-11任一项所述试剂盒在以非疾病的诊断和治疗为目的的活细胞、固定细胞、组织或活体中内质网荧光成像或双光子荧光成像中的应用。
13.根据权利要求12所述的应用,其特征在于:所述活细胞为癌细胞;
所述固定细胞为应用甲醛、戊二醛、甲醇、乙醇、丙酮中的一种或多种固定剂所固定的细胞。
14.根据权利要求13所述的应用,其特征在于:所述癌细胞为HeLa细胞、A549细胞、DU145细胞、U87-MG和SH-SY5Y细胞中任一种。
15.权利要求1-3任一所述化合物或权利要求9-11任一项所述试剂盒在制备活细胞、固定细胞、组织或活体中内质网荧光成像或双光子荧光成像的产品中的应用。
16.根据权利要求15所述的应用,其特征在于:所述活细胞为癌细胞;
所述固定细胞为应用甲醛、戊二醛、甲醇、乙醇、丙酮中的一种或多种固定剂所固定的细胞。
17.根据权利要求16所述的应用,其特征在于:所述癌细胞为HeLa细胞、A549细胞、DU145细胞、U87-MG和SH-SY5Y细胞中任一种。
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