CN105646546A

CN105646546A - 酸敏感型的喜树碱-20位酯衍生物及其抗肿瘤应用

Info

Publication number: CN105646546A
Application number: CN201511016339.1A
Authority: CN
Inventors: 王先恒; 赵长阔; 杨福红; 贾佳; 吴昆仑
Original assignee: Zunyi Medical University
Current assignee: Zunyi Medical University
Priority date: 2015-12-29
Filing date: 2015-12-29
Publication date: 2016-06-08
Anticipated expiration: 2035-12-29
Also published as: CN105646546B

Abstract

本发明提供了结构式如4所示的喜树碱-20位酯衍生物、其制备方法及其抗肿瘤应用。

Description

酸敏感型的喜树碱-20位酯衍生物及其抗肿瘤应用

技术领域

本发明属于新药设计与合成领域，具体涉及一类新型的酸敏感型的喜树碱-20位酯衍生物及其抗肿瘤应用。

背景技术

喜树是我国特有珙桐科植物，主要分布于我国长江流域以及贵州、四川、广西等西南几个省区。贵州是喜树的主产区之一，几乎在全省各县均有分布生长，而多个县成功地进行了人工栽培。喜树碱(Camptothecin，简称CPT)最早由美国化学家Wall等从喜树中提取得到。喜树碱包含一个五元环骈列的结构，其中AB环是喹啉环，C环为一个吡咯环，D环是一个共轭吡啶环，E环为具有一个S构型手性中心(C20)的α-羟基六元内酯。ABCD环为一个巨大的共轭体系，成平面结构。

由于喜树碱独特的抗肿瘤作用机制，药物学家开发和合成了大量的喜树碱衍生物，并有数个新型喜树碱衍生物成功进入临床研究阶段或上市。

斑蝥素(cantharidin，C₁₀H₁₂O₄)是我国一种民间传统的中药斑蝥体内提取出的一种抗癌症物质。它对腹水肝癌或者是原发性肝癌有特殊的抑制作用。但斑蝥素在临床应用中，其毒副作用比较大，不能长期使用。少了两个甲基的去甲斑蝥素大大的降低它的毒副作用，且能更好地抑制癌症；同时还具有独特的刺激白细胞的骨髓生长的作用。

为了寻找药效更好，毒性更强的抗癌药物候选者，我们设计并全合成了如下的药物分子，将喜树碱和去甲斑蝥素通过20位酯键相连，得到结构独特的新型的喜树碱-20位酯衍生物。

发明内容

一方面，本发明提供了一种新型喜树碱-20位酯衍生物，具体地，是一种酸敏感型喜树碱-20位酯衍生物；其结构式如式4所示，

另一方面，本发明提供了如上所述的喜树碱去甲斑蝥素酯衍生物4的合成方法，包括以下步骤：1)、侧链5-烯-去甲斑蝥素单酸苄酯3(化合物3)与喜树碱在有机溶剂中，在耦合剂及有机碱催化剂作用下反应得到偶联产物4(化合物4)，反应式见以下：

在一种优选的实施方式中，步骤1)所述的耦合剂选自1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(缩写EDCI)、二环己基碳二亚胺(缩写DCC)等。

在一种优选的实施方式中，步骤1)所述的有机碱选自三乙胺、二异丙基胺、4-二甲氨基吡啶(缩写DMAP)等。

在一种优选的实施方式中，步骤1)的反应溶剂选自氯代烃溶剂；优选包括二氯甲烷、氯仿等。

再一方面，本发明还提供了合成式4所示的喜树碱-20位酯衍生物的侧链化合物3及其制备方法，包括步骤：a)、以呋喃为原料，与顺丁烯二酸酐(化合物1)在有机溶剂中反应得到5-烯-去甲斑蝥素2(化合物2)，b)、5-烯-去甲斑蝥素2在有机溶剂中与苯甲醇反应得到侧链5-烯-去甲斑蝥素单酸苄酯3(化合物3)，合成路线见以下：

在一种优选的实施方式中，步骤a)采用的有机溶剂为醚类溶剂或卤代烃，例如：乙醚、丙醚、四氢呋喃、二氯甲烷或氯仿。

在一种优选的实施方式中，步骤a)可在室温下进行，也可以适当加热；优选室温。

在一种优选的实施方式中，步骤b)反应所用的有机溶剂选自醚类溶剂或卤代烃，例如：乙醚、丙醚、四氢呋喃、二氯甲烷或氯仿。

在上述合成及制备方法中，有机溶剂也可以依据反应对温度、溶剂极性的需求，从N,N-二甲基甲酰胺(缩写DMF)、二甲基亚砜(缩写DMSO)、二氯甲烷(缩写DCM)、氯仿、乙腈、四氢呋喃或乙醚中选取。反应温度可依据反应类型适当选取。反应时间可通过薄层层析TLC、高效液相色谱法HPLC或LC-MS液相质谱联用等监控手段追踪反应情况得出。

活性测试证明，本发明设计并合成得到的式4所示的喜树碱-20位酯衍生物具有很好的抗肿瘤效果；其针对胃癌以及结肠癌的体外抑制率高达70％-72％，与阳性对照药物喜树碱和斑蝥素的抑制活性相当，而针对肝癌也有一定的体外抑制率。因此，该新衍生物可望应用于临床作为喜树碱并斑蝥素类抗肿瘤药物。

因此，本发明的第四方面提供了式4所示的喜树碱-20位酯衍生物用于制备抗肿瘤药物的用途；优选地，用于制备抗肝癌药物、抗胃癌药物以及抗结肠癌药物的用途；更优选地，用于制备抗胃癌药物以及抗结肠癌药物的用途。

本发明的有益之处在于：本发明提供了式4所示的喜树碱-20位酯衍生物，是一种适合的抗肿瘤候选药物，尤其是作为抗肝癌、抗胃癌以及抗结肠癌的候选药物。相对于阳性对照药品喜树碱和斑蝥素，本发明的化合物4分子结构由于引入带氧桥环的去甲斑蝥素类似结构，其对于酸较为敏感，易于水解，从而可增强药代动力学效力。此外，本发明的喜树碱去甲斑蝥素酯衍生物的合成方法，原料易得，合成路线收率高，非常易于操作实施。

具体实施方式

以下将通过具体实施例进一步阐述本发明，但并不用于限制本发明的保护范围。在不脱离本发明构思的前提下，本领域技术人员可对权利要求的各参数或条件做出的改进或组合，这些改进或组合也应视为本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

本发明中使用的呋喃，顺丁烯二酸酐来自上海国药集团；所用溶剂来自遵义双巨化工有限公司。除特别说明外，所用试剂均为化学纯。

前述的本发明的侧链5-烯-去甲斑蝥素蝥单酸苄酯3的合成方法，

具体包括以下步骤：

1)取顺丁烯二酸酐，研细，加入有机溶剂溶解，待完全溶解后滴加呋喃，于35℃～45℃反应24小时，抽滤，得白色固体产物5-烯-去甲斑蝥素2，干燥备用；

2)将步骤a)得到的5-烯-去甲斑蝥素2悬浮于苯甲醇中；然后向悬浮液中逐滴加入三乙胺，室温下搅拌；旋蒸除去溶剂。将得到的剩余物质溶解于二氯甲烷中，用1N(N在本说明书中代表mol/L的单位浓度)盐酸萃取一次，有机相用饱和食盐水萃取一次，无水MgSO₄干燥得到5-烯-去甲斑蝥素单酸苄酯3，为白色固体。

上述反应中，可以用色谱法、液质连用谱来监控反应进程。色谱法中，可适用薄层色谱，还可用气相色谱法或液相色谱法如HPLC代替等。

实施例1、5-烯-去甲斑蝥素2的制备：

从试剂瓶中取出一定量的顺丁烯二酸酐1，置于干燥的研体中研细，再用电子天平称取研细的顺丁烯二酸酐12.021g，置于干燥的三口烧瓶中，塞上塞子，再加乙醚搅拌，在乙醚量为90mL时顺丁烯二酸酐完全溶解。待顺丁烯二酸酐完全溶解后，用滴液漏斗缓慢加入13mL呋喃，用时13分钟。控制温度在38℃开始反应。反应1小时后溶液出现白色固体，且时间越长白色固体越多。反应至24小时后抽滤，得白色固体的化合物2，即5,6-双脱氢去甲斑蝥素。干燥称重为17.459g，收率85.75％。熔点：122～123℃，比移值R_f：0.52(展开剂为石油醚∶乙酸乙酯＝3∶1)；¹HNMR(CDCl₃)：δ3.18(s，2H)，5.47(s，2H)，6.58(s，2H)。

上述实施例1的步骤a)中用于溶解顺丁烯二酸酐的有机溶剂除了乙醚外，还可用N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、二氯甲烷、氯仿、乙腈、四氢呋喃中的任一种代替；所述反应温度可在35℃～45℃之间。

实施例2、5-烯-去甲斑蝥素单酸苄酯3的制备：

称取5g原料2溶于40ml二氯甲烷中，形成悬浮液。然后向悬浮液中逐滴加入苯甲醇4.7ml，以及DMAP366mg.室温下搅拌3天，旋蒸除去溶剂，得到5,6-双脱氢去甲斑蝥素单甲酯2粗产品。将得到的粗产品溶解于25ml二氯甲烷中，用7ml的1N盐酸洗涤一次，留下有机相，再用10ml饱和食盐水洗涤一次，留下有机相，加入适量无水MgSO₄干燥15-30分钟，抽滤，滤饼用二氯甲烷冲洗2-3次，留下滤液，将滤液旋蒸，得到5-烯-去甲斑蝥素单酸苄酯3的白色固体(4.08g)，收率为50％。¹HNMR(DMSO-d₆)：δ12.43(s,1H),7.30-7.35(m,5H),7.38(m,5H),6.43(d,J＝4Hz,2H),4.92-5.10(m,4H)；¹³CNMR(DMSO-d₆):δ173.07,171.93,137.15,136.97,128.79,128.40,80.49,80.16,66.31,47.14,46.41.

实施例3.喜树碱(2-苄氧羰基-5-烯)去甲斑蝥素酸酯4的制备

往反应瓶中加入喜树碱(60mg，0.17mmol)和10ml二氯甲烷,然后依次加入5-烯-去甲斑蝥素单酸苄酯(3,93.2mg,0.34mmol,2equ.),EDCI(161.3mg,0.84mmol)以及DMAP(13.4mg，0.11mmol)。反应液加热回流24小时。加入二氯甲烷(30ml)稀释反应液,依次用水、饱和碳酸钠溶液和饱和食盐水洗涤。有机相用无水MgSO₄干燥。溶剂旋干后,剩余物柱层析纯化得到一黄色固体的偶联产物(化合物4,73.5mg)，收率71.6％。R_f＝0.44(DCM/MeOH＝95/5).¹HNMR(CDCl₃)：δ8.39(s,1H),8.20(d,J＝8Hz,1H),7.94(d,J＝8Hz,1H),7.84(d,J＝8Hz,1H),7.81(s,1H),7.67(t,J＝8Hz,1H),7.38(m,5H),7.18(s,1H),6.99(d,J＝4Hz,1H),5.71(d,J＝8Hz,1H),5.42(d,J＝8Hz,1H),5.27(d,J＝12Hz,1H),2.18-2.34(m,2H),1.01(t,J＝8Hz,3H),0.87-0.88(m,4H).¹³CNMR(CDCl₃):δ165.84,163.27,162.53,156.27,151.16,147.82,145.41,144.22,134.38,133.94,131.22,130.19,129.61,128.43,127.66,127.57,127.39,127.17,127.16,127.07,119.26,108.97,94.74,66.31,66.12,48.95,36.07,30.81,28.68,21.67,13.40,6.58.

实施例5、新型喜树碱衍生物的活性测试

细胞株和溶剂

人肝癌细胞HEPG2；

人胃癌细胞BGC803；

人结肠癌细胞SW480；

细胞培养于含10％胎牛血清的RPMI1640中培养基；

溶剂：二甲亚砜(简称为DMSO)。

CCK-8染色法检测细胞抗肿瘤活性实施方案

选用待测肿瘤活细胞比例达90％以上的细胞进行实验。细胞增殖抑制试验采用EnoGeneCell^TMCountingKit-8(简称为CCK-8)细胞活力检测试剂盒。细胞消化、计数、制成浓度为1×105个/mL的细胞悬液，96孔板中每孔加入100μL细胞悬液(每孔1×104个细胞)；96孔板置于37℃，5％CO2培养箱中培养24小时；每孔加入100μL相应的含药物的培养基，作用浓度为50μMol/L(即：微摩尔/升)，同时设立阴性对照组，溶媒对照组，阳性对照组(阳性对照分别选用斑蝥素和喜树碱)，每组5复孔；96孔板置于37℃，5％CO2培养箱中培养72小时后；每孔加入10μLCCK-8溶液，将培养板在培养箱内孵育4小时，用酶标仪测定在450nm处的吸光值(简称OD值)，计算各个化合物对人肝癌细胞HEPG2、人胃癌细胞BGC803和结肠癌细胞SW480的抑制率。实验结果详见表1-3。

表1:对人肝癌细胞HEPG2的体外增殖活性的抑制率

组别	抑制率(％)
		喜树碱	72.46
斑蝥素	78.58
		化合物4	33.14

表2:对人胃癌细胞BGC803的体外增殖活性的抑制率

组别	抑制率(％)
		喜树碱	63.00
斑蝥素	70.74
		化合物4	70.24

表3:对人结肠癌细胞SW480的体外增殖活性的抑制率

组别	抑制率(％)
		喜树碱	76.77
斑蝥素	70.97
		化合物4	72.38

表1-3实验结果看出，本发明化合物4具有很好体外抗肿瘤活性，其50μMol/L作用浓度对于人胃癌细胞BGC803和结肠癌细胞SW480的体外抑制率高达70％以上，与阳性对照药物喜树碱和斑蝥素的抑制活性相当；而对于人肝癌细胞HEPG2，也有一定的抑制活性。

此外，相对于阳性对照药品喜树碱和斑蝥素，由于引入带氧桥环的去甲斑蝥素类似结构，其对于酸较为敏感，易于水解，从而可增强药代动力学效力。因此，化合物4是一种适合的抗肿瘤候选药物，尤其是作为抗胃癌、抗结肠癌及抗肝癌的候选药物，最优选是作为抗胃癌和抗结肠癌的候选药物。

Claims

1.喜树碱-20位酯衍生物，其结构式如式4所示，

2.根据权利要求1所述的喜树碱-20位酯衍生物4的合成方法，包括：1)、侧链化合物3与喜树碱在有机溶剂中，在耦合剂及有机碱催化剂作用下反应得到偶联产物4，反应式见以下：

3.根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于，步骤1)所述的耦合剂选自1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐或二环己基碳二亚胺。

4.根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于，步骤1)所述的所述有机碱选自三乙胺、二异丙基胺或4-二甲氨基吡啶。

5.根据权利要求2中所述的用于合成喜树碱-20位酯衍生物4的侧链化合物3。

6.根据权利要求5所述的侧链化合物3的制备方法，包括：a)、以呋喃为原料，与化合物1在有机溶剂中反应得到化合物2，b)、化合物2在有机溶剂中与苯甲醇反应得到化合物3，合成路线见以下：

。

7.根据权利要求1所述的喜树碱-20位酯衍生物4用于制备抗肿瘤药物的用途。

8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，所述肿瘤包括胃癌、结肠癌或肝癌。

9.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，所述肿瘤包括胃癌或结肠癌。