CN111217909A - 一种分子探针及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提出了一种分子探针，其分子结构为
Figure DDA0002361425230000011
本发明中的分子探针提供了一种高选择性、高灵敏度并可应用于检测结直肠癌荷瘤小鼠PD‑L1抗体表达的分子探针显像剂。

Description

一种分子探针及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及药物化学和生物医学影像领域，特别是涉及一种分子探针及其制备方法与应用。
背景技术
生物荧光成像技术是指利用荧光探针(分子)对细胞、组织甚至生物体进行成像，来研究生物学过程和信息的方法。荧光成像技术的关键是希望能获得直观清晰的图像来分辨细微结构，进而分析细胞或生物体特定区域的特征、状态，甚至特定分子的表达、分布等信息。生物荧光成像技术具有分辨率高、成像速度快和无损探测等优点，在探寻疾病的发病机理、临床表现、基因病变，疾病诊断和新的医疗手段的开发等方面具有重要的实践意义和应用前景。生物荧光成像技术在细胞和组织等体外检测方面已经发展到了极其成熟的阶段，商业化的可生物接枝的荧光染料基本上覆盖了整个可见光区以及近红外一区(400-850纳米)；相关配套的荧光显微镜及成像系统也接近完善。然而生物荧光成像在活体成像方面仍然面临巨大的瓶颈和挑战，主要原因有两个方面：其一是生物体本身存在可见光波段的自发荧光，导致活体成像的背景增大，分辨率大大降低；其二由于光子在穿透生物体存在着强烈的散射作用，因此无法进行比较深的活体荧光成像。解决此问题的方法就是选用发射波长较长的红外一区(750-900纳米)甚至近红外二区(1000-1700纳米)的荧光材料进行生物成像。IRDye800CW作为一种高效的近红外一区(750-900纳米)荧光探针，目前已经被广泛应用在实验活体成像甚至临床成像方面，取得了相比于可见光波段成像较好的活体成像效果。
结直肠癌是全世界最常见的癌症之一，占所有恶性肿瘤的10％。结直肠癌的早期诊断、精准治疗以及及时的预后评估是影响癌症治疗效果及患者结局的重要因素。而传统的癌症治疗和靶向治疗的患者通常会出现耐药性。癌症免疫疗法很可能成为癌症临床治疗的关键。免疫检查点阻断已成为一种很有前途的癌症免疫治疗方法。针对PD-1/PD-L1的单克隆抗体的免疫疗法，通过结合配体或受体，阻断PD-1和PD-L1相互作用，在多种癌症中显示了显著的临床疗效，包括结直肠癌、黑色素瘤、非小细胞肺癌、霍奇金淋巴瘤。肿瘤中程序性死亡受体配体-1(PD-L1)的表达已被用作预测抗PD-L1免疫治疗反应的生物标记。PD-L1的无创性检测可作为指导和监测免疫治疗的一个重要的生物学标志物。
现有技术中有免疫组织化学技术、正电子发射断层显像(PET)技术和单光子计算机断层扫描的PD-L1检测、流式细胞仪、可溶性PD-L1的检测、液态活检等。但是，到目前为止，很少有用于直接快速检测结直肠癌PD-L1的近红外荧光分子探针。因此合成一个基于结直肠癌PD-L1表达水平的高选择性、高灵敏度的荧光分子探针具有重大的意义。本发明制备的光学分子探针NIR-PD-L1-mAb是利用
Figure BDA0002361425210000021
800CW NHS Ester与PD-L1 mAb通过一步偶联反应制备而成的，可用于检测不同结直肠癌细胞(SW620、SW480和HCT8)中PD-L1的表达水平。
发明内容
荧光检测方法以其高灵敏度、操作简单，并且可应用于细胞成像等优点，受到了广泛的关注，近年来，也报道了一些利用
Figure BDA0002361425210000031
800CW制备荧光分子探针的研究，但都未涉及结直肠癌荷瘤小鼠模型及PD-L1抗体相关应用，因此合成一个高选择性、高灵敏度并可应用于检测结直肠癌荷瘤小鼠PD-L1抗体表达的荧光分子探针仍然是一个具有挑战性的课题。为解决上述的问题，本发明提供了一种分子探针及其制备方法与应用，具体是通过以下技术方案来实现的：
一种分子探针，该分子探针为NIR-PD-L1-mAb，所述的NIR-PD-L1-mAb化学结构式为
Figure BDA0002361425210000032
一种分子探针的制备方法，具体包括以下步骤：
a、纯化抗PD-L1单克隆抗体得到PD-L1 mAb；
b、将近红外光学染料加入DMSO溶液，配制成浓度为5mg/ml的溶液；
c、取1～10mg/ml的PD-L1 mAb放入离心管中，加入0.2mol/L～1.0mol/L的缓冲液混匀，PD-L1 mAb与缓冲液的体积比为1:1，混匀后加入步骤b所得溶液，立即混匀，将混合液放入20～25℃水浴避光反应2小时；
d、用PD-10柱纯化，合并蛋白峰管。
进一步的，所述缓冲液为硼酸盐缓冲液或磷酸盐缓冲液。
进一步的，所述缓冲液PH值为8.3～8.9。
进一步的，所述近红外荧光染料为
Figure BDA0002361425210000041
800CW NHS Ester
进一步的，所述PD-L1 mAb与
Figure BDA0002361425210000042
800CW NHS Ester的摩尔比为1:1.1～1:3。
进一步的，所述步骤a中纯化的具体步骤为：
1)用Na2HPO4与M NaH2PO4配制50mmol/L的磷酸盐缓冲液，Na2HPO4与NaH2PO4的摩尔比为1:1，PH为8.5；
2)用上述缓冲液将一根新的PD-10柱平衡；
3)抗体浓度的测定：取Anti-PD-1抗体用紫外分光光度计测量OD280nm和OD260nm，计算抗体浓度；
4)将步骤3的抗PD-1抗体全部上PD-1柱纯化，去除叠氮化钠，用磷酸盐缓冲液洗脱，收集蛋白峰管；
5)合并蛋白峰管后冷冻干燥。
基于一种分子探针的应用，所述应用为一种分子探针在制备一种用于检测结直肠癌细胞中PD-L1的表达水平的显影剂中的应用。
基于一种分子探针的应用，所述应用为一种分子探针在用于检测结直肠癌细胞中PD-L1的表达水平的试剂盒中的应用。
本发明的有益效果是：
(1)在PD-L1检测时所采用的抗体单一；
(2)检测结果评定直观；
(3)无创，操作简单，定性、定量检测；实时检测肿瘤生物靶点，可重复。准确评估肿瘤生物靶点表达的动态变化情况；
(4)同时显示原发灶和转移灶的表达，客观全面反应PD-L1的表达水平；
(5)本发明提供的一种分子探针及其制备方法可用于快速准确检测不同结直肠癌细胞(SW620、SW480和HCT8)中PD-L1的表达水平。
附图说明
图1为本发明实施例中体外细胞和探针结合示意图；
图2为本发明实施例中皮下瘤种植位置示意图；
图3为本发明实施例中结直肠癌细胞SW620模型鼠体内NIR-PD-L1-mAb分布脏器图；
图4为本发明实施例中结直肠癌细胞SW620模型鼠体内NIR-PD-L1-mAb分布荧光定量柱状图；
图5为本发明实施例中结直肠癌细胞SW480模型鼠体内NIR-PD-L1-mAb分布脏器图
图6为本发明实施例中结直肠癌细胞SW480模型鼠体内NIR-PD-L1-mAb荧光定量柱状图；
图7为本发明实施例中结直肠癌细胞HCT8模型鼠体内NIR-PD-L1-mAb分布脏器图；
图8为为本发明实施例中结直肠癌细胞HCT8模型鼠体内NIR-PD-L1-mAb荧光定量柱状图。
具体实施方法
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
如图1所示，一种分子探针，该分子探针为NIR-PD-L1-mAb，所述的NIR-PD-L1-mAb化学结构式为
Figure BDA0002361425210000061
一种分子探针的制备方法，具体包括以下步骤：
a、纯化抗PD-L1单克隆抗体得到PD-L1 mAb；
b、将近红外光学染料加入100μL DMSO溶液，配制成浓度为5mg/ml的溶液；
c、取100μL 1～10mg/ml的PD-L1 mAb放入离心管中，加入100μL 0.2mol/L～1.0mol/L的缓冲液混匀，混匀后加入1.6～4.9μL步骤b所得溶液，立即混匀，将混合液放入20～25℃水浴避光反应2小时；
d、用PD-10柱纯化，合并蛋白峰管。
进一步的，所述缓冲液为硼酸盐缓冲液或磷酸盐缓冲液。
进一步的，所述抗PD-L1单克隆抗体保存于含0.02％叠氮化钠的PBS溶液中。
进一步的，所述缓冲液PH值为8.3～8.9。
进一步的，所述近红外荧光染料为
Figure BDA0002361425210000071
800CW NHS Ester。
进一步的，所述PD-L1 mAb与
Figure BDA0002361425210000072
800CW NHS Ester的摩尔比为1:1.1～1:3。进一步的，所述步骤a中纯化的具体步骤为：
1)用0.2M Na2HPO4与0.2M NaH2PO4配制50mmol/L的磷酸盐缓冲液200ml，PH为8.5；
2)用上述缓冲液将一根新的PD-10柱平衡5个床体积；
3)抗体浓度的测定：取1支100μL，100μg的Anti-PD-1抗体用紫外分光光度计测量OD280nm和OD260nm，计算抗体浓度；
4)将此100μL的抗PD-1抗体全部上PD-1柱纯化，去除叠氮化钠，用50mmol的磷酸盐缓冲液洗脱，收集蛋白峰管；
5)合并蛋白峰管后冷冻干燥。
进一步的，所述步骤5)中的冷冻干燥是用冷冻干燥机进行的。
实施例2
1.PD-L1分子影像探针的制备与分析
(1)抗PD-L1单克隆抗体的纯化
抗PD-L1单克隆抗体(100μg，浓度1.0mg/ml，货号：EPR19759)保存于含0.02％叠氮化钠的PBS溶液中。具体纯化步骤：
1)用0.2M Na2HPO4与0.2M NaH2PO4配制50mmol/L PB溶液200ml，PH 8.5。
2)用上述buffer将一根新的PD-10柱平衡5个床体积。
3)抗体浓度的测定：取1支100μL，100μg的Anti-PD-1抗体用紫外分光光度计测量OD280nm和OD260nm。OD260nm＝0.8327；OD280nm＝1.2951；计算抗体浓度为1.2617mg/ml。
4)将此100μL的抗PD-1抗体全部上PD-1柱纯化，去除叠氮化钠等。用50mmol PB溶液洗脱，收集蛋白峰管测定OD260nm、OD280nm值。
5)合并蛋白峰管后冷冻干燥。
(2)近红外光学染料的获得
近红外(NIR)荧光染料购于德国LI-COR公司，商品名：IRDye 800CW-NHS Ester，分子数：1166.20；CAS number：956579-01-4；化学分子式：C50H57N3O17S4.3Na。染料规格：0.5mg货号：P/N 929-70020。染料-20°避光保存。本实验用DMSO配制成25mg/ml的工作储备液。IRDye 800CW染料的消光系数240000，最大吸收波长774nm,最大发射波长789nm。
(3)PD-L1光学显像分子探针NIR-PD-L1 mAb的制备
a.纯化抗PD-L1单克隆抗体；
b.将近红外光学染料加入100μL DMSO溶液，配制成浓度为5mg/ml的溶液；
c.取100μL 1～10mg/ml PD-L1 mAb加入1.5ml尖底塑料离心管中，加入100μL0.2mol/L～1.0mol/L的硼酸盐(或磷酸盐)缓冲液pH8.6(pH8.3～pH 8.9均可)，混匀；加入1.6～4.9μL 5mg/ml(如果所联的抗体为小分子抗体或Fab，则可采用25mg/ml的溶液)的
Figure BDA0002361425210000091
800CW NHS Ester DMSO溶液(摩尔比为PD-L1 mAb:
Figure BDA0002361425210000092
800CW NHS Ester＝1:1.1～1:3)，立即混匀；(后面可删除)与PD-L1 mAb以适当比例在中混匀；
d.将混合液放入20～25℃水浴避光反应2小时；
e.用PD-10柱纯化，合并蛋白峰管；
f.用紫外可见分光光度计分别测定260nm、280nm和780nm处的光吸收值，计算产品NIR-PD-L1 mAb的蛋白质浓度和每个抗体分子标记上的染料分子数。
(4)分子探针的有关特性分析
①化学纯度测定
用凝胶TSK柱(型号G2000SWXL)HPLC法或者SDS-PAGE结合荧光成像法测定NIR-PD-L1 mAb的化学纯度。
②体外稳定性分析
将分子探针分别与200μL 50mmol/L PBS pH7.4和200μl鼠抗凝血浆于4℃、25℃和37℃密闭孵育不同时间(1h，2h，4h，8h，24h，48h和96h)后，采用①中的方法测定其化学纯度，考察分子探针NIR-PD-L1 mAb的体外稳定性。
(5)分子探针NIR-PD-L1 mAb与PD-L1的亲和力分析
①细胞试验系统
体外培养不同结直肠癌肿瘤细胞，包括HCT116、HCT8、HT29、LS174T、LOVO、SW480和SW620等，待细胞生长至所需的量时(5×106)，将细胞用胰蛋白酶消化，收集细胞，并计数。
②分子探针与PD-L1的亲和力的测定
将细胞用PBS溶液洗涤，并用含有10％FBS的PBS封闭。将光学标记的抗体分子探针NIR-PD-L1 mAb与细胞在37℃下培养1小时，同时加入10倍摩尔当量的过量未标记的mAb进行PD-L1阻断对比。孵育后，将细胞用冷PBS洗涤三次，然后在荧光分光光度计上测量其荧光强度。也可用流式细胞仪来测定不同结直肠癌肿瘤细胞中PD-L1的表达水平，比较不同结直肠癌肿瘤细胞与NIR-PD-L1 mAb分子探针亲和力的大小。
2.皮下荷瘤模型体内NIR-PD-L1-mAb光学显像和离体器官生物学分布实验
(1)NIR-PD-L1 mAb光学显像动物模型的建立
6-8周龄BALA/C裸小鼠共20只，体重15-20g，购于常州卡文斯实验动物公司，饲养于无病原(SPF)条件层流室。在已批准的江苏省原子医学研究所无菌动物实验室饲养小鼠。无菌条件下于小鼠右前肢皮下接种0.15ml结直肠癌肿瘤细胞悬液HCT8(5×106个)、SW480(5×106个)、SW620(5×106个)。接种后饲养于恒温、恒湿条件中，每隔5天观察肿瘤生长情况，测量肿瘤直径计算肿瘤体积，V＝1/2ab2，(V：肿瘤体积，a:肿瘤长径，b:肿瘤短径)。当荷瘤体积达到8-10mm3时进行成像。所有程序均经江苏省原子医学研究所机构动物伦理和使用委员会(IACUC)批准。
(2)NIR-PD-L1-mAb光学显像和离体器官生物学分布的分析
使用NIR-PD-L1-mAb光学显像来评估不同肿瘤模型中PD-L1表达情况。将200μlNIR-PD-L1-mAb(约9.5μg蛋白质)经鼠尾静脉注射到HCT8、SW480和SW620荷瘤模型小鼠体内。显像前用2％异氟烷气流麻醉小鼠，采用Pearl Impulse成像仪在白光和800nm通道(软件v2.0，LI-COR Biosciences)下采集注射后24小时、48小时、72小时和120小时的小鼠右侧卧位光学图像。光学信号的定量分析，分别在小鼠肿瘤区域及非肿瘤区绘制大小相等的感兴趣区域(ROI)，肿瘤信号平均荧光强度值的标准化以肿瘤区域ROI荧光强度/背景区域ROI荧光强度来计算。对于探针离体生物学分布研究，基于体内成像的最佳时间，在尾静脉注射200μl NIR-PD-L1-mAb后5天对小鼠实施安乐死。取肿瘤和选定的组织器官并称重。如上所述，测量每个器官的平均荧光强度。收集小鼠脑、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胃、小肠、大肠、胰腺、肌肉、脂肪、膀胱、骨骼和肿瘤组织。采用Pearl Impulse光学成像测定各脏器的荧光强度，勾画各个脏器感兴趣区(Regions of interests，ROIs)，对各脏器的平均荧光强度进行定量检测，比较各脏器NIR-PD-L1-mAb荧光分布差异。
实施例3
1、荷瘤模型鼠的准备
1)模型数量20只；6-8周龄；
2)涉及细胞种类(HCT8，SW480，SW620)；
3)每只鼠分别在腋下和腹股沟区种2种细胞的皮下瘤，具体示意图如图2(具体以实际种植位置为准)：
4)注射细胞数量及细胞浓度：每种皮下瘤细胞数量为5×106；注射体积为0.1～0.2ml；细胞浓度2.5～5×107/ml。
5)当荷瘤体积达到8-10mm3时进行成像。
2、Anti-PD-1抗体的光学标记步骤：
1)抗体来源
①Anti-PD-1抗体,小鼠单克隆抗体；Abcam公司，货号：ab52587；
②规格：100μg，浓度1.0mg/ml；
③溶液存储形式：保存于含0.02％叠氮化钠的PBS溶液中。
2)近红外荧光染料来源
①德国LI-COR公司，IRDye 800CW-NHS Ester；分子数：1166.20；CAS number：956579-01-4；化学分子式：C50H57N3O17S4.3Na；
②染料规格：0.5mg货号：P/N 929-70020；
③保存形式：粉末，-20°避光保存。本实验用DMSO配制成25mg/ml的工作储备液；
④消光系数240000，最大吸收波长774nm，最大发射波长789nm。
3)Anti-PD-1抗体纯化
①用0.2M Na2HPO4与0.2M NaH2PO4配制50mmol/L PB溶液200ml，PH8.5；
②用上述buffer将一根新的PD-10柱平衡5个床体积；
③抗体浓度的测定：取1支100μL，100μg的Anti-PD-1抗体用紫外分光光度计测量OD280nm和OD260nm。OD260nm＝0.8327；OD280nm＝1.2951；计算抗体浓度为1.2617mg/ml；
④将此100μL的抗PD-1抗体全部上PD-1柱纯化，去除叠氮化钠等。用50mmol PB溶液洗脱，收集蛋白峰管选蛋白峰管测定OD260nm、OD280nm值；
⑤合并蛋白峰管后冷冻干燥。
4)Anti-PD-1抗体的光学标记
①将冻干的Anti-PD-1抗体加入90μL 50mm PB溶液溶解，PH8.5；加入12μl IRDye800CW混匀。25°水浴反应2h，期间不间断摇晃；
②将上述反应溶液上入已用20mmPBS溶液平衡好的PD-10柱，并用此buffer洗脱。分管收集，每管10滴，取蛋白峰管、峰后管及小分子IRDye 800CW峰管。测定OD280nm和OD780nm。将三管蛋白峰管合并后再次测量A280nm和A780nm。冷冻干燥。
3、光学显像结果见图3-8。
实验结论，通过上述实验结果分析可知：
①NIR-PD-L1-mAb肿瘤光学显像中PD-L1表达情况
我们发现，结直肠癌细胞SW620、SW480、HCT8移植瘤模型给药后不同时间(24h、48h、72h、120h)侧卧位光学显像图。随着时间的延长，NIR-PD-L1-mAb肿瘤光学显像越来越清晰，120h显像效果最好。三种模型PD-L1表达水平由高到低分别为：SW620＞SW480＞HCT8(图2)。
②SW620模型鼠体内脏器NIR-PD-L1-mAb分布情况不同于SW480或HCT8模型鼠体内脏器NIR-PD-L1-mAb分布
图3显示了在注射NIR-PD-L1-mAb 120小时后人类大肠癌荷瘤小鼠模型解剖组织的图像。我们发现，与SW480或HCT8荷瘤小鼠的肿瘤相比，SW620荷瘤小鼠肿瘤在120小时的荧光信号强度最高。SW620荷瘤小鼠模型在肿瘤组织中观察到最高的荧光强度(5.05±0.36)，其次是脾脏(4.17±0.18)和肝脏(3.93±0.13))。但是，SW480和HCT8荷瘤小鼠中，在脾脏中检测到最高荧光信号(分别为3.96±0.12和4.01±0.07)，其次是肝脏(分别为3.81±0.05和3.89±0.13)和肿瘤组织(分别为3.70±0.10和2.99±0.05))。
我们的研究表明，NIR-PD-L1-mAb与CRC细胞表面的PD-L1结合具有特异性，这是由其在CRC荷瘤小鼠模型中检测各种水平的PD-L1表达的能力所证明的。我们的体内成像方法在带有SW620 CRC细胞的小鼠中检测到荷瘤小鼠肿瘤的最高荧光信号，随后是SW480和HCT8细胞接种的肿瘤。SW620细胞比其他两个细胞系更具侵略性，并表达更高水平的PD-L1蛋白，因为它们来自结直肠腺癌的转移性淋巴结，而SW480和HCT8细胞系来自原位结直肠癌。我们的发现表明，NIR-PD-L1-mAb可以特异性地检测PD-L1表达，并可能检测异质性。还可以指导人类CRC肿瘤细胞的PD-L1表达，以指导PD-1/PD-L1靶向的免疫疗法。它们还支持将来使用PD-L1靶向的分子显像剂结合其他生物标记物的工作，以更好地指导针对CRC患者的PD-1/PD-L1靶向治疗策略，针对性的个性化免疫疗法以及对抗PD-L1治疗的反应。

Claims (9)

1.一种分子探针，其特征在于，该探针为NIR-PD-L1-mAb，所述的NIR-PD-L1-mAb化学结构式为
Figure FDA0002361425200000011
2.一种分子探针的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
a、纯化抗PD-L1单克隆抗体得到PD-L1 mAb；
b、将近红外光学染料加入DMSO溶液，配制成浓度为5mg/ml的溶液；
c、取1～10mg/ml的PD-L1 mAb放入离心管中，加入0.2mol/L～1.0mol/L的缓冲液混匀，PD-L1 mAb与缓冲液的体积比为1:1，混匀后加入步骤b所得溶液，立即混匀，将混合液放入20～25℃水浴避光反应2小时；
d、用PD-10柱纯化，合并蛋白峰管。
3.根据权利要求2所述的一种分子探针的制备方法，其特征在于，所述缓冲液为硼酸盐缓冲液或磷酸盐缓冲液。
4.根据权利要求2所述的一种分子探针的制备方法，其特征在于，所述缓冲液PH值为8.3～8.9。
5.根据权利要求2所述的一种分子探针的制备方法，其特征在于，所述近红外荧光染料为
Figure FDA0002361425200000012
800CW NHS Ester。
6.根据权利要求2所述的一种分子探针的制备方法，其特征在于，所述PD-L1 mAb与
Figure FDA0002361425200000021
800CW NHS Ester的摩尔比为1:1.1～1:3。
7.根据权利要求2所述的一种分子探针的制备方法，其特征在于，所述步骤a中纯化的具体步骤为：
1)用Na2HPO4与M NaH2PO4配制50mmol/L的磷酸盐缓冲液，Na2HPO4与NaH2PO4的摩尔比为1:1，PH为8.5；
2)用上述缓冲液将一根新的PD-10柱平衡；
3)抗体浓度的测定：取Anti-PD-1抗体用紫外分光光度计测量OD280nm和OD260nm，计算抗体浓度；
4)将步骤3的抗PD-1抗体全部上PD-1柱纯化，去除叠氮化钠，用磷酸盐缓冲液洗脱，收集蛋白峰管；
5)合并蛋白峰管后冷冻干燥。
8.基于权利要求1所述的一种分子探针的应用，其特征在于，所述应用为一种分子探针在制备一种用于检测结直肠癌细胞中PD-L1的表达水平的显影剂中的应用。
9.基于权利要求1所述的一种分子探针的应用，其特征在于，所述应用为一种分子探针在用于检测结直肠癌细胞中PD-L1的表达水平的试剂盒中的应用。
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