CN102627615B

CN102627615B - 一种化合物l-4-四嗪-苯丙氨酸及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN102627615B
Application number: CN201210080698.3A
Authority: CN
Inventors: 周兰霞; 董守良; 倪中秋
Original assignee: Lanzhou University
Current assignee: Lanzhou University
Priority date: 2012-03-23
Filing date: 2012-03-23
Publication date: 2014-01-01
Anticipated expiration: 2032-03-23
Also published as: CN102627615A

Abstract

本发明公开了一种新的氨基酸衍生物L-4-四嗪-苯丙氨酸(3-(4-(1，2，4，5-tetrazin-3-yl)phenyl)-2-aminopropanoic acid)，以L-4-氰基-苯丙氨酸为起始反应物，与醋酸甲脒、无水肼在硫的催化下反应，然后用用亚硝酸钠氧化生成L-4-1，2，4，5-四嗪-苯丙氨酸。L-4-1，2，4，5-四嗪-苯丙氨酸作为苯丙氨酸/酪氨酸的类似物整合到生物活性多肽、蛋白质等分子中，应用于基于逆电子狄尔斯-阿尔德反应的生物正交领域进行生物标记；同时，可经过固相多肽合成方法作为苯丙氨酸/酪氨酸的类似物引入到生物活性肽中，并进行药理学评价，可以改善某些生物活性肽的药性。

Description

一种化合物L-4-四嗪-苯丙氨酸及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种新的化合物，L-4-四嗪-苯丙氨酸及其制备方法和应用。

背景技术

近年来，基于生物正交反应来标记生物分子的策略开始崭露头角。这种方法涉及到通过细胞自身代谢或化学修饰整合一个独特的化学功能基团(生物正交的化学报告子)到目标分子上。生物正交化学报告子，即功能基团对天然生物分子而言拥有独特的反应性且互不作用。化学报告子是非天然的、无扰动的、在生命体系中可以通过与外源探针高速率、专一性地反应而结合。

1900年，Hantzsch和Lehmann率先合成了1，2，4，5-四嗪，但是产率很低，且不稳定，但是作为二烯体，在环加成反应中具有很高的反应活性。

1928年，德国化学家狄尔斯(Otto Paul Hermann Diels)和其助手阿尔德(KurtAlder)报道了环戊二烯和顺丁烯二酸酐进行环化加成反应，生成六元环状化合物，将此反应定义为双烯合成，并以两人名字命名，称为狄尔斯-阿尔德反应(Diels-Alder reaction)。

自1996年以来已有许多综述报道了1，2，4，5-四嗪参与的逆电子需求的狄尔斯-阿尔德反应。近年来，四嗪参与的逆电子需求的狄尔斯-阿尔德反应仍然是人们研究的热点，通过这个反应大量合成了包括天然产物在内的含有杂环的分子。

2008年，Fox等人报道了一种新的生物正交反应，四嗪和张力限制的反式环辛烯能够发生逆电子需求的狄尔斯-阿尔德反应，反应具有高速率、选择性、不可逆、产物专一(产物为二氢哒嗪)、副产物简单无害(副产物是氮气)、不需要任何催化剂等特点。然而不足之处是3，6-(2-吡啶)-四嗪的稳定性比较差，在水溶液中放置几小时后会发生明显的降解。

Hilderbrand等人同年合成了3-(4-苄胺)-1，2，4，5-四嗪，其与降冰片烯同样能够发生逆电子需求的狄尔斯-阿尔德反应，反应具有相同的特点，从而被用来对活细胞进行标记。

利用液质联用分析反应产物，反应转化率高达93％。而且3-(4-苄胺)-1，2，4，5-四嗪在细胞培养液中具有良好的稳定性，20℃下在胎牛血清中放置15小时仅仅发现只有15％的降解。

2010年，Weissleder等人又报道在3-(4-苄胺)-1，2，4，5-四嗪上连接BODIPY FL、Oregon Green 488、BODIPY TMR-X荧光团后，四嗪会淬灭荧光。当和张力限制性的亲双烯体反式环辛烯或降冰片烯在PBS缓冲液中反应之后，荧光强度增加15-20倍之多；在胎牛血清中反应，荧光强度增加11-14倍，从而有效减弱了背景荧光，在体内或体外标记生物分子中可以起到探针开关的作用。

发明内容

本发明所要解决的技术问题，是提供一种新的化合物L-4-四嗪-苯丙氨酸。

本发明还要解决的技术问题，是提供上述化合物的制备方法。

本发明最后要解决的技术问题，是提供上述化合物在基于逆电子狄尔斯-阿尔德反应的生物正交领域中的应用。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一种新化合物L-4-四嗪-苯丙氨酸，其化学名称为3-(4-(1，2，4，5-四嗪)苯基)-2-氨基丙酸，其结构式如式(1)所示：

上述新化合物L-4-四嗪-苯丙氨酸的制备方法，该方法包括如下步骤：

(1)取L-4-氰基-苯丙氨酸、醋酸甲脒、硫混合均匀，加入无水肼反应，生成4-二氢四嗪-L-苯丙氨酸，用醋酸溶解；

(2)将步骤(1)得到的醋酸溶液加入亚硝酸钠水溶液，进行氧化反应，得到4-四嗪-L-苯丙氨酸。

步骤(1)中，所述的L-4-氰基-苯丙氨酸、硫、醋酸甲脒和无水肼的摩尔比为1∶1∶2∶10-1∶3∶5∶50。

步骤(1)中，反应时间为16-24小时。

步骤(2)中，亚硝酸钠的摩尔用量为L-4-氰基-苯丙氨酸摩尔量的4-6倍，亚硝酸钠水溶液加入时要使用冰水浴并要缓慢加入。

步骤(2)中，氧化反应时间为15-60分钟。

步骤(2)中，氧化反应结束后，旋转蒸发尽量出去乙酸，得到粘稠油状物，抽滤得到紫红色固体，用二氯甲烷、乙腈洗涤，得到4-四嗪-L-苯丙氨酸。

上述新化合物L-4-四嗪-苯丙氨酸在基于逆电子狄尔斯-阿尔德反应的生物正交领域进行生物标记的应用。

上述新化合物L-4-四嗪-苯丙氨酸作为苯丙氨酸或酪氨酸的类似物引入到生物活性肽中进行药理学评价中的应用。

本发明关键技术部分的合成路线示意图见图1所示。

有益效果：本发明的L-4-1，2，4，5-四嗪-苯丙氨酸作为苯丙氨酸活酪氨酸的类似物可以整合到生物活性多肽、蛋白质等分子中，应用于基于逆电子狄尔斯-阿尔德反应的生物正交领域进行生物标记；同时，可经过固相多肽合成方法作为苯丙氨酸/酪氨酸的类似物引入到生物活性肽中，并进行药理学评价，可以改善某些生物活性肽的药性。本发明的制备方法步骤精简，产率较高，纯化简单，产品易于制备。

附图说明

图1为的合成路线示意图。

图2为本发明物质与5-降冰片烯-2-羧酸的逆电子狄尔斯-阿尔德反应。

图3为本发明应用于基于逆电子狄尔斯-阿尔德反应的生物正交领域进行。

图4为生物标记的效果，(左)荧光素通道；(右)近红外通道(四嗪-VT680)。

图5为本发明物氨基的Fmoc保护。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1：

称取L-4-氰基-苯丙氨酸(2.5mmol，0.475g)，醋酸甲脒(10mmol，1.040g)，硫(2.5mmol，0.080g)混合均匀，加入无水肼(100mmol，3.14mL)，无水肼加入后，有气体放出并且反应物逐渐变为黄色粘稠物，常温搅拌反应22小时后，加入乙酸15mL，使黄色粘稠物充分溶解，抽滤，取黄色溶液。称取亚硝酸钠(12.5mmol，0.863g)溶于1.5mL水中，在冰水浴的条件下，缓慢加入到上述黄色溶液中充分搅拌，即有气泡生成，溶液变为紫红色，反应30min。旋转蒸发尽量出去乙酸，得到粘稠油状物，抽滤得到紫红色固体，用二氯甲烷、乙腈洗涤，得到4-四嗪-L-苯丙氨酸0.3981g，产率64.9％。MS-ESI[M+H]⁺为246.1。¹H NMR(D₂O，300MHz，δ)：10.23(s，1H)，8.33(d，J＝8.4Hz，2H)，7.46(d，J＝8.4Hz，2H)，3.93(m，2H)，3.20(m，1H)。

实施例2：

称取L-4-氰基-苯丙氨酸(2.5mmol，0.475g)，醋酸甲脒(5mmol，0.520g)，硫(2.5mmol，0.080g)混合均匀，加入无水肼(25mmol，0.785mL)，无水肼加入后，有气体放出并且反应物逐渐变为黄色粘稠物，常温搅拌反应24小时后，加入乙酸15mL，使黄色粘稠物充分溶解，抽滤，取黄色溶液。称取亚硝酸钠(10mmol，0.69g)溶于1.5mL水，在冰水浴的条件下，缓慢加入到上述黄色溶液中充分搅拌，即有气泡生成，溶液变为紫红色，反应60min。旋转蒸发尽量出去乙酸，得到粘稠油状物，抽滤得到紫红色固体，用二氯甲烷、乙腈洗涤，得到4-四嗪-L-苯丙氨酸0.3652g，产率59.3％。MS-ESI[M+H]⁺为246.1。¹H NMR(D₂O，300MHz，δ)：10.23(s，1H)，8.33(d，J＝8.4Hz，2H)，7.46(d，J＝8.4Hz，2H)，3.93(m，2H)，3.20(m，1H)。

实施例3：

称取L-4-氰基-苯丙氨酸(2.5mmol，0.475g)，醋酸甲脒(12.5mmol，1.300g)，硫(7.5mmol，0.240g)混合均匀，加入无水肼(125mmol，3.925mL)，无水肼加入后，有气体放出并且反应物逐渐变为黄色粘稠物，常温搅拌反应16小时后，加入乙酸15mL，使黄色粘稠物充分溶解，抽滤，取黄色溶液。称取亚硝酸钠(15mmol，1.035g)溶于1.5mL水，在冰水浴的条件下，缓慢加入到上述黄色溶液中充分搅拌，即有气泡生成，溶液变为紫红色，反应15min。旋转蒸发尽量出去乙酸，得到粘稠油状物，抽滤得到紫红色固体，用二氯甲烷、乙腈洗涤，得到4-四嗪-L-苯丙氨酸0.4265g，产率69.5％。¹HNMR(D₂O，300MHz，δ)：10.23(s，1H)，8.33(d，J＝8.4Hz，2H)，7.46(d，J＝8.4Hz，2H)，3.93(m，2H)，320(m，1H)。

实施例4：

配制含有0.4mM的4-四嗪-L-苯丙氨酸PBS溶液和4mM 5-降冰片烯-2-羧酸的PBS溶液，在室温下混合反应，20分钟反应完全得到狄尔斯-阿尔德反应的产物，质谱检测MS-ESI[M+H]⁺为356.3。实验过程如图2所示。产物有四种异构体。

实施例5：

VT680NHS脂(1mg)溶解到250uL 0.1M PBS中，然后加入4-四嗪-L-苯丙氨酸(1.58mg)，避光反应，震荡过夜。

5-降冰片烯-2-羧酸与11倍的二琥珀酰亚胺基碳酸酯(DSC)，在1倍量吡啶作为碱的条件下，在乙腈中搅拌反应3小时。反应后，溶剂和碱通过旋转蒸发除去，得到降冰片烯琥珀酰亚胺酯的粗品。

表皮生长因子受体的抗体Cetuximab，通过溶剂交换到0.1M NaHCO₃缓冲溶液中，形成10mg/mL的最终浓度。在室温下，与5倍量的5-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯和30倍量的降冰片烯琥珀酰亚胺酯，震荡反应3小时。抗体通过离心过滤分离并纯化，最终保存在PBS缓冲液中。

A549人肺癌细胞生长在盖玻片上，在37℃下，在修饰的抗体Cetuximab的下孵育3小时，后用含有10％胎牛血清(FBS)的Hanks平衡盐溶液(HBSS)洗涤两次。然后37℃下，与四嗪-VT680的孵育1小时，用10％FBS/HBSS洗涤两次，用荧光显微镜观察，拍照。实验过程如图3所示。结果如图4所示。

实施例6：

称取4-四嗪-L-苯丙氨酸(2mmol，0.4904g)，加入1，4-二氧六环和水各50mL，在冰盐浴的条件下，加入碳酸氢钠(5mmol，420mg)。然后加入芴甲氧羰酰琥珀酰亚胺(3mmol，1.012g)，室温下反应过夜。旋转蒸发尽量多的除去1，4-二氧六环，用乙醚洗涤两次。在冰水浴并不断搅拌下，缓慢加入1M HCl调节pH＝3，用40mL乙酸乙酯萃取，合并有机相。用30mL饱和氯化钠水溶液洗涤两次，然后加入无水硫酸钠放置过夜干燥。用硅胶柱层析进行纯化，洗脱液为石油醚∶乙酸乙酯∶乙酸＝20∶20∶1，最终得到产物Fmoc-L-4-四嗪-苯丙氨酸0.509g。MS-ESI[M-H]^-为466.1。实验过程如图5所示。产物可以直接用于多肽合成。

Claims

1.一种新化合物L-4-四嗪-苯丙氨酸，其化学名称为3-(4-(1，2，4，5-四嗪)苯基)-2-氨基丙酸，其结构式如式(1)所示：

2.权利要求1所述的新化合物L-4-四嗪-苯丙氨酸的制备方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的L-4-氰基-苯丙氨酸、硫、醋酸甲脒和无水肼的摩尔比为1∶1∶2∶10-1∶3∶5∶50。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，反应时间为16-24小时。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，亚硝酸钠的摩尔用量为L-4-氰基-苯丙氨酸摩尔量的4-6倍，亚硝酸钠水溶液加入时要使用冰水浴并要缓慢加入。

6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，氧化反应时间为15-60分钟。

7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，氧化反应结束后，旋转蒸发尽量出去乙酸，得到粘稠油状物，抽滤得到紫红色固体，用二氯甲烷、乙腈洗涤，得到4-四嗪-L-苯丙氨酸。

8.权利要求1所述的新化合物L-4-四嗪-苯丙氨酸在基于逆电子狄尔斯-阿尔德反应的生物正交领域进行生物标记的应用。

9.权利要求1所述的新化合物L-4-四嗪-苯丙氨酸作为苯丙氨酸或酪氨酸的类似物引入到生物活性肽中进行药理学评价中的应用。