CN104673274A - 一种用于肿瘤转移倾向评估的靶向示踪的酸敏感近红外荧光探针 - Google Patents

Abstract

本发明属分子影像试剂领域，涉及一种用于肿瘤转移倾向评估的靶向示踪的酸敏感近红外荧光探针及其合成、表征、光学性质和活体无创显像中的应用。本发明将两个近红外荧光基团通过酸敏感腙键连接形成二聚体探针，该探针在肿瘤组织中弱酸性条件下腙键快速断开，淬灭效应消失，导致荧光大幅度增强，实现肿瘤诊断，以及对肿瘤酸性区域描绘，并判断肿瘤转移倾向，该探针可用于活体肿瘤高信噪比显像，通过体外影像学重建可实现肿瘤内部酸性区域的描绘；根据肿瘤酸化区域的分布特征从而判断肿瘤转移倾向。为肿瘤个性化治疗方案及疗效评估体系提供依据。

Description

一种用于肿瘤转移倾向评估的靶向示踪的酸敏感近红外荧光探针

技术领域

本发明属分子影像试剂领域，涉及一类对肿瘤微酸环境具有应激能力的pH敏感近红外荧光探针。更具体的涉及一种用于肿瘤转移倾向评估的靶向示踪的酸敏感近红外荧光探针及其合成、表征、光学性质和活体无创显像中的应用。该探针可用于活体肿瘤高信噪比显像，通过体外影像学重建可实现肿瘤内部酸性区域的描绘；根据肿瘤酸化区域的分布特征从而判断肿瘤转移倾向。 

背景技术

现有技术公开了肿瘤的发生不仅取决于肿瘤细胞自身的性质，而且与肿瘤细胞存在的微环境有密切联系。肿瘤微环境是指肿瘤在其发生过程中所处的内环境，包括肿瘤细胞本身、间质细胞、微血管、组织液及少量浸润细胞等[Brown,J.M.etal,CancerBiol.Ther.,2002,1(5),453–4058]。早在1989年，Stephen Paget提出了“种子与土壤”假说，作为“种子”的肿瘤细胞如果能定居于适合其生长的“土壤”，即肿瘤微环境，肿瘤就能发生，增殖及侵袭[Fidler,U.et al,CancerMetastasisRev.,1989,8(5),453–4058]，所以肿瘤微环境对肿瘤细胞至关重要。此外，实体肿瘤组织普遍存在酸化，缺氧和高组织间隙渗透压等特征[Gatenby,R.A.etal,Nat.Rev.Cancer,2004,4(11),891–899]。其中，癌细胞在缺氧条件下高水平糖代谢所造成的组织间液的弱酸性（pH6.2－6.9）是肿瘤微环境最普遍的现象，它在肿瘤转移[Gatenby,R.A.etal,Nat.Rev.Cancer,2004,4(11),891–899]、抵抗放射/化学药物治疗[Bhujwalla,Z.M.etal,Br.J.Cancer,1998,5(78),606–611]、新生血管生成[Fukumura,D.etal,CancerRes.,2001,61(16),6020–6024]、侵袭[Martin,N.K.etal,J.Theor.Biol.,2010,267(3),461–470]等方面具有重要影响。同时，对肿瘤微酸环境的中和还能够抑制肿瘤转移速度，并提高疗效评估水平。因此，对肿瘤微酸环境的描绘不仅能够预估肿瘤侵袭/转移可能性，为肿瘤病人治疗提供最优治疗方案，而且对肿瘤个性化疗效评估具有重要意义。 

目前，磁共振技术包括超极化¹³C磁共振波谱[Gallagher,F.A.etal,Nature,2008,453(7197),940-U73.]、磁共振波谱成像[Gillies,R.J.etal,Am.J.Physiol.,1994,267(2),734-741.]及化学交换饱和转移成像[Sheth, V.R.etal,Magn.Reson.Med.2012,67(3),760-768.]已经能够在一定程度上对肿瘤微酸环境进行描绘。但是，由于磁共振技术灵敏度低，信号收集时间长，运行成本高等因素限制了其临床转化。光学成像作为一门新兴成像手段，具超高灵敏度，信号收集时间短，无电离辐射，运行成本低等优点。可见光（400-600nm）由于受到光信号在组织中的强吸收，散射，反射和信号衰减等因素，只能在组织表面或亚表面成像（1-3mm）。然而血红蛋白、水，脂质等内源性分子在650-900nm近红外波长范围内的吸光率较低，加之活体组织在这一波长区域自发荧光较低，因此近红外光可以穿透较深的组织(≤5cm)并得到信噪比较高的图像[Achilefu,S.etal,Technol.Cancer.Res.T.,2004,3(4),393-409]。 

传统受体靶向探针通过对肿瘤高表达受体的识别实现病灶部位靶向示踪。由于受体表达水平受到肿瘤大小，肿瘤类型及发展阶段等个体因素影响，限制了其对病灶部位示踪的准确性与普适性。。对肿瘤微酸环境具有应激能力的“智能型”探针，在正常组织内，探针信号处于“沉默”状态，，但是在肿瘤组织酸性环境中，信号“开启”，荧光强度将显著提高，进而大幅提高肿瘤/正常组织间的信噪比，为早期/小体积肿瘤的准确示踪提供帮助。同时，由于细胞外液酸化几乎是所有固体肿瘤的共同特点，因此这类普适性探针具有更广的应用前景。另外，文献报道腙键、缩醛键在生理弱酸性条件下的水解速度较正常条件下快100－500倍[Kale,A.A.etal,Bioconjug.Chem.2007,18(2),363-370]。 

因此，本申请的发明人拟提供以腙键为连接键制备对肿瘤微酸环境具有应激能力的“智能型”探针。 

发明内容

本发明的目的是提供对肿瘤微酸环境具有应激能力的pH敏感近红外荧光探针，具体涉及一种用于肿瘤转移倾向评估的靶向示踪的酸敏感近红外荧光探针及该探针其合成、表征、光学性质和活体无创显像中的应用。 

本发明的靶向示踪的酸敏感近红外荧光探针，在活体状态下能够对肿瘤准确示踪，在离体条件下实现肿瘤内酸化区域3D描绘，能厘清肿瘤酸化区域分布与肿瘤转移倾向之间的相关规律。 

本发明的的靶向示踪的酸敏感近红外荧光探针，为对肿瘤微酸环境具有信号 应激能力的小分子近红外荧光探针，该探针中，两个花箐类近红外荧光基团以pH敏感的腙键相链接，在生理弱酸性环境中可实现荧光信号从“沉默”到“开启”的显著转换，该探针不仅在活体条件下实现对肿瘤组织高信噪比显像，通过3D模型重建可对肿瘤酸性区域准确描绘，还可以根据酸性区域分布规律实现对肿瘤转移趋势的判断，为肿瘤病人个性化治疗方案的优选及肿瘤治疗疗效评估体系建立提供依据。 

本发明的的靶向示踪的酸敏感近红外荧光探针，其结构为： 

其中，R₁为羧基或者磺酸基， 

R₂为H，卤素,烷基，芳香基，硝基，磺酸基，醛基或羧基， 

X^-为氯离子，溴离子，碘离子或ClO₄ ^-， 

n是1，2，3，4，5，6，7或8, 

Linker1和Linker2为连接链, 

Linker3为酸敏感的化学键。 

本发明的酸敏感近红外荧光探针中，近红外荧光基团为羰花箐类近红外荧光染料；近红外荧光染料的修饰方法是通过C-C键直接与对羧基苯环相连。 

本发明中，所述的卤素包括氯,溴或碘； 

本发明中，烷基包括甲基，乙基，丙基，异丙基，丁基，异丁基； 

本发明中，芳香基包括苯基，萘基，取代苯基； 

本发明近红外荧光探针中，Linker1和Linker2为2-10原子组成的不同长度的链状连接链。 

本发明近红外荧光探针中，Linker3为对生理弱酸环境敏感的腙键或缩醛键。 

本发明中，生理弱酸环境是指pH5.0-pH6.9。 

本发明中，用于连接的腙键是通过醛基修饰的荧光染料与肼基修饰的荧光染 料反应得到。 

本发明荧光探针中，在生理中性条件下荧光处于淬灭状态，在肿瘤酸化环境中近红外荧光显著增强。 

本发明中，为验证目标探针对肿瘤的靶向示踪灵敏度及信噪比，申请人还制备了以酸稳定酰胺键连接的参比探针。 

两种探针的合成路线如下： 

连接键的合成： 

参比探针CONTROLPROBE： 

目标探针pHSENSITIVEPROBE: 

本发明依据组织外液酸化是固体肿瘤的共同特点的基础，提供了靶向示踪的酸敏感近红外荧光探针，将两个近红外荧光基团通过酸敏感腙键连接形成二聚体探针。该探针在中性条件下由于自聚集能量转移效应，保持淬灭状态，无荧光产生，但在肿瘤组织中弱酸性条件下腙键快速断开，淬灭效应消失，导致荧光大幅度增强，通过该机制不仅可以实现肿瘤诊断，还可以对肿瘤酸性区域进行描绘，同时可根据肿瘤酸性区域的不同分布特征判断肿瘤转移倾向，为临床治疗提供帮助。该探针可用于活体肿瘤高信噪比显像，通过体外影像学重建可实现肿瘤内部酸性区域的描绘；根据肿瘤酸化区域的分布特征从而判断肿瘤转移倾向。 

附图说明

图1，化合物2的¹H NMR核磁图。 

图2，化合物3的¹H NMR核磁图。 

图3，化合物4的¹H NMR核磁图。 

图4，化合物5的¹H NMR核磁图。 

图5，化合物6的¹H NMR核磁图。 

图6，化合物DiIRB-C的¹H NMR核磁图。 

图7，化合物7的¹H NMR核磁图。 

图8，化合物8的¹H NMR核磁图。 

图9，化合物DiIRB-S的¹H NMR核磁图。 

图10，荧光探针DiIRB-S（A-C）和参比探针DiIRB-C(D-F)的吸收光谱在不同pH缓冲溶液中随时间的变化趋势曲线，其中显示，通过756和686nm处的吸光度比值对时间作曲线可表示目标探针在不同酸性条件下水解速率（G），并得到3D图像（H）。 

图11，荧光探针DiIRB-S（A-C）的发射光谱在不同pH缓冲溶液中随时间的变化趋势曲线，其中显示通过其荧光强度对时间作曲线可表示目标探针在不同酸性条件下水解速率（D），并得到3D图像（E）。 

图12，荧光探针DiIRB-S在pH5.5和pH7.4孵育不同时间后的高效液相色谱图(A,B)，参比探针DiIRB-C在缓冲溶液中孵育并没有变化（C,D）。 

图13，荧光探针DiIRB-S和参比探针DiIRB-C在不同pH缓冲溶液中孵育2h内的光学成像（A,C），并对其荧光强度进行定量（B,D）。 

图14，荷瘤小鼠在注射肿瘤细胞（左、右侧分别为低、高转移）不同时间后，注射荧光探针DiIRB-S的活体光学成像图，其中箭头指示肿瘤组织。 

图15，肿瘤组织酸性区域3D重构图（A），对肿瘤切片不同区域进行定量结果（B）。 

图16，肿瘤切片的光学成像图和超灵敏pH试纸测试图。 

图17图：对肿瘤微酸环境具有应激能力的“智能型”探针结构示意图，其中显示正常组织内，空间相邻荧光基团间图16的自身淬灭作用使探针处于信号“沉默”状态，而在肿瘤微酸环境中，pH敏感化学键断裂将造成淬灭作用消失，从而使探针信号转变为“开启“状态。 

具体实施方式

通过下述实施例将有助于进一步理解本发明，但并不限制本发明的内容。 

实施例1  化合物1的合成 

6-氨基己酸（5g,0.0382mol）和氢氧化钠溶液（2M,30ml）混合加入在园底烧瓶中，在冰水浴中控制温度搅拌。氯甲酸苄酯（95%，5.5ml,0.0382mol）和氢氧化钠（4mol,9.375ml）交错缓慢滴入到搅拌剧烈的混合溶液中，反应20min。反应后由乙醚溶液萃取3次（3x30ml）,之后水层以盐酸溶液调pH值至3.0，同时控制温度在0至10℃之间。得悬浊液经过滤后以冰水洗涤，真空干燥后得白色固体9.61g，产率为95%。 

实施例2  化合物2的合成 

0.53g(2mmol)化合物1,0.433g1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(2.2mmol)和0.297g羟基苯并三氮唑（2.2mmol)溶于10.0mL  CH₂Cl₂溶液中，室温搅拌15min，然后加入叔丁氧羰基肼(0.29g,0.15mmol)反应14h.薄层色谱板显示有较小极性产物生成，产物加入到30ml乙酸乙酯中。有机层先后以10%柠檬酸溶液（10ml）、水（20ml）、10%碳酸钾溶液（10ml）和饱和氯化钠（10ml）洗涤。之后有机层以无水NaSO₄干燥，真空干燥得0.7g(85%)固体化合物2，化合物2的¹H NMR核磁图如图1所示。 

实施例3  化合物3的合成 

0.5g化合物2溶于20ml甲醇里，之后加入10%Pd/C。在H₂条件下反应24h后，有机层以硅藻土过滤，滤液真空干燥得白色固体混合物3(0.29g,90%)，化合物3的¹H NMR核磁图如图2所示。 

实施例4  化合物4的合成 

0.3g（0.4mmol）IR783，120mg(0.86mmol)碳酸钾和120mg(0.72mmol)对羧基苯硼酸加入到2ml水中,反应温度调至95℃,之后加入27mg(0.023mmol)四(三苯基膦)钯加入搅拌,反应2h后薄层色谱板显示有大极性的产物生成,产物经柱层析纯化(CH₂Cl₂:CH₃OH=10:2)得紫红色固体化合物4（2.5g,88%），化合物4的¹H NMR核磁图如图3所示。 

实施例5  化合物5的合成 

0.166g化合物4，43.3mg(0.22mmol)1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐,100μl三乙胺混合加入到6ml DMF中，反应5min后加入30mg(0.22 mmol)羟基苯并三氮唑,反应15min后加入73.5mg（0.3mmol）化合物3，避光过夜，小极性的产物以硅胶柱(CH₂Cl₂:CH₃OH=10:1.5)纯化得化合物159mg(75%)， 

化合物5的¹H NMR核磁图如图4所示。 

实施例6  化合物6的合成 

0.106g(0.1mmol)的化合物5加入到4ml混合溶液（CH₂Cl₂:TFA=1:1）中,反应4h后点板发现有极性较大产物生成。反应溶液真空干燥，产物以硅胶柱纯化(CH₂Cl₂:CH₃OH：Et₃N=10:2:0.1)的化合物6(86.6g,90%)，化合物6的¹H NMR核磁图如图5所示。 

实施例7  化合物DiIRB-C的合成 

将41mg(0.049mmol)化合物4和12mg(0.058mmol)N,N-二环己基碳二亚胺混合溶于2ml DMF溶液中，室温搅拌5min。然后把溶于0.5ml DMF溶液的12mg(0.088mmol)1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑逐滴加入以上混合溶液。20min后将溶于1.0ml DMF溶液的46mg(0.048mmol)化合物6逐滴加入以上混合溶液，避光反应14h。薄层色谱显示有较大极性产生，产物滴入冰乙醚溶液得绿色固体。粗品以硅胶柱纯化，二氯甲烷/甲醇为洗脱剂从80%-50%梯度洗脱，旋干冻干，得纯品29.1mg，产率为33.4%，化合物DiIRB-C的¹H NMR核磁图如图6所示。 

实施例8  化合物7的合成 

将100mg(0.12mmol)化合物4,80mg(0.13mmol)1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和40mg(0.29mmol)1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑共同溶于6.0mL DMF溶液中。然后加入48mg(0.46mmol)氨基乙醛缩二甲醇，室温搅拌14h。得到小极性产物，绿色溶液滴入乙醚中，绿色产物析出沉淀，硅胶柱纯化，二氯甲烷/甲醇为洗脱剂从90%-75%梯度洗脱，旋干冻干，得纯品93.8mg，产率为85%，化合物7的¹H NMR核磁图如图7所示。 

实施例9  化合物8的合成 

50mg(0.055mmol)化合物7溶于6ml88%甲酸溶液中，室温反应12h。40C真空旋干溶剂，以甲醇/水混合溶剂复溶产物，再次旋干，重复以上步骤至完全除去甲酸。得绿色纯品目标化合物8(46.5mg,98%)，合物8的¹H NMR核磁图如图8所示。 

实施例10  化合物DiIRB-S的合成 

将化合物6(40mg,0.049mmol)溶于2.0ml MES溶液中（pH4.5），然后将化合物8(47mg,0.049mmol)溶于0.5ml DMF溶液中，调节pH值至4.7，室温反应16h。薄层色谱显示大极性产物生成，结束反应时首先用0.1M氢氧 化钠溶液将pH值调至7.4，旋干后硅胶柱纯化，二氯甲烷/甲醇为洗脱剂从80%-50%梯度洗脱，旋干冻干后得产物37.4mg，产率42%，化合物DiIRB-S的¹H NMR核磁图如图9所示。 

实施例11  荧光探针DiIRB-S和DiIRB-C吸收光谱 

荧光探针的吸收光谱通过岛津-2401分光光度计进行测量。首先分别配制荧光探针DiIRB-S和DiIRB-C的DMSO标准母液（10mM/L）。与室温平衡后，分别用pH5.5-pH7.5(ΔpH=0.2)PBS磷酸缓冲溶液，稀释成0.5μM，立即取3ml样品加入石英比色皿中(10×10mm)，用HIMADZUUV-2550紫外分光光度计动态监测其吸收光谱2h内的变化(2,5,10,15,20,30,40,50,60,90,120min)，扫描速度为0.5nm/s，狭缝宽度为5.0nm，测量波长为400到900nm。以吸收波长756nm和686nm处的吸光度值的比值表示变化速率(附图10G)，以时间和pH分别为横坐标得3D曲线。荧光探针DiIRB-S的吸收光谱如图10所示。 

实施例12  荧光探针DiIRB-S和DiIRB-C发射光谱 

荧光探针的发射光谱通过配备有光电倍增管的岛津-5301PC荧光分光光度计进行测量。在实验前两种荧光探针分别稀释到PBS（pH7.4，pH6.5，pH5.5）缓冲溶液中，最终浓度为50nM。扫描速度设置为Medium，激发波长为745nm，测量波长为765到900nm，激发/发射狭缝宽度为5/5nm,灵敏度为Low。动态监测其在2h内的荧光强度变化，以荧光强度对时间作图可得其在不同酸性条件下荧光变化速度，以origin8软件处理数据，荧光探针DiIRB-S和参比探针DiIRB-C的发射光谱如图11所示。 

实施例13  荧光探针的分析型高效液相色谱实验 

高效液相色谱实验通过配备有AgilentG1315B光电二极管阵列检测器和WatersC-18色谱柱的高效液相色谱仪进行。将两种探针DiIR783-S和DiIR783-C的母溶液分别稀释到10μM，进样体积均为20μl，检测信号设定在782nm，流动相流速为0.5ml/min。流动相A为浓度5.0mM溴化铵的水溶液， 流动相B为分析纯甲醇。两种探针在25℃不同pH缓冲溶液中孵育不同时间（10min,1h,3h,6h,12,24h）后进样，分析过程流动相比例以梯度洗脱进行。0min,20%B;10min,70%B;20min,70%B;30min,80%B;40min,80%B，以光电二极管阵列检测器收集在756nm处的吸收信号，荧光探针DiIRB-S和参比探针DiIRB-C的高效液相色谱如图12所示。 

实施例14荧光探针溶液状态光学显像研究 

为了进一步证明生理弱酸性条件下，水溶液状态下荧光探针DiIRB-S荧光强度的变化可被IVIS活体成像仪所检测到，将两种荧光探针（10mMDMSO溶液）分别用pH5.5-pH7.4（ΔpH=0.2）缓冲溶液稀释至1μM，室温下静置不同时间（5,10,20,30,45,60,90,120min）后，取150μl加入到96孔中。以IVIS活体成像仪（实验参数为：激发波长745nm，荧光发射滤片800nm,曝光时间500ms）荧光成像，荧光定量后以时间和pH为参数拟合3D曲线。荧光探针DiIRB-S的光学显像如图13所示。 

实施例15  小鼠模型和肿瘤原位种植 

1.体外细胞培养 

HepG2和HCCLM3-GFP肝癌瘤细胞系在75cm²培养瓶中单层培养。使用添加有10％胎牛血清（FBS）、2mM/L－谷氨酰胺、1％青霉素，链霉素（Invitrogen，Carlsbad,CA）的DMEM培养基并置于有充分湿气的含5％CO₂的37℃培养箱中培养，当细胞长满80％的面积时消化收集，以使细胞保持在指数增长状态； 

2.小鼠肿瘤模型建立 

所有的动物实验都依照复旦大学伦理委员会评估和认可的指南进行，10%水合氯醛将小鼠麻醉后，野生型人类低转移HepG2肝癌瘤细胞（2.0×10⁶细胞重悬于100μlPBS）注射到小鼠左肩处，而高转移HCCLM3-GFP肝癌瘤细胞（2.0×10⁶细胞重悬于100μlPBS）注射到小鼠右肩处，接种后20－30天，肿瘤长到直径0.8－1.2cm大小，进行显像实验。 

实施例16  体内和离体的光学显像研究 

光学显像研究是用CRI公司的体内多光谱显像系统进行，成像前，小鼠用水合氯醛（2.5mg/kg）麻醉，并且俯位固定在成像板上，每只小鼠尾静脉注射20nmol的两种荧光探针24h后，白光摄影（自动曝光）和近红外荧光显像（自动曝光）分别在同样大小的视野（FOV）下摄取（ROI:Full，Maxsamplesize:max,Bin=2×2），最后，小鼠被麻醉并心脏灌流4%PFA进行预固定， 

荷瘤小鼠注射荧光探针DiIRB-S24h后活体光学成像图如图14所示。 

实施例17  肿瘤组织酸性区域定量及3D重构 

小鼠注射荧光探针2小时后麻醉，分别以PBS（pH7.4），多聚甲醛溶液（4%）及灌流，脂溶性菁染料可用来标记血管，用组织切片磨具将肿瘤组织切成厚度为1.0mm的薄片，分别以近红外滤片800nm（曝光时间2秒）滤片拍摄荧光照片，以ImageJ软件对肿瘤区域进行划分，并对其荧光强度定量，图片转换为RGB格式，以Amira软件进行肿瘤组织酸性区域3D重构，结果表明，高转移倾向肿瘤酸性区域呈块状不均匀分布在肿瘤边缘，而低转移肿瘤倾向肿瘤酸性区域均匀分布在肿瘤内部，荧光探针DiIRB-S3D重构肿瘤组织酸性区域如图15所示。 

实施例18  pH试纸指示肿瘤酸性区域 

为了验证肿瘤切片中荧光区域为酸性区域，实验中以超灵敏pH试纸（pH6.0-pH7.4）对肿瘤切片测量，荷瘤小鼠尾静脉注射荧光探针DiIRB-S2小时后麻醉，灌流，分离出肿瘤组织，用组织切片磨具切成厚度为1.0mm的薄片，平铺在玻璃板上，以pH试纸均匀的盖住切片，2秒后取下切片并用相机拍照pH试纸，肿瘤切片则用IVIS活体成像仪拍摄荧光照片，pH试纸指示肿瘤酸性区域如图16所示。 

Claims (12)

1.一种用于肿瘤转移倾向评估的靶向示踪的酸敏感近红外荧光探针，其特征 

在于，其结构为： 

其中，R₁为羧基或者磺酸基， 

R₂为H，卤素,烷基，芳香基，硝基，磺酸基，醛基或羧基， 

X^-为氯离子，溴离子，碘离子或ClO₄ ^-， 

n是1，2，3，4，5，6，7或8, 

Linker1和Linker2为连接链, 

Linker3为酸敏感的化学键。 

2.按权利要求1所述的用于肿瘤转移倾向评估的靶向示踪的酸敏感近红外荧光探针，其特征在于，所述的卤素选自氯,溴或碘。 

3.按权利要求1所述的用于肿瘤转移倾向评估的靶向示踪的酸敏感近红外荧光探针，其特征在于，所述的烷基选自甲基，乙基，丙基，异丙基，丁基或异丁基。 

4.按权利要求1所述的用于肿瘤转移倾向评估的靶向示踪的酸敏感近红外荧光探针，其特征在于，所述的芳香基选自苯基，萘基或取代苯基。 

5.按权利要求1所述的用于肿瘤转移倾向评估的靶向示踪的酸敏感近红外荧光探针，其特征在于，所述的Linker1和Linker2为2-10原子组成的不同长度的链状连接链。 

6.按权利要求1所述的用于肿瘤转移倾向评估的靶向示踪的酸敏感近红外荧光探针，其特征在于，所述的Linker3为对生理弱酸环境敏感的腙键或缩醛键。 

7.按权利要求6所述的用于肿瘤转移倾向评估的靶向示踪的酸敏感近红外荧光 探针，其特征在于，所述的生理弱酸环境是指pH5.0-pH6.9。 

8.按权利要求6所述的用于肿瘤转移倾向评估的靶向示踪的酸敏感近红外荧光探针，其特征在于，所述的用于连接的腙键是通过醛基修饰的荧光染料与肼基修饰的荧光染料反应得到。 

9.权利要求1所述的用于肿瘤转移倾向评估的靶向示踪的酸敏感近红外荧光探针的制备方法，其特征在于，通过下述合成路线制备： 

连接键的合成： 

参比探针CONTROL PROBE： 

目标探针pH SENSITIVE PROBE: 

10.权利要求1所述的用于肿瘤转移倾向评估的靶向示踪的酸敏感近红外荧光探针在制备判断肿瘤转移倾向评估制剂中的用途。 

11.按权利要求10所述的用途，其特征在于，所述的荧光探针在生理中性条件下荧光处于淬灭状态，在肿瘤酸化环境中近红外荧光显著增强。 

12.按权利要求10所述的用途，其特征在于，所述的荧光探针通过描绘肿瘤内部酸化区域实现对其转移倾向评估。