CN104220597A

CN104220597A - 使用了嵌入剂的变异基因的识别检测方法

Info

Publication number: CN104220597A
Application number: CN201380015360.2A
Authority: CN
Inventors: 松隈章一; 石川友一; 黑泽龙雄
Original assignee: Wako Pure Chemical Industries Ltd; Kanagawa Prefectural Hospital Organization
Current assignee: Fujifilm Wako Pure Chemical Corp; Kanagawa Prefectural Hospital Organization
Priority date: 2012-03-22
Filing date: 2013-03-22
Publication date: 2014-12-17
Also published as: JPWO2013141332A1; EP2840137A1; AU2013236175A1; WO2013141332A1; JP6082730B2; US9932625B2; EP2840137B1; US20150050749A1; EP2840137A4

Abstract

本发明的课题在于提高利用LH法得到的变异型DNA与探针的杂交体或/和野生型DNA与探针的杂交体的分离中的分离能力。本发明涉及“一种变异型DNA或/和野生型DNA的检测方法，其包括以下工序：(1)使具有置换碱基、缺损碱基区域、或者插入碱基区域的单链DNA(变异型DNA)中的至少1种或/和与其对应的野生型单链DNA(野生型DNA)与和两单链DNA杂交的探针接触，形成与变异型DNA的杂交体(变异型杂交体)或/和与野生型DNA的杂交体(野生型杂交体)的工序(其中，变异型杂交体和野生型杂交体中的至少1种具有环结构)；(2)使所得到的变异型杂交体或/和野生型杂交体与嵌入剂接触的工序；和(3)对变异型杂交体与嵌入剂的结合体或/和野生型杂交体与嵌入剂的结合体进行分离，从而检测变异型DNA或/和野生型DNA的有无的工序”。

Description

使用了嵌入剂的变异基因的识别检测方法

技术领域

本发明涉及使用了嵌入剂的基于环杂交法的变异型DNA或野生型DNA的高精度检测方法。

背景技术

近年来，在各种领域中逐渐重视特定基因中的变异的有无。例如，在法医学中的DNA鉴定中，作为个体识别的方法，对由于DNA中的变异或多态性所致的单碱基置换的有无进行确认的做法是众所周知的。另外，在医学领域中还已知在特定的基因多态性与药物敏感性之间具有相关关系，通过调查特定的基因多态性，实现了药害风险的降低。另外，还被用于遗传性疾病的变异型DNA持有者的检测等，基因变异的检测比以前更加重要。

另外，作为基因变异的检测法，已知下述环杂交法(LH法)：其在DNA片段的PCR反应后的反应液中添加单链低聚DNA而与目标DNA片段杂交，根据所得到的杂交体的结构差异用电泳法分离，并根据需要使嵌入剂反应，判断所分离的变异基因(专利文献1、非专利文献1)。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开2007-61080

非专利文献

非专利文献1：Clinica Chimica Acta,412,1688-1672

发明内容

发明要解决的课题

上述LH法是变异型DNA的检测中有用的方法，但具有难以分离检测碱基数相同的序列的变异型DNA和野生型DNA、或碱基数相同的序列的变异型DNA彼此的问题。因此，本发明的课题在于提高利用LH法得到的变异型DNA与探针的杂交体或/和野生型DNA与探针的杂交体的分离能力。

用于解决课题的方案

鉴于上述状況，本发明人进行了深入研究，结果意外地发现：若使由LH法得到的杂交体与嵌入剂接触并用电泳进行分离，即用电泳对杂交体与嵌入剂的结合体进行分离，则分离能力提高，能够分离检测碱基数相同的序列的变异型DNA和野生型DNA、或碱基数相同的序列的变异型DNA彼此，由此完成了本发明。即，本发明涉及：

“一种变异型DNA或/和野生型DNA的检测方法，其特征在于包括以下的工序(1)～(3)：

(1)使具有置换碱基、缺损碱基区域、或者插入碱基区域的单链DNA(变异型DNA)中的至少1种或/和与其对应的野生型单链DNA(野生型DNA)与和两单链DNA杂交的探针接触，形成与变异型DNA的杂交体(变异型杂交体)或/和与野生型DNA的杂交体(野生型杂交体)的工序(其中，变异型杂交体和野生型杂交体中的至少1种具有环结构)；

(2)使所得到的变异型杂交体或/和野生型杂交体与嵌入剂接触的工序；

(3)对变异型杂交体与嵌入剂的结合体或/和野生型杂交体与嵌入剂的结合体进行分离，从而检测变异型DNA或/和野生型DNA的工序”。

发明的效果

根据本发明的检测方法，由于变异型杂交体与野生型杂交体、或者变异型杂交体彼此的分离能力高，因而即使在变异型DNA与野生型DNA为相同碱基数的情况下，而且即使变异型DNA有复数个且其变异型DNA为相同碱基数的情况下也能够分离识别，其结果，即便是具有各种多态性的变异型DNA，也能够检测变异型DNA和野生型DNA。特别是，在使用电泳法的情况下可显著表现出上述效果。

附图说明

图1是在实施例1中使利用EGFR基因中的野生型DNA(N)和变异型DNA(G1～G5)得到的环杂交反应产物(LH反应产物)在嵌入剂的共存下用微芯片电泳进行分离分析的结果。

图2是在比较例1中使利用EGFR基因中的野生型DNA(N)和变异型DNA(G1～G5)得到的Cy5标记LH反应产物在嵌入剂的非共存下用微芯片电泳进行分离分析的结果。

图3是在比较例2中使EGFR基因中的野生型DNA(N)和变异型DNA(G1～G5)在嵌入剂的共存下用微芯片电泳进行分离分析的结果。

图4是在比较例3中使利用EGFR基因中的野生型DNA(N)和变异型DNA(G1～G5)得到的LH反应产物用凝胶电泳泳动后，添加嵌入剂所测定的分离分析结果。

图5是在比较例4中使利用EGFR基因中的野生型DNA(N)和变异型DNA(G1～G5)得到的Cy5标记LH反应产物在嵌入剂的非共存下用凝胶电泳进行分离分析的结果。

图6是在实施例2中使利用KRAS基因中的野生型DNA(WT)和变异型DNA(G12W)得到的LH反应产物在嵌入剂的共存下用微芯片电泳进行分离分析的结果。

图7是在比较例5中使利用KRAS基因中的野生型DNA(WT)和变异型DNA(G12W)得到的LH反应产物在嵌入剂的非共存下用微芯片电泳进行分离分析的结果。

图8是在实施例3和比较例6中使利用IDH1中的野生型DNA和变异型DNA得到的LH反应产物在嵌入剂的共存下和非共存下用凝胶电泳进行分离分析的结果。

图9是在实施例4中使利用IDH1中的野生型DNA和变异型DNA得到的LH反应产物在嵌入剂的共存下用微芯片电泳进行分离分析的结果。

图10是在比较例7中使利用IDH1中的野生型DNA和变异型DNA得到的LH反应产物在嵌入剂的非共存下用微芯片电泳进行分离分析的结果。

图11是在实施例5和比较例8中使利用ALDH2基因中的野生型DNA和变异型DNA得到的LH反应产物在嵌入剂的共存下或非共存下用凝胶电泳进行分离分析的结果。

图12是在实施例6和比较例9中使利用ALDH2基因中的野生型DNA和变异型DNA得到的LH反应产物在嵌入剂的共存下或非共存下用微芯片电泳进行分离分析的结果。

图13是在实施例7中将向利用EGFR基因中的野生型DNA(N)和变异型DNA(G1～G5)得到的LH反应产物中添加嵌入剂所得到的物质作为试样，用凝胶电泳进行分离分析的结果。

具体实施方式

[本发明的变异型DNA·野生型DNA]

本发明的变异型DNA只要具有置换碱基、缺损碱基区域、或插入碱基区域(下文中有时将它们统称简记为变异碱基区域)，且至少这些变异碱基区域的前后5～150碱基为已知的单链DNA则可以使用任意的DNA。需要说明的是，本发明的变异型DNA还包括单碱基置换DNA或微卫星区域的重复碱基数不同的DNA等多态性DNA。作为这样的DNA，为由动物、微生物、细菌、植物等生物分离的基因组DNA片段、能够由病毒分离的DNA片段、和以mRNA为模板所合成的cDNA片段等。在这样的变异型DNA中，可以举出来自人细胞的癌基因作为优选的变异型DNA。另外，形成杂交体的变异型DNA的链长通常为20～2000碱基、优选为100～500碱基。

关于上述变异碱基区域，置换碱基表示在变异为置换变异的情况下野生型DNA的正常碱基通过变异而发生了置换的置换碱基，缺损碱基区域表示在变异为缺损变异的情况下野生型DNA的正常碱基通过变异而发生了缺损的碱基部分，插入碱基区域表示在变异为插入变异的情况下通过变异而插入野生型DNA中的碱基部分。需要说明的是，上述缺损碱基区域和插入碱基区域通常为1～200碱基。另外，与本发明的变异型DNA和野生型DNA杂交的探针由于将特定的变异碱基区域作为检测对象而形成本发明的环结构，因此除了作为检测对象的变异碱基区域以外，置换碱基、缺损碱基区域或插入碱基区域也可以存在于本发明的变异型DNA中。

关于本发明的野生型DNA，除了变异碱基区域外与本发明的变异型DNA的碱基序列是相同的，其长度与变异型DNA相同程度，通常为20～2000碱基、优选为100～500碱基。

将与上述变异型DNA的变异部分对应的野生型DNA的正常碱基部分称为正常碱基区域。在变异为置换变异的情况下，相对于通过变异而发生了置换的置换碱基的野生型DNA的正常碱基(变异前的碱基)为正常碱基区域(正常碱基)，在变异为缺损变异的情况下，相对于通过变异而发生了缺损的碱基部分的野生型DNA的正常碱基部分(通过变异而发生缺损的碱基部分)为正常碱基区域，在变异为插入变异的情况下，相对于通过变异而发生了插入的碱基部分的野生型DNA的正常碱基部分为正常碱基区域。下面，示出关于变异碱基区域和正常碱基区域的示意图。

对于上述本发明的变异型DNA和野生型DNA(下文中有时将它们一并简记为本发明的DNA)，优选尽可能纯化，除去核酸片段以外的多余成分。具体来说，优选根据例如使用二氧化硅载体的Boom法(Boom et al.J.Clin.Microbiol.28:495-503(1990))、使用碘化钠溶液的方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76-2,p615-619(1979))等常规方法进行纯化。另外，也可以使用通过本身公知的聚合酶链反应(PCR反应)、例如Nucleic Acids Research,1991,Vol.19,3749、BioTechniques,1994,Vol.16,1134-1137中记载的方法将目标DNA扩增而成的物质。

本发明的DNA形成双链的情况下，利用通常该领域中进行的加热处理(90℃～100℃)或碱处理(基于氢氧化钠等的处理)等将双链DNA单链化而得到本发明的DNA即可。

[本发明的探针]

本发明的探针与上述本发明的变异型DNA和与其对应的本发明的野生型DNA杂交，形成变异型杂交体和野生型杂交体，所形成的变异型杂交体或野生型杂交体中的至少一种形成环结构。另外，在所形成的复数个的杂交体形成环结构的情况下，这些环结构也为不同的结构。需要说明的是，在本发明的探针由与变异型DNA或野生型DNA完全互补的碱基序列构成的情况下，所得到的杂交体不形成环结构。这样的本发明的探针通常为10～2000碱基、优选为10～300碱基、更优选为10～150碱基。需要说明的是，在探针侧形成环结构的情况下，可以任意地制作其碱基序列，因此优选在杂交体形成时形成环结构的序列不包含与本发明的DNA互补的序列，以使其不与本发明的DNA结合。

关于本发明的探针的具体例，与杂交体的具体例一并在下文中说明，例如所检测的DNA为具有置换碱基的变异型DNA、且在探针侧制作环结构的情况下，例如如下图那样设计探针即可。在下图所示的情况下，将与野生型DNA置换碱基相当的正常碱基作为中心并分成A部、B部，按照在该A部、B部的互补链(A’和B’)与其之间插入形成环结构的序列的方式来设计探针。需要说明的是，图中的M表示置换碱基，N表示与置换碱基对应的正常碱基。另外，A'部和B'部分别表示与A部、B部互补的碱基区域。

通过如此进行设计，例如在形成野生型杂交体时，形成如所设计的那样的环结构，另一方面，在变异型杂交体中置换碱基不和与探针中的正常碱基互补的碱基结合，因此认为形成包含与正常碱基互补的1个碱基的环结构，其结果，与野生型的环结构不同。

[本发明的杂交体]

本发明的杂交体是通过上述本发明的探针与本发明的野生型DNA或变异型DNA杂交而形成的，其任一种具有环结构。另外，在野生型杂交体和变异型杂交体中的复数个具有环结构的情况下，其环结构不同。即，无论是野生型杂交体与变异型杂交体，还是变异型杂交体彼此，其环结构分别不同。因此，在本发明的检测方法中，能够以良好的精度将该结构的差异和通过嵌入剂在双链碱基部分结合所产生的差异分离。

具有环结构的本发明的杂交体由2处双链碱基部分和被它们夹持的(存在于它们之间的)单链碱基部分的环结构构成。需要说明的是，该杂交体可以具有突出末端，但由于有可能会对分离造成影响，因此优选不具有突出末端。另外，在被2处双链碱基部分夹持的部位，具有环结构的碱基链的相反侧的链可以具有不与环结构互补的单链碱基部分。另外，该杂交体也可以在具有环结构的碱基序列的相反侧进一步形成其他环结构，在杂交体的两侧具有环结构。此外，所使用的探针为与野生型DNA或变异型DNA的一种碱基序列互补的碱基序列(与野生型DNA或一种变异型DNA的碱基序列的全部或一部分100％一致的碱基序列)的情况下，所形成的杂交体不具有环结构，因此杂交体是仅具有双链碱基的杂交体或具有双链碱基和突出末端的杂交体。

上述本发明的杂交体中的环结构由不与探针或基因组DNA杂交(不形成碱基对)的单链碱基链构成，在杂交体中形成环状的二次结构(立体结构)。该环结构通常由3～300碱基、优选由5～100碱基构成。

本发明的环结构可以具有茎。该茎表示上述单链碱基链由其自身形成双链的结构(双链碱基或双链碱基链部分)。

该茎是碱基对至少连续1碱基对以上、优选2碱基对以上、更优选3碱基对以上的茎。本发明的环结构可以仅由茎构成。即，作为具有茎的环结构，可以举出仅由茎构成的环结构、在环结构中的末端存在茎的环结构、在环结构中的前端存在茎的环结构、在环结构中的中间存在茎的环结构、它们的组合等。下面分别示于其示意图。需要说明的是，实线部分表示茎结构，虚线部分表示基因组DNA与探针形成的双链碱基链。另外，环结构中的平行部分表示茎。

从分离性能的方面出发，优选环结构具有上述茎。

上述杂交体中的2处双链碱基部分各自独立地由通常5～1000碱基对、优选由10～500碱基对、更优选由10～100碱基对构成。

在杂交体的基因组DNA侧和探针侧的两侧形成环结构的情况下，若一个环结构位于能够识别变异碱基的部位(存在于变异碱基区域的部位)，则另一个环结构可以为任意位置。该环结构通常由3～300碱基、优选由5～100碱基构成。

作为在上述杂交体的两侧具有环结构的杂交体，若按照识别变异碱基(区域)的方式(存在于变异碱基区域的方式)来设定任一个环结构，则另一个环结构在任意位置以任意大小形成即可。

上述探针以及上述杂交体根据变异型DNA的种类(具有所述置换碱基、缺损碱基区域、或插入碱基区域的单链DNA)、是否与变异碱基区域杂交或者是否与对应于变异碱基区域的正常碱基或正常碱基区域杂交来适宜设计并合成即可，关于具体的探针的示例，如下分情况分别说明。需要说明的是，在分离具有微卫星区域的DNA的情况下，可以使用例如日本特愿2012-65232号中记载的探针或杂交体。

(I)变异型DNA为具有置换碱基的DNA的情况

(I-1)形成在探针侧具有环结构的杂交体的情况

(I-2)形成在基因组DNA侧具有环结构的杂交体的情况

(II)变异型DNA为具有缺损碱基区域的DNA的情况

(II-1)形成在探针侧具有环结构的杂交体的情况

(II-2)形成在基因组DNA侧具有环结构的杂交体的情况

(III)变异型DNA为具有插入碱基区域的DNA的情况

(III-1)形成在基因组DNA侧具有环结构的杂交体的情况

(III-2)形成在探针侧具有环结构的杂交体的情况

(IV)在具有环结构的碱基链的相反侧的链中进一步形成环结构的情况

[本发明的探针和杂交体的具体例]

(I)变异型DNA为具有置换碱基的DNA的情况

(I-1)形成在探针侧具有环结构的杂交体的情况

作为本情况中的本发明的探针，在与野生型基因组DNA杂交时，使用形成野生型杂交体的探针即可，该野生型杂交体(1)具有从野生型基因组DNA的正常碱基(N)起向着一端(A方向)延伸的双链碱基部分、和从该正常碱基(N)起向着与A方向相反的方向(B方向)以相邻1～10碱基的碱基(X)起始向着该B方向延伸的双链碱基部分，并且(2)在正常碱基(N)的互补碱基与从该正常碱基(N)相邻1～10碱基的碱基(X)的互补碱基之间在探针侧具有单链碱基部分的环结构(C)；另一方面，在与变异型基因组DNA杂交时，使用形成变异型杂交体的探针即可，该变异型杂交体(1)具有不与变异型基因组DNA的置换碱基(M)形成碱基对而从该置换碱基(M)的相邻的碱基起向着一端(A方向)延伸的双链碱基部分、和在与A方向相反的方向(B方向)从置换碱基(M)的相邻1～10碱基的碱基(X)起始向着该B方向延伸的双链碱基部分，并且(2)在置换碱基(M)的A方向相邻的碱基(X’)的互补碱基与在B方向相邻1～10碱基的碱基的互补碱基(X)之间在探针侧具有单链碱基部分的环结构(C’)。该情况下，在野生型杂交体和变异型杂交体的两者形成环结构(C、C’)，但探针不与置换碱基(M)结合，因此变异型杂交体中的环结构(C’)比野生型杂交体的环结构(C)长1碱基。需要说明的是，上述相邻1～10碱基的碱基(X)为相邻2～10碱基的碱基的情况下，杂交体在两个双链碱基部分之间的基因组DNA侧、即环结构的相反侧具有不与环结构互补的单链碱基部分。下面，记载上述相邻1～10碱基的碱基(X)为相邻1碱基时的示意图。需要说明的是，N表示正常碱基，M表示置换碱基，X表示正常碱基或置换碱基的相邻的碱基(5’端侧或3’端侧的相邻的碱基)，X’表示置换碱基的相邻的碱基(与X在相反方向相邻的碱基)。

作为这样的探针，具体来说，可以举出将从野生型DNA中的正常碱基起向着5’端方向通常5～1000碱基、优选5～150碱基的碱基序列的互补链；形成环结构的通常3～300碱基、优选5～100碱基的碱基序列；从野生型DNA中的正常碱基的3’端方向相邻1～10碱基的碱基起始向着3’端方向通常5～1000碱基、优选5～150碱基的碱基序列的互补链依次连结而成的探针；或者将从野生型DNA中的正常碱基起向着3’端方向通常5～1000碱基、优选5～150碱基的碱基序列的互补链；形成环结构的通常3～300碱基、优选5～100碱基的碱基序列；从野生型DNA中的正常碱基的5’端方向相邻1～10碱基的碱基起始向着5’端方向通常5～1000碱基、优选5～150碱基的碱基序列的互补链依次连结而成的探针；等等。

另外，作为本情况中的本发明的探针，在与变异型基因组DNA杂交时，使用形成变异型杂交体的探针即可，该变异型杂交体(1)具有从变异型基因组DNA的置换碱基(M)起向着一端(A方向)延伸的双链碱基部分、和从该置换碱基(M)起向着与A方向相反的方向(B方向)以相邻1～10碱基的碱基(X)起始向着该B方向延伸的双链碱基部分，并且(2)在置换碱基(M)的互补碱基与该置换碱基(M)相邻1～10碱基的碱基(X)的互补碱基之间在探针侧具有单链碱基部分的环结构(C’)；另一方面，在与野生型基因组DNA杂交时，使用形成正常型杂交体的探针即可，该正常型杂交体(1)具有不与野生型基因组DNA的正常碱基形成碱基对而从该正常碱基的相邻的碱基(X’)起向着一端(A方向)延伸的双链碱基部分、和在与A方向相反的方向(B方向)从正常碱基(N)相邻1～10碱基的碱基(X)起始向着该B方向延伸的双链碱基部分，并且(2)在正常碱基(N)的A方向相邻的碱基(X’)的互补碱基与在B方向相邻1～10碱基的碱基(X)的互补碱基之间在探针上具有单链碱基部分的环结构(C)。该情况下，在野生型杂交体和变异型杂交体的两者形成环结构(C、C’)，但野生型杂交体的环结构(C)比变异型杂交体中的环结构(C’)长1碱基。需要说明的是，上述相邻1～10碱基的碱基(X)为相邻2～10碱基的碱基的情况下，杂交体在两个双链碱基部分之间的基因组DNA侧、即环结构的相反侧具有不与环结构互补的单链碱基部分。下面，记载上述相邻1～10碱基的碱基(X)为相邻1碱基时的示意图。需要说明的是，N表示正常碱基，M表示置换碱基，X表示正常碱基或置换碱基的相邻的碱基(5’端侧或3’端侧的相邻的碱基)，X’表示正常碱基的相邻的碱基(与X在相反方向相邻的碱基)。

作为这样的探针，具体来说，可以举出将从变异型DNA的置换碱基起向着5’端方向通常5～1000碱基、优选5～150碱基的碱基序列的互补链；形成环结构的通常3～300碱基、优选5～100碱基的碱基序列；从变异型DNA中的置换碱基的3’端方向相邻1～10碱基的碱基起始向着3’端方向通常5～1000碱基、优选5～150碱基的碱基序列的互补链依次连结而成的探针；或者将从变异型DNA的置换碱基起向着3’端方向通常5～1000碱基、优选5～150碱基的碱基序列的互补链；形成环结构的通常3～300碱基、优选5～100碱基的碱基序列；从变异型DNA中的置换碱基的5’端方向相邻1～10碱基的碱基起始向着5’端方向通常5～1000碱基、优选5～150碱基的碱基序列的互补链依次连结而成的探针；等等。

(I-2)形成在基因组DNA侧具有环结构的杂交体的情况

作为本情况中的本发明的探针，在与野生型基因组DNA杂交时，使用形成野生型杂交体的探针即可，该野生型杂交体具有从野生型基因组DNA的正常碱基(N)起向着一端(A方向)延伸的双链碱基部分、和包含从该正常碱基(N)的互补碱基(n)起向着与A方向相反的方向(B方向)相邻的碱基(X)的双链碱基部分，并且在基因组DNA上具有以正常碱基(N)的相邻的碱基为末端的单链碱基部分的环结构(C)；另一方面，在与变异型基因组DNA杂交时，使用形成变异型杂交体的探针即可，该变异型杂交体具有不与变异型基因组DNA的置换碱基(M)形成碱基对而从该置换碱基(M)的相邻的碱基(Y)起向着一端(A方向)延伸的双链碱基部分、和从所述置换碱基的相邻的碱基(Y)的互补碱基(y)起向着与A方向相反的方向(B方向)以相邻2碱基的碱基(X)起始向着B方向延伸的双链碱基部分，并且在基因组DNA上具有以置换碱基(M)为末端的单链碱基部分的环结构(C’)。该情况下，在野生型杂交体和变异型杂交体的两者形成环结构(C、C’)，但探针不与置换碱基(M)结合，因此变异型杂交体中的环结构(C’)比野生型杂交体的环结构(C)长1碱基。下面记载其示意图。需要说明的是，N表示正常碱基，M表示置换碱基。

作为这样的探针，具体来说，可以举出将从野生型DNA的正常碱基起向着5’端方向通常5～1000碱基、优选5～150碱基的碱基序列的互补链；从野生型DNA中的正常碱基的3’端方向的相邻4～300碱基、优选6～100碱基的碱基起向着3’端方向通常5～1000碱基、优选5～150碱基的碱基序列的互补链依次连结而成的探针；或者将从野生型DNA的正常碱基起向着3’端方向通常5～1000碱基、优选5～150碱基的碱基序列的互补链；从野生型DNA中的正常碱基的5’端方向的相邻通常4～300碱基、优选6～100碱基的碱基起向着5’端方向通常5～1000碱基、优选5～150碱基的碱基序列的互补链依次连结而成的探针；等等。

另外，作为本情况中的本发明的探针，在与野生型基因组DNA杂交时，使用形成野生型杂交体的探针即可，该野生型杂交体具有不与野生型基因组DNA的正常碱基(N)形成碱基对而从该正常碱基(N)的相邻的碱基(Y)起向着一端(A方向)延伸的双链碱基部分、和包含从所述正常碱基(N)的相邻的碱基(Y)的互补碱基(y)起向着与A方向相反的方向(B方向)相邻2碱基的碱基(X)的双链碱基部分，并且在基因组DNA上具有以正常碱基(N)为末端的单链碱基部分的环结构(C)；另一方面，在与变异型基因组DNA杂交时，使用形成变异型杂交体的探针即可，该变异型杂交体具有从变异型基因组DNA的置换碱基(M)起向着一端(A方向)延伸的双链碱基部分、和从该置换碱基的互补碱基(m)的相邻的碱基(X)起向着与A方向相反的方向(B方向)延伸的双链碱基部分，并且在基因组DNA上具有以置换碱基的相邻的碱基为末端的单链碱基部分的环结构(C’)。该情况下，在野生型杂交体和变异型杂交体的两者形成环结构(C、C’)，但探针不与正常碱基结合，因此野生型杂交体中的环结构(C)比变异型杂交体的环结构(C’)长1碱基。下面记载其示意图。需要说明的是，N表示正常碱基，M表示置换碱基。

作为这样的探针，具体来说，可以举出将从野生型DNA中的正常碱基起向着5’端方向通常5～1000碱基、优选5～150碱基的碱基序列的互补链；从野生型DNA中的正常碱基的3’端方向的相邻通常4～300碱基、优选6～100碱基的碱基起向着3’端方向通常5～1000碱基、优选5～150碱基的碱基序列的互补链依次连结而成的探针；或者将从野生型DNA中的正常碱基起向着3’端方向通常5～1000碱基、优选5～150碱基的碱基序列的互补链；从野生型DNA中的正常碱基的5’端方向的相邻通常4～300碱基、优选6～100碱基的碱基起向着5’端方向通常5～1000碱基、优选5～150碱基的碱基序列的互补链依次连结而成的探针；等等。

(II)变异型DNA为具有缺损碱基区域的DNA的情况

(II-1)形成在探针侧具有环结构的杂交体的情况

作为本情况中的本发明的探针，使用下述探针即可：(a)形成不具有环结构的野生型杂交体、形成具有环结构的变异型杂交体的探针；或者(b)形成在探针上具有环结构的野生型杂交体和在探针上具有环结构的变异型杂交体、且两者的环结构为不同结构的探针。

作为上述(a)的探针，使用由与野生型DNA的碱基序列全部互补的碱基序列或与包含野生型DNA的正常碱基的一部分碱基序列互补的碱基序列(与碱基序列的全部或一部分100％互补的碱基序列)构成的探针即可。在使用这样的探针时，野生型杂交体不形成环结构，变异型杂交体中与缺损碱基区域互补的碱基序列在探针上形成环结构。下面记载其示意图。需要说明的是，图中NNN表示正常碱基区域，虚线表示正常碱基区域的互补链。

作为这样的探针，具体来说，可以举出将野生型DNA的缺损碱基区域和其两旁的各5～1000碱基、优选5～150碱基连结而成的碱基序列的互补链等。换言之，可以举出作为与野生型DNA互补的序列的、由缺损碱基区域与其两旁的各5～1000碱基、优选5～150碱基的碱基序列构成的序列的互补碱基序列。

作为上述(b)的探针，使用在与上述(a)的探针的正常碱基区域互补的碱基序列中或该碱基序列的旁边插入了不与野生型DNA和变异型DNA杂交的碱基序列而成的探针即可。在使用这样的探针时，对于野生型杂交体，上述插入的不与野生型DNA和变异型DNA杂交的碱基序列在探针上形成环结构，变异型杂交体利用与正常碱基区域互补的碱基序列和上述插入的不与野生型DNA和变异型DNA杂交的碱基序列在探针上形成环结构。即，野生型杂交体的环结构与变异型杂交体的环结构的结构是不同的。下面记载其示意图。需要说明的是，图中的NNN表示正常碱基区域，虚线表示正常碱基区域的互补链，双线表示在探针上任意插入的碱基链。

作为这样的探针，具体来说，可以举出将在野生型DNA的正常碱基区域中、或者该正常碱基区域的3’端的相邻位置或5’端的相邻位置的任一任意位置插入有通常1～300碱基、优选5～100碱基的碱基序列的正常碱基区域和其两旁的各5～1000碱基、优选5～150碱基连结而成的碱基序列的互补链等。需要说明的是，上述插入的碱基序列为1～2碱基的情况下，野生型杂交体无法形成环结构，但该情况也包含于(b)的探针中。另外，上述插入的碱基序列只要其总碱基数在上述范围内，则也可以分开插入在上述位置中两个以上的位置。

(II-2)形成在基因组DNA侧具有环结构的杂交体的情况

作为本情况中的本发明的探针，使用下述探针即可：(a)形成不具有环结构的变异型杂交体、形成具有环结构的野生型杂交体的探针；或者(b)形成在基因组上具有环结构的变异型杂交体和在基因组上具有环结构的野生型杂交体、且两者的环结构为不同结构的探针。

作为上述(a)的探针，使用由与变异型DNA的碱基序列全部或一部分互补的碱基序列(与碱基序列的全部或一部分100％互补的碱基序列)构成的探针即可。换言之，使用野生型DNA中的、通过变异而发生缺损的正常碱基区域以外的碱基序列和全部或包含正常碱基区域的两旁的碱基序列的一部分碱基序列的互补碱基序列所构成的探针即可。在使用这样的探针时，对于野生型杂交体，在其基因组DNA上正常碱基区域形成环结构，变异型杂交体不形成环结构。下面记载其示意图。需要说明的是，图中N表示正常碱基区域。

作为这样的探针，具体来说，可以举出将变异型DNA的缺损碱基区域的两旁的各5～1000碱基、优选5～150碱基连结而成的碱基序列的互补链等。换言之，可以举出作为与变异型DNA互补的序列的、从与缺损碱基区域对应的部位起向着两方向各5～1000碱基、优选5～150碱基的碱基序列的互补碱基序列。

作为上述(b)的探针，使用从上述(a)的探针中以正常碱基区域的相邻碱基的互补碱基为基点、除去了用于在变异型杂交体中构成环的碱基序列后的探针即可。在使用这样的探针时，野生型杂交体在基因组DNA上利用上述除去的碱基序列和正常碱基区域形成环结构，变异型杂交体中上述除去的碱基序列形成环结构。即，野生型杂交体的环结构与变异型杂交体的环结构的结构是不同的。下面记载其示意图。需要说明的是，图中的虚线表示与缺损碱基区域对应的正常碱基区域，双线表示在探针设定时从基因组DNA的互补序列中任意除去的碱基链。

作为这样的探针，具体来说，可以举出将在野生型DNA的正常碱基区域的3’侧从相邻通常1～300碱基、优选5～100碱基的碱基起通常5～1000碱基、优选5～150碱基的碱基序列；和在5’侧从相邻通常1～300碱基、优选5～100碱基的碱基起通常5～1000碱基、优选5～150碱基的碱基序列连结而成的碱基序列的互补链。但是，不包括将在正常碱基区域的3’侧从相邻1碱基的碱基起的碱基序列和在5’侧从相邻1碱基的碱基起的碱基序列连结而成的碱基序列的互补链(由于为上述(a)的探针)。另外，对于在正常碱基区域的3’侧相邻1～300碱基的碱基和在5’侧相邻1～300碱基的碱基，这些相邻的碱基的数之和为4以下时，变异型杂交体无法形成环结构，但该情况也包含在上述(b)的探针中。另外，上述相邻的碱基的数之和通常为1～300碱基、优选为5～100碱基。

(III)变异型DNA为具有插入碱基区域的DNA的情况

(III-1)形成在探针侧具有环结构的杂交体的情况

作为本情况中的本发明的探针，使用下述探针即可：(a)形成具有环结构的野生型杂交体、形成不具有环结构的变异型杂交体的探针；或者(b)形成在探针上具有环结构的野生型杂交体和在探针上具有环结构的变异型杂交体、且两者的环结构为不同结构的探针。

作为上述(a)的探针，使用由与变异型DNA的碱基序列全部互补的碱基序列或与包含变异型DNA的插入碱基区域的一部分碱基序列互补的碱基序列(与碱基序列的全部或一部分100％互补的碱基序列)构成的探针即可。在使用这样的探针时，对于野生型杂交体，在其基因组DNA上与插入碱基区域互补的序列形成环结构，变异型杂交体不形成环结构。下面记载其示意图。需要说明的是，图中的MMM表示插入碱基区域，虚线表示与插入碱基区域互补的碱基序列。

作为这样的探针，具体来说，可以举出将变异型DNA的插入碱基和其两旁的各5～1000碱基、优选5～150碱基连结而成的碱基序列的互补链等。换言之，可以举出作为与变异型DNA互补的序列的、由变异型DNA的插入碱基和其两旁的各5～1000碱基、优选5～150碱基的碱基序列构成的序列的互补碱基序列。

作为上述(b)的探针，使用在与上述(a)的探针的插入碱基区域互补的碱基序列中或该碱基序列的旁边插入有不与野生型DNA和变异型DNA杂交的碱基序列而成的探针即可。在使用这样的探针时，野生型杂交体在探针上由与插入碱基区域互补的碱基序列和插入的碱基序列形成环结构，变异型杂交体在探针上由插入的碱基序列形成环结构。即，野生型杂交体的环结构与变异型杂交体的环结构的结构是不同的。下面记载其示意图。需要说明的是，图中的MMM表示插入碱基区域，虚线表示与插入碱基区域互补的碱基序列，双线表示在探针上任意插入的碱基链。

作为这样的探针，具体来说，可以举出将在变异型DNA的插入碱基区域中、或者插入碱基区域的3’端的相邻位置或5’端的相邻位置的任一任意位置插入有通常1～300碱基、优选5～100碱基的用于形成环结构的碱基序列的插入碱基和其两旁的各5～1000碱基、优选5～150碱基连结而成的碱基序列的互补链等。需要说明的是，上述插入的碱基序列为1～2碱基的情况下，变异型杂交体无法形成环结构，但该情况也包含于上述(b)的探针中。另外，上述插入的碱基序列只要其总碱基数在上述范围内，则也可以分开插入在上述位置中两个以上的位置。

(III-2)形成在基因组DNA侧具有环结构的杂交体的情况

作为本情况中的本发明的探针，使用下述探针即可：(a)形成不具有环结构的野生型杂交体、形成具有环结构的变异型杂交体的探针；或者(b)形成在基因组上具有环结构的野生型杂交体和在基因组上具有环结构的变异型杂交体、且两者的环结构为不同结构的探针。

作为上述(a)的探针，使用由与野生型DNA的碱基序列全部或一部分互补的碱基序列(与碱基序列的全部或一部分100％一致的碱基序列)构成的探针即可。换言之，使用变异型DNA中的、通过变异发生插入的插入碱基区域以外的碱基序列全部或一部分的互补碱基序列(是指与碱基序列的全部或一部分100％互补的碱基序列)构成的探针即可。在使用这样的探针时，野生型杂交体不形成环结构，对于变异型杂交体，在其基因组DNA上插入碱基区域形成环结构。下面记载其示意图。需要说明的是，图中M表示插入碱基区域。

作为这样的探针，具体来说，可以举出将变异型DNA的插入碱基区域的两旁的各5～1000碱基、优选5～150碱基连结而成的碱基序列的互补链等。换言之，可以举出作为与野生型DNA互补的序列的、从与插入碱基区域对应的部位起向着两方向各5～1000碱基、优选5～150碱基的碱基序列的互补碱基序列。

作为上述(b)的探针，使用从上述(a)的探针中以插入碱基区域的相邻碱基的互补碱基为基点、除去了用于在野生型杂交体中构成环的碱基序列后的探针即可。在使用这样的探针时，野生型杂交体中上述除去的碱基序列在基因组DNA上形成环结构，变异型杂交体在基因组DNA上利用上述除去的碱基序列和插入碱基区域形成环结构。即，野生型杂交体的环结构与变异型杂交体的环结构的结构是不同的。下面记载其示意图。需要说明的是，虚线表示插入碱基区域，双线表示在探针设定时从基因组DNA的互补序列中任意除去的碱基链。

作为这样的探针，具体来说，可以举出将在变异型DNA的插入碱基区域的3’侧从相邻通常1～300碱基、优选5～100碱基的碱基起通常5～1000碱基、优选5～150碱基的碱基序列；和在5’侧从相邻通常1～300碱基、优选5～100碱基的碱基起通常5～1000碱基、优选5～150碱基的碱基序列连结而成的碱基序列的互补链。但是，不包括将在插入碱基区域的3’侧从相邻1碱基的碱基起的碱基序列和在5’侧从相邻1碱基的碱基起的碱基序列连结而成的碱基序列的互补链(由于为上述(a)的探针)。另外，对于在插入碱基区域的3’侧相邻1～300碱基的碱基和在5’侧相邻1～300碱基的碱基，这些相邻的碱基的数之和为4以下时，野生型杂交体无法形成环结构，但该情况也包含在上述(b)的探针中。另外，上述相邻的碱基的数之和通常为1～300碱基、优选为5～100碱基。

上述(I)～(III)中记载的本发明的杂交体中，通过在具有环结构的碱基链的相反侧的碱基链(即在基因组DNA侧具有环结构的情况下为探针侧、在探针侧具有环结构的情况下为基因组DNA侧)进一步形成环结构，从而能够提高变异型杂交体与野生型杂交体的分离精度。

作为此时的探针，在基因组DNA侧具有环结构的情况(在探针侧进一步形成环结构的情况)下，将用于在探针中形成环的序列(通常1～300碱基、优选5～100碱基)插入探针即可，在探针侧具有环结构的情况(在基因组DNA侧进一步形成环结构的情况)下，将与用于在基因组DNA中形成环结构的基因组DNA中的碱基序列对应的互补链(通常1～300碱基、优选5～100碱基)从探针去除即可。

[本发明的嵌入剂]

作为本发明的检测方法中与杂交体形成结合体的嵌入剂，具体来说，可以举出例如下述(1)～(5)的嵌入剂以及下述(6)和(7)的嵌入剂类似物质。即，可以举出(1)吖啶橙等吖啶色素；(2)例如溴化乙锭、乙锭均二聚物1(EthD-1)、乙锭均二聚物2(EthD-2)、溴化乙锭单叠氮溴(EMA)、二氢乙锭等乙锭化合物；(3)例如碘化丙啶、hexidium碘化物等碘化合物；例如7-氨基放线菌素D(7-AAD)；例如POPO-1、BOBO-1、YOYO-1、TOTO-1、JOJO-1、POPO-3、LOLO-1、BOBO-3、YOYO-3、TOTO-3等花青二聚物系色素(均为Molecular Probes社商品名)；(4)例如PO-PRO-1、BO-PRO-1、YO-PRO-1、TO-PRO-1、JO-PRO-1、PO-PRO-3、LO-PRO-1、BO-PRO-3、YO-PRO-3、TO-PRO-3、TO-PRO-5等花青单体系色素(均为Molecular Probes社商品名)；(5)例如SYBR Gold、SYBR Green I and SYBR Green II、SYTOX Green、SYTOX Blue、SYTOX Orange等SYTOX系色素(均为Molecular Probes社商品名)、例如GelRed(和光纯药社商品名)等GelRed系色素；(6)与DNA双螺旋的小沟结合的物质[例如4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI：Molecular Probes社商品名)；(7)与腺嘌呤-胸腺嘧啶(A-T)序列特异性结合的物质[例如五水合物(双苯酰亚胺)(Hoechst 33258：Molecular Probes社商品名)、三盐酸化物(Hoechst 33342：Molecular Probes社商品名)、双苯酰亚胺色素(Hoechst 34580：Molecular Probes社商品名)等、例如9-氨基-6-氯-2-甲氧基吖啶(ACMA)、双-(6-氯-2-甲氧基-9-吖啶基)精胺(吖啶同型二聚体)等吖啶色素、例如羟茋巴脒等]等。

[本发明的变异型DNA或/和野生型DNA的检测方法]

本发明的变异型DNA或/和野生型DNA的检测方法包括以下工序：

(1)使本发明的变异型DNA的至少1种或/和本发明的野生型DNA与本发明的探针接触而形成变异型杂交体或/和野生型杂交体的工序；

(2)使所得到的变异型杂交体或/和野生型杂交体与本发明的嵌入剂接触的工序；

(3)对变异型杂交体与嵌入剂的结合体或/和野生型杂交体与嵌入剂的结合体进行分离，从而检测变异型DNA或/和野生型DNA的有无的工序。

作为上述(1)中的变异型杂交体或/和野生型杂交体的形成方法(下文中有时将该反应简记为LH反应)，只要使本发明的DNA与本发明的探针接触，付于DNA分子缔合反应而形成杂交体即可。需要说明的是，在本发明的DNA形成双链的情况下，可以利用通常该领域中进行的加热处理(90℃～100℃)或碱处理(基于氢氧化钠等的处理)等使双链DNA单链化而形成本发明的DNA，并使该DNA与本发明的探针接触而付于LH反应可。另外，在该LH反应中得到的杂交体具有突出末端的情况下，优选对该突出末端进行平滑末端化处理。由此，在杂交体的末端不存在单链，因而可以降低由于具有单链所导致的对分离的影响。作为该平滑末端处理，可以举出通常该领域中进行的使用了具有聚合酶活性的酶的DNA延伸反应、使用了具有核酸外切酶活性的酶的末端单链DNA的分解反应等。其中，杂交体中的双链碱基部分长时，本发明的杂交体稳定，因此优选DNA延伸反应。

作为上述DNA分子缔合反应，在含有本发明的DNA的水或缓冲液中添加本发明的探针，使溶液中的浓度为20nM～2μM、优选为100nM～500nM，在通常30℃～55℃反应通常1秒～600秒、优选1秒～30秒，由此进行反应。作为含有本发明的DNA的水，优选去离子化灭菌水，作为缓冲液，只要是该领域中使用的自身公知的缓冲液则没有特别限定，可以举出例如Tris缓冲液、磷酸缓冲液、佛罗那缓冲液、硼酸缓冲液、Good’s缓冲液等，对其pH也没有特别限定，通常为5～9的范围。

作为上述末端平滑化反应，根据自身公知的平滑化反应进行即可，例如可以将杂交体1ng～1μg添加到20μL～40μL的水或缓冲液中，进而一同添加具有核酸外切酶活性的酶1U～5U、根据需要的通常分别0.01nmol～50nmol、优选0.1nmol～20nmol的4种三磷酸脱氧核糖核苷酸(dNTPs)，在通常30℃～70℃、优选35℃～60℃反应通常10分钟～120分钟、优选30分钟～60分钟，由此进行该平滑化反应。该反应中的水或缓冲液可以举出与上述分子缔合反应的项中记载的物质相同的物质。作为上述具有核酸外切酶活性的酶，可以举出例如T4 DNA聚合酶、KOD DNA聚合酶、pfu DNA聚合酶等。

作为上述DNA延伸反应，将由分子缔合反应得到的杂交体1ng～1μg添加到20μL～40μL的水或缓冲液中，进而分别添加通常0.01nmol～50nmol、优选0.1nmol～20nmol的4种三磷酸脱氧核糖核苷酸(dNTPs)、以及具有聚合酶活性的酶1U～5U，在通常30℃～80℃、优选65℃～75℃反应通常10秒～10分钟、优选1分钟～4分钟，从而进行该延伸反应。该反应中的水或缓冲液可以举出与上述分子缔合反应的项中记载的物质相同的物质。另外，作为具有聚合酶活性的酶，可以举出例如T4 DNA聚合酶、KOD DNA聚合酶、pfu DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶、Klenow片段等，优选Taq DNA聚合酶、KOD DNA聚合酶等耐热性DNA聚合酶。

上述(1)的反应中的本发明的DNA可以使用通过公知的PCR反应扩增得到的物质。该情况下，PCR反应产物为双链DNA，因而在进行将上述双链DNA单链化的处理后，付于LH反应即可。另外，在使用包含PCR反应产物的PCR反应液付于LH反应，直接付于DNA延伸反应的情况下，可以不添加dNTPs和具有聚合酶活性的酶而进行反应，因此优选使用该方法。

本发明的LH反应优选在分子缔合反应前利用加热施加双链DNA的单链化处理，形成循环反应。具体来说，例如向含有本发明的DNA的水或缓冲液中添加本发明的探针，使溶液中的浓度为20nM～2μM、优选为100nM～500nM，之后例如使以90℃～100℃温度下2分钟～4分钟(热变性)、30℃～55℃温度下1秒～30秒(DNA分子缔合反应)为1个循环的反应进行1～4个循环，从而形成杂交体即可。另外，也可以进而施加延伸反应而形成循环反应，该情况下，使以90℃～100℃温度下2分钟～4分钟(热变性)、30℃～55℃温度下1秒～30秒(DNA分子缔合反应)、65℃～75℃温度下1分钟～4分钟(DNA延伸反应)为1个循环的反应进行1～4个循环，从而形成杂交体即可。需要说明的是，在进行延伸反应时，DNA分子缔合反应在DNA延伸反应时的条件下也进行反应，因此也可以使以90℃～100℃温度下2分钟～4分钟(热变性)、65℃～75℃温度下1分钟～4分钟(DNA分子缔合、DNA延伸反应)为1个循环的反应进行1～4个循环，从而进行LH反应。

作为热变性、DNA分子缔合反应、DNA延伸反应的循环反应，具体来说如下进行。即，首先，例如在溶解有100ng作为对象的DNA的例如10mM～50mMTris缓冲液(pH8.4～9.0)等缓冲溶液20μL～40μL中添加本发明的探针，使溶液中的浓度为20nM～2μM、优选为100nM～500nM、更优选为100～200nM。其后，例如，使以90℃～100℃温度下2分钟～4分钟(热变性)、30℃～55℃温度下1秒～30秒(DNA分子缔合反应)、65℃～75℃温度下1分钟～4分钟(DNA延伸反应)为1个循环的反应进行1～4个循环，从而形成杂交体。

如前所述，在利用PCR反应扩增本发明的DNA、接着付于LH反应的情况下，具体如下进行。即，例如，将作为模板的DNA 1pg～100pg溶解于20μL～40μL的Tris盐酸缓冲液等缓冲液中，添加各自通常1pmol～100pmol、优选1pmol～50pmol的用于扩增目标区域的2种引物(正向、反向)、各自通常0.01nmol～50nmol、优选0.1nmol～20nmol的4种三磷酸脱氧核糖核苷酸(dNTPs)，共存Taq DNA聚合酶、KOD DNA聚合酶等耐热性DNA聚合酶1U～5U，将以例如(1)93℃～98℃、10秒～10分钟→(2)50℃～60℃、10秒～3分钟→65℃～75℃、1分钟～5分钟为1个循环的反应反复进行30～40个循环，从而进行该扩增。其后，向所得到的反应溶液中添加本发明的探针，使其为作为模板的DNA的0.1～10倍量、例如通常0.1pmol～500pmol、优选0.1pmol～50pmol，与上述同样地进行LH反应。

另外，如上所述在利用PCR反应扩增单链DNA的情况下，也可以与该PCR反应同时进行LH反应。该情况下，作为本发明的探针，使用通过磷酸基等对3’端和5’端进行了修饰的探针，在该探针的存在下进行上述PCR反应即可。具体来说，例如，将作为模板的DNA 1pg～100pg溶解于20μL～40μL的10mM～50mMTris盐酸缓冲液(pH8.4～9.0)等缓冲液中，添加各自通常1pmol～100pmol、优选1pmol～50pmol的2种引物(正向、反向)、各自通常0.01nmol～50nmol、优选0.1nmol～20nmol的4种三磷酸脱氧核糖核苷酸(dNTPs)、通常0.1pmol～500pmol、优选0.1pmol～50pmol的对3’端和5’端进行了修饰的本发明的探针，使耐热性DNA聚合酶共存例如1U～5U，将以例如(1)93℃～98℃、10秒～10分钟→(2)50℃～60℃、10秒～3分钟→(3)65℃～75℃、1分钟～5分钟为1个循环的反应反复进行30～40个循环，从而进行该扩增反应。

作为上述(2)的使杂交体与本发明的嵌入剂接触的工序，相对于含有杂交体1ng～1μg的水或缓冲液以10nmol/L～10μmol/L、优选10nmol/L～1μmol/L的方式添加嵌入剂，从而进行该工序。需要说明的是，该接触工序可以与(3)的对变异型杂交体与嵌入剂的结合体或/和野生型杂交体与嵌入剂的结合体进行分离的工序(分离工序)同时进行，该情况下，嵌入剂可以添加到试样中而分离，也可以不添加到分离溶液中。关于此时的嵌入剂的浓度，按照试样中的浓度为上述浓度的方式添加即可。

作为上述(3)的分离工序，只要是通常该领域中使用的分离DNA的方法、特别是能够分离双链DNA的方法，则没有特别限定，优选基于分子量、分子结构或/和电荷的差异等进行分离的方法。作为该基于分子量、分子结构或/和电荷的差异等进行分离的方法，具体来说可以举出例如高效液相色谱法(HPLC法)、电泳法、利用过滤器的分离方法等。其中，优选电泳法。

在利用HPLC法的情况下，根据例如Anal.Chem.65,5,613-616(1993)、WO03/014398、WO03/031580、US5585236、US5772889、US5972222等中记载的方法(Ion-pair reverse-phase high pressure liquid chromatography(离子对反相高压液相色谱法))进行即可。另外，在使用利用了过滤器的分离方法时，根据例如PanasonicTechnical Journal Vol.57 No.3 Oct.2011、或日本特开2009-125009中记载的方法等进行即可。

作为电泳法，可以举出例如等电点电泳法、SDS-聚丙烯酰胺电泳法、琼脂糖凝胶电泳法、丙烯酰胺电泳法、毛细管电泳法、毛细管芯片电泳法、介电泳法等电泳法。其中，出于冷却效率好、能够施加高电压、能够高效地分离等理由，优选毛细管电泳法、毛细管芯片电泳法，特别优选适合于微量样品分析的毛细管芯片电泳法。需要说明的是，这些分离方法的条件根据自身公知的方法进行即可，例如毛细管芯片电泳根据WO2007/027495等中记载的方法进行即可。

作为上述(3)中的通过分离检测变异型DNA或野生型DNA的方法，根据通常该领域中进行的方法进行即可，具体来说例如可以举出以下方法：使用与本发明的变异型DNA相同碱基序列的DNA或与本发明的野生型DNA相同碱基序列的DNA，通过本发明的检测方法对杂交体与嵌入剂的结合体进行分离，由其分离状况(程度)来检测变异型DNA或野生型DNA；等等。例如，在分离方法为电泳法的情况下，由其泳动度、泳动距离或泳动时间等来检测变异型DNA或野生型DNA即可。

上述(3)中的检测方法只要是自身公知的方法则可以使用任意方法，可以利用差示折射检测器、荧光检测器、UV检测器等设备进行检测，其中，优选利用UV检测器、荧光检测器进行的检测，更优选利用荧光检测器进行的检测。

在进行上述检测的情况下，为了检测杂交体与嵌入剂的结合体，通常检测嵌入剂的荧光即可，但也可以使用预先进行了荧光标记的探针在上述(1)和(2)的工序后对进行了(3)的分离的结合体中的探针的荧光标记进行检测，从而进行检测。另外，在使用预先进行了荧光标记的探针时，如上所述，也可以在上述(1)的工序后与(2)的工序和(3)的分离同时进行，之后检测荧光标记。

作为此处使用的探针的荧光标记，可以举出例如花青色素。此处所说的花青色素是指将两个杂环用次甲基或多次甲基结合、且该杂环中的至少1个为含氮杂环的化合物，优选所述2个杂环两者均为含氮杂环。作为来自上述花青色素的取代基，优选例如US4,981,977、US 5,268,486、US5,486,616等中记载的来自Cy系色素的物质；US6,083,485等中记载的来自Dy系色素的物质；WO2006/047452等中记载的来自HiLyte系色素的物质、来自Alexa系色素的物质等。另外，也可以使用来自市售的物质，例如使用来自Cy系色素的物质的情况下，可以举出来自Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7等的物质[均为Amersham Biosciences社商品名]作为优选的物质；作为来自Dy系色素的物质，可以举出来自DY-700、DY-701、DY-730、DY-731、DY-732、DY-734、DY-750、DY-751、DY-752、DY-776、DY-780、DY-781、DY-782等的物质作为优选的物质；作为来自HiLyte系色素的物质，可以举出来自HiLyte Fluor 555、HiLyteFluor 647、HiLyte Fluor 680、HiLyte Fluor 750等的物质[均为AnaSpec社制造的商品名]作为优选的物质；作为来自Alexa系色素的物质，可以举出来自Alexa Fluor Dye532、Alexa Fluor Dye 546、Alexa Fluor Dye 555、Alexa Fluor Dye 568、Alexa Fluor Dye594、Alexa Fluor Dye 633、Alexa Fluor Dye 647、Alexa Fluor Dye 660、Alexa Fluor Dye680、Alexa Fluor Dye 700、Alexa Fluor Dye 750等的物质[均为Molecular Probes社的商品名]作为优选的物质。其中，优选来自Cy系色素的物质，尤其优选来自Cy5的物质。需要说明的是，探针的荧光标记根据公知的方法进行即可。

通过本发明的检测方法对来自癌症患者的人基因组DNA进行变异型DNA检测的情况下，具体来说例如如下进行。

即，将利用市售的试剂盒等提取和纯化的人基因组DNA作为试样，进行PCR反应。PCR反应用试样可以例如如下制备：按照作为检测对象的DNA的引物(正向和反向)各自通常为100nM～1000nM、4种三磷酸脱氧核糖核苷酸(dNTPs)各自通常为0.1nM～500nM、Taq DNA聚合酶为1～5单位的方式，溶解于Tris盐酸缓冲液等缓冲液20μL中，之后添加人基因组DNA 1ng～100ng而制备该试样。PCR反应中，可以通过将例如(1)93℃～98℃、10秒～30秒、(2)50℃～60℃、10秒～30秒、(3)68℃～72℃、1分钟～3分钟的循环进行35～40个循环，来扩增对象单链DNA。可以向所得到的含有对象单链DNA的PCR反应溶液中添加PCR的引物的0.1～10倍量的探针，进一步进行杂交反应。即，例如向PCR反应溶液中添加本发明的探针，使最终浓度为100nM～500nM，对其以90℃～100℃温度下2分钟～4分钟、30℃～55℃温度下1秒～30秒、65℃～75℃温度下1分钟～4分钟进行1～4个循环，从而得到检测目标DNA的杂交体。使所得到的溶液在含有嵌入剂10nmol～1μmol/L的泳动溶液中进行电泳，通过例如荧光检测器等进行检测，基于其泳动度可以检测变异型DNA的有无。

下面，通过实施例、参考例等来更详细地说明本发明，但本发明不受这些实施例等的任何限定。

实施例

合成例1具有EGFR基因外显子19上的变异型DNA和野生型DNA的序列的样品克隆的制备

(1)来源于临床样本的靶标序列的克隆

已知在EGFR基因外显子19上从密码子747-749开始的区域中因框内缺失而发生基因变异(K.Endo,A.Konishi,H.Sasaki et al.,Lung Cancer 50(3),375(2005))。因此，通过PCR由来自实际肺癌患者的样品对包含该区域而成的DNA序列进行扩增，进而利用pGEM-T Vector系统(Promega社)将其扩增产物克隆至质粒，得到这些具有5种变异型DNA和野生型的序列的样品克隆。下面示出该步骤的详细情况。

即，准备多个作为临床样本得到的人肺腺癌组织切片，利用Pinpoint Slide DNAIsolation System(Zymo Research社制造)，根据试剂盒所附的制品方案将所切出的组织切片(2mm x 4 mm)用蛋白酶K在70℃处理5小时。其后，以95℃施加10分钟的热处理，由各组织片段提取基因组DNA。在此处得到的DNA提取液30μL中，将1μL用作模板材料，利用AccuPrime Taq聚合酶系统(PCR反应用试剂盒、Invitrogen社制造)进行PCR反应。即，首先，根据试剂盒所附的制品方案使用各10μM的引物溶液(EGFR19J：ggactctggatcccagaaggtg[序列号1]和EGFR19U：ctgaggttcagagccatggac[序列号2])1.0μL以及试剂盒所附的PCR反应缓冲液2.0μL、AccuPrime Taq酶0.5μL、和去离子化灭菌水(ddH₂O)16.5μL，制备PCR用反应液20.0μL。其后，将各样品克隆2pg悬浮添加至PCR用反应液20μL中，制成PCR用试样。使用该PCR用试样，利用MJ Research社的DNA热循环仪(DNA Engine PTC200)在下述的反应条件下进行了30个循环的PCR反应。

*PCR反应条件

热变性：95℃、15秒

退火：55℃、15秒

聚合反应：68℃、47秒

对于由该PCR反应得到的多个PCR产物(野生型中为146bp)，分别利用pGEM-TVector System(Promega社)根据TA克隆法插入到质粒·载体pGEM-T easy中。即，在PCR扩增产物3.0μL中各自加入pGEM-T Easy Vector(Promega社制造)1.0μL和DNALigation Kit(Promega株式会社制造)的Rapid Ligation Buffer 5.0μL与T4连接酶1.0μL，使总量为10.0μL，在室温下进行60分钟温育，得到重组DNA。

其后，使用E.coli JM109 Competent Cells(东洋纺社制造)，根据其制品方案，利用上述得到的重组DNA以42℃、45秒进行E.coli JM109 Competent Cells的转化。其后，将所得到的转化体在包含100μg/ml的氨苄青霉素、0.2 mM异丙基-β-硫代半乳糖苷(IPTG)、40μg/ml X-Gal的LB-琼脂培养基中于37℃进行16小时平板培养。培养后，拾取培养基中的白色菌落，得到导入有插入了目标DNA片段的重组DNA的、对于各克隆的转化体。其后，使用QIAGEN社的质粒提取试剂盒(QIAprep SpinMiniprep)，进行直至DNA的提取·纯化为止的工序。

即，通过离心对在5ml的含有100μg/ml的氨苄青霉素的LB液体培养基中增殖了一晚的各克隆的转化体进行集菌，利用碱法溶菌后，用乙酸钾酸性溶液进行中和，通过试剂盒所附的纯化柱从它们的离心后的上清液纯化质粒DNA。

(2)变异型DNA和野生型DNA的序列的确认

使用(1)中克隆的预测包含多种变异型DNA或野生型DNA的序列的候补克隆，利用Big Dye Terminator试剂盒(Applied Biosystems社制造)按照制品方案以下述步骤进行了测序解析。

即，向样品DNA(各克隆)2μL(100ng)、T7启动子引物1μL(5pmol)、以及包含酶、dNTPs、反应缓冲液和荧光色素的试剂盒附属的premix 8μL的混合物中加入ddH₂O，使总量达到20μL，使用DNA热循环仪(DNA Engine PTC200、MJ Research社制造)在下述的反应条件下进行了30个循环的测序反应。

96℃2分钟→(96℃10秒→50℃5秒→60℃3分钟)×25→4℃

利用凝胶过滤柱(QIAGEN社制造)对所得到的测序反应产物进行纯化后，使用测序仪(3130 Genetic Analyzer、Applied Biosystems社制造)根据设备附属的说明书完成了候补序列所有的测序解读。

其结果，确认到能够制作出在EGFR基因外显子19上具有下述表1的5种变异型DNA和野生型DNA的序列的样品克隆。需要说明的是，将变异型DNA各自的样品克隆记为G1～G5，将野生型DNA记为N。下表中用“-”表示的部位是相对于野生型的序列确认到缺损的序列区域。

[表1]

(3)样品DNA的扩增

将上述G1～5和N的各样品克隆作为试样，使用AccuPrime Taq聚合酶系统(PCR反应用试剂盒、Invitrogen社制造)进行PCR反应。

即，首先，根据试剂盒所附的制品方案使用各10μM的引物溶液(EGFR19J：ggactctggatcccagaaggtg[序列号1]和EGFR19U：ctgaggttcagagccatggac[序列号2])1.0μL、以及试剂盒所附的PCR反应缓冲液2.0μL、AccuPrime Taq酶0.5μL和ddH₂O 16.5μL，制备PCR用反应液20.0μL。其后，将各样品克隆2pg悬浮添加到PCR用反应液20μL中，作为PCR用试样。使用该PCR用试样，利用MJ Research社的DNA热循环仪(DNAEngine PTC200)在下述的反应条件下进行了30个循环的PCR反应。

*PCR反应条件

热变性：95℃、15秒

退火：55℃、15秒

聚合反应：68℃、47秒

所得到的PCR扩增产物的碱基大小和碱基序列如下所述。

[表2]

实施例1嵌入剂共存下的LH反应产物的分离检测

(1)环杂交反应用探针(LH探针)的制作

按照在与野生型DNA(N)杂交的情况下不形成环、在与具有缺失变异区域的变异型DNA(G1～G5)杂交的情况下与缺损碱基区域对应的LH探针上的互补链形成环的方式，设计了LH探针。即，使用下述探针作为LH反应用的探针(EGFR19JWTF)。

ggactctggatcccagaaggtgagaaagttaaaattcccgtcgctatcaaggaattaagagaagcaacatctccgaaagccaacaaggaaatcctcgat[序列号15])

上述探针的合成利用了Sigma-genosys社的委托合成服务。另外，以下的本发明的合成例和实施例中的引物和探针的低聚核苷酸合成及荧光色素的标记等也同样地利用了Sigma-genosys社的委托合成服务。

在使用上述探针的情况下，认为形成下述那样的杂交体。

(2)LH反应

在合成例1(3)中得到的6种PCR反应溶液各4.5μL中添加LH探针(ID.＝EGFR19JWTF)，使最终浓度达到200nM，使用DNA热循环仪(DNA Engine PTC200、MJ Research社制造)在下述的反应条件下进行1个循环反应。

*LH反应

反应溶液 4.5μl

LH探针 0.5μl(2μM)

105℃ 热盖

95℃ 2分钟

55℃ 30秒

68℃ 4分钟

4℃ 反应停止

(3)LH反应产物在嵌入剂共存下的电泳分离检测(微芯片电泳)

对于上述LH反应中得到的6种LH反应产物，使用Agilent2100生物分析仪系统(Agilent社)供于微芯片电泳方法。本泳动方法中使用作为专用试剂的AgilentDNA1000 Assay试剂盒(Agilent社制造)，施加各LH反应产物1.0μL。此处，在LH反应产物的分离检测时，使用将试剂盒附属的嵌入剂染料(Dye)和泳动用聚合物预先混合而成的物质，因此在电泳的过程中在LH反应产物和嵌入剂共存的状态下得到分离检测。

电泳后的峰解析中使用系统附属的Agilent2100专家软件，进行了波形解析和峰移动度的计算。将其结果示于图1。

由该结果可表明：根据本发明的检测方法，能够分离G1～G5的全部变异基因。特别是，可知：虽然G2～G4的变异基因的碱基大小相同(131bp)，但也能够明确地分离。

比较例1嵌入剂非共存下的LH反应产物的分离检测

作为实施例1的比较，针对以Cy5对LH反应产物进行了荧光标记的物质，通过电泳进行了分离检测。

(1)Cy5标记LH探针的制作

制作以Cy5对实施例1(1)中使用的LH反应用的探针序列：EGFR19JWTF[序列号15]的5’端进行了荧光修饰的探针。

(2)利用Cy5标记LH探针进行的以荧光信号为指标的LH反应产物的检测

除了使用上述探针以外，利用与实施例1(2)同样的方法，将上述合成例1中制备的6种各样品克隆作为试样而进行了LH反应。接着，使用所得到的6种LH反应产物进行了EGFR基因的缺失变异型DNA检测。具体来说，除了使泳动用聚合物和泳动用缓冲液如下所述以外，与上述(3)同样地利用Agilent2100生物分析仪系统(Agilent社)对LH反应产物进行了微芯片电泳。关于泳动用聚合物，使用了未添加嵌入剂染料、而以终浓度4.9nM添加了微芯片电泳的光学系统中的焦点调整所需要的Cy5-dCTP(GE Bio社)的物质。关于泳动缓冲液使用了下述缓冲液：其与泳动用聚合物同样地以终浓度4.9nM添加了Cy5-dCTP(GE Bio社)，另外，代替以电泳的峰移动度计算的修正为目的而含有的15bp(低分子量标记)和1500bp(高分子量标记)的DNA片段而将经Cy5标记的15bp和1500bp的DNA片段添加到泳动缓冲液中。即，在上述电泳条件下在嵌入剂非共存下将LH反应产物分离检测。

将其结果示于图2。

由图2的结果可知，在嵌入剂非共存下的LH反应产物的电泳分离检测中，由于来自G1～G5的样品克隆的峰重叠，因而无法分离检测。即，由图1的结果可知，通过共存嵌入剂而在电泳中形成LH反应产物与嵌入剂的结合物，由此能够明确地分离在非共存下无法分离的LH反应产物。

此处，关于实施例1和比较例1中得到的结果，将电泳中的各峰的移动时间之差归纳于表3中，进行两者的对比。

[表3]

	实施例1	比较例1	嵌入剂有无的优劣
				G1与G2的时间差	0.9秒	0.2秒	有＞无
G1与G3的时间差	1.2秒	1.1秒	同等
				G1与G4的时间差	4.2秒	1.1秒	有＞无
G1与G5的时间差	6.5秒	1.2秒	有＞无
				G2与G3的时间差	2.1秒	1.3秒	有＞无
G2与G4的时间差	5.2秒	0.9秒	有＞无
				G2与G5的时间差	7.4秒	1.4秒	有＞无
G3与G4的时间差	3.1秒	2.2秒	有＞无
				G3与G5的时间差	5.3秒	0.1秒	有＞无
G4与G5的时间差	2.3秒	2.3秒	同等

由表3的结果可知，即使是相同的LH反应产物，通过共存嵌入剂也可格外地提高电泳分离中的识别能力。认为这是因为，由于来自各样品克隆的G1～G5的变异型DNA和LH探针形成的杂交体中的环的二次结构的差异，与嵌入剂的作用(结合)方式大幅不同，其结果成为电泳中的各峰移动度之差。

需要说明的是，在所有结果中，与野生型(N)DNA形成杂交体时在该探针上未形成环状的二次结构，因此在与用变异型(G1～G5)检测的峰组的对比中确认到止于基线检测。

比较例2嵌入剂共存下的双链DNA片段的电泳分离检测

为了确认嵌入剂是否对双链DNA整体具有分离能力提高效果、为了确认是否对基于LH法的杂交体具有分离能力提高效果，使用并非基于LH法的杂交体的双链DNA(实施例1的表2中的G1、G2、G3、G4、G5)在嵌入剂存在下进行了分离检测。

即，对于上述合成例1(3)中得到的G1～G5的变异型DNA，分别使用Agilent2100生物分析仪系统(Agilent社)供微芯片电泳方法。本泳动方法中使用作为专用试剂的Agilent DNA1000 Assay试剂盒(Agilent社制造)，施加各PCR扩增产物1.0μL。此处，在LH反应产物的检测时，使用将试剂盒附属的嵌入剂染料和泳动用聚合物预先混合而成的物质，因此在电泳的过程中在PCR扩增产物和嵌入剂共存的状态下得到分离检测。

电泳后的峰解析中使用系统附属的Agilent2100专家软件，进行了波形解析和峰移动度的计算。将其结果示于图3。

由图3可知，双链DNA的碱基大小(bp)几乎相等的G2～G4的峰移动度未看到差异，即使在嵌入剂存在下它们也无法分离。

结合上述实施例1的结果进行考察，可知：嵌入剂的分离能力提高效果对双链DNA不发挥效果，对于通过LH法得到的杂交体、即使嵌入剂与包含双链区域和单链区域两者的物质(LH反应产物)结合而成的物质的分离可发挥优异的效果。虽然其理由尚不明确，但推测是：由于LH法原本是以通过环的结构(单链部分)的差异进行分离为目的，进而嵌入剂在双链DNA部分结合而发生结构变化，从而分离能力提高。

比较例3嵌入剂非共存下的LH反应产物的分离检测(丙烯酰胺聚合凝胶电泳)

作为实施例1的比较，使用丙烯酰胺聚合凝胶电泳对利用电泳分离后的基于嵌入剂染色的检测的LH反应产物进行检测。

具体来说，使用实施例1(2)的LH反应中得到的6种LH反应产物[(来自EGFR基因的变异型DNA的LH反应产物(G1～G5)和野生型DNA的LH反应产物(N)]，如下进行电泳。即，向各1.5μl的6个样品中分别添加凝胶加样缓冲液1.5μl，利用非变性10％聚丙烯酰胺凝胶进行电泳。另外，作为分子量标记，使用100 bp ladder for sizemarker(promega社制造)1.5μl，加样到同一凝胶进行电泳。聚丙烯酰胺凝胶使用7cmx7cm的压缩凝胶(压缩凝胶C10L、ATTO社制造)，将Tris·甘氨酸缓冲液(37.5mM Tris,288mM Glycine)作为泳动缓冲液并利用小型电泳装置(ATTO社、AE-7300压缩PAGE)在室温下进行泳动。

泳动后，用SYBR Green I(宝生物社、F0513)染色10分钟，水洗后利用激光成像扫描仪(Amersham社、STORM 860)以进行检测。此时，SYBR Green I的荧光检测中使用了激发波长450nm、检测滤波器520LP。将所得到的结果示于图4。需要说明的是，图中，条带1表示使用了变异型DNA(G1)的结果，条带2表示使用了变异型DNA(G2)的结果，条带3表示使用了变异型DNA(G3)的结果，条带4表示使用了变异型DNA(G4)的结果，条带5表示使用了变异型DNA(G5)的结果，条带6表示使用了野生型DNA(N)的结果。

由图4的结果可知，即使是LH反应产物，不与嵌入剂形成结合物而使其泳动，即使在电泳后添加嵌入剂，也无助于来自G1～G5的样品克隆的泳动带的完全分离检测。

比较例4嵌入剂非共存下的Cy5标记LH反应产物的分离检测(丙烯酰胺聚合凝胶电泳)

作为实施例1的比较，使用丙烯酰胺聚合凝胶电泳对利用Cy5荧光标记探针的LH反应产物进行检测。

具体来说，除了使用比较例2(2)的LH反应中得到的6种LH反应产物[(来自EGFR基因的变异型DNA的LH反应产物(G1～G5)和野生型DNA的LH反应产物(N)]以外，与上述比较例3同样地进行电泳。泳动后，以激发波长635nm、检测滤波器650LP进行了荧光检测。将所得到的结果示于图5。需要说明的是，图中，条带1表示使用了变异型DNA(G1)的结果，条带2表示使用了变异型DNA(G2)的结果，条带3表示使用了变异型DNA(G3)的结果，条带4表示使用了变异型DNA(G4)的结果，条带5表示使用了变异型DNA(G5)的结果，条带6表示使用了野生型DNA(N)的结果。

由图5的结果可知，即使是LH反应产物，在不与嵌入剂形成结合物而使其泳动并检测时，也无法完全分离检测来自G1～G5的样品克隆的泳动带。

实施例2关于来自KRAS基因的单碱基置换变异型DNA的LH反应产物的在嵌入剂共存下的分离检测

(1)来自大肠癌患者的人基因组DNA的制备

来自大肠癌患者的人基因组DNA使用Qiagen社QIAamp DNA Mini Kit，将冷冻后的癌组织25mg均化后，添加试剂盒所附的缓冲液。进而，加入蛋白酶K并在56℃完全溶解，用RNaseA进行处理。接着，利用试剂盒所附的缓冲液除去蛋白，进行离心分离，用试剂盒所附的吸附柱对其上清进行提取·纯化。将所得到的产物中的25ng作为PCR的模板材料，利用AccuPrime Taq聚合酶系统(PCR反应用试剂盒、Invitrogen社制造)进行了PCR反应。

即，首先，根据试剂盒所附的制品方案使用各10μM的引物溶液(KRAS-Fw；aaggcctgctgaaaatgactg[序列号16]和KRAS-Rv；ggtcctgcaccagtaatatgca[序列号17])各0.5μL、以及试剂盒所附的PCR反应缓冲液2.0μL、AccuPrime Taq酶0.5μL、和ddH₂O16.5μL，制备PCR用反应液20.0μL。其后，将来自大肠癌患者的人基因组DNA 25ng悬浮添加到PCR用反应液20μL中，作为PCR用试样。使用该PCR用试样，利用MJ Research社的DNA热循环仪(DNA Engine PTC200)在下述的反应条件下进行了36个循环的PCR反应。

*PCR反应条件：

热变性：95℃、15秒

退火：55℃、15秒

聚合反应：68℃、47秒

PCR反应后，将通过Millipore社的Montage PCR纯化后的扩增DNA作为样品DNA，将引物KRAS-Rv[ggtcctgcaccagtaatatgca；序列号17]用作测序引物，通过与前述的合成例1的(2)同样的方法进行测序确认，确认到在KRAS基因的密码子12上具有单碱基置换变异G12W(TGG)。所得到的扩增DNA的碱基序列如下所述[序列号18]。

aaggcctgctgaaaatgactgaatataaacttgtggtagttggagcttggggcgtaggcaagagtgccttgacgatacagctaattcagaatcattttgtggacgaatatgatccaacaatagaggtaaatcttgttttaatatgcatattactggtgcaggacc

(2)LH探针的制作

在与野生型DNA以及变异型DNA形成杂交体时，按照在该探针上形成环结构的方式进行设计，合成了下述LH探针(IN1TA9GCT)。

aaggcctgctgaaaatgactgaatataaacttgtggtagttggagctggtatatatatatatatataggtgtaggcaagagtgccttgacgatacag[序列号19])

需要说明的是，在使用该探针时，与野生型DNA的杂交体用atatatatatatatata形成环结构，在与变异型DNA形成杂交体时，用ggtatatatatatatatata形成环结构。

(3)来自大肠癌患者的人基因组DNA的LH反应

对于上述(1)中得到的PCR反应产物4.5μL，以最终浓度200nM添加LH探针(ID.＝IN1TA9GCT[序列号19])，使用DNA热循环仪(DNA Engine PTC200、MJ Research社制造)在下述的反应条件下进行1个循环反应。

*LH反应

PCR反应产物4.5μl

LH探针0.5μl(2μM)

105℃热盖

95℃2分钟

55℃0-30秒

68℃4分钟

4℃反应停止

(4)LH反应产物的在嵌入剂共存下的电泳分离检测(微芯片电泳)

对于上述(3)中得到的反应产物，使用Agilent2100生物分析仪系统(Agilent社)供微芯片电泳方法。本泳动方法中使用作为专用试剂的Agilent DNA1000 Assay试剂盒(Agilent社制造)，施加各反应产物1.0μL。此处，在LH反应产物的检测时，使用将试剂盒附属的嵌入剂染料和泳动用聚合物预先混合而成的物质，因此在电泳的过程中在LH反应产物和嵌入剂共存的状态下得到分离检测。

电泳后的峰解析中使用系统附属的Agilent2100专家软件，进行了波形解析和峰移动度的计算。

将其结果示于图6-a和图6-b。需要说明的是，图6-b是将图6-a的用○包围的部分放大的图

比较例5针对来自KRAS基因的单碱基置换变异型DNA的LH反应产物在嵌入剂非共存下的分离检测

作为实施例2的比较，针对以Cy5对LH反应产物进行了荧光标记的物质，用电泳进行了分离检测。

(1)Cy5标记LH探针的制作

制作以Cy5对实施例2(2)中使用的LH反应用的探针序列：IN1TA9GCT[序列号19]的5’端进行了荧光修饰的探针。

除了使用上述探针以外，利用与实施例2(3)同样的方法，将合成例2中制备的来自大肠癌患者的人基因组DNA作为试样而进行了LH反应。使用所得到的LH反应产物进行了KARS基因的单碱基置换变异型DNA检测。具体来说，除了使泳动用聚合物和泳动用缓冲液如下所述以外，与上述(3)同样地利用Agilent2100生物分析仪系统(Agilent社)对LH反应产物进行了微芯片电泳。关于泳动用聚合物，使用了未添加嵌入剂染料、而以终浓度4.9nM添加了微芯片电泳的光学系统中的焦点调整所需要的Cy5-dCTP(GE Bio社)的物质。关于泳动缓冲液使用了下述缓冲液：其与泳动用聚合物同样地以终浓度4.9nM添加了Cy5-dCTP(GE Bio社)，另外，代替以电泳的峰移动度计算的修正为目的而含有的15bp(低分子量标记)和1500bp(高分子量标记)的DNA片段而将经Cy5标记的15bp和1500bp的DNA片段添加到泳动缓冲液中。因此，在该电泳中，LH反应产物与在其双链DNA中结合的嵌入剂的非共存下得到分离检测。

将其结果示于图7-a和图7-b。需要说明的是，图7-b是将图7-a的用○包围的部分放大的图。

由图6和7的结果可知，即使在利用了KRAS基因的情况下，也与EGFR的结果同样地，在嵌入剂非共存下的LH反应产物的电泳分离(图7)中无法分离的KRAS基因上的单碱基置换变异G12V和野生型DNA在嵌入剂共存下进行电泳分离(图6)时，明确地被分离，可以进行识别检测。

即，可知：在作为LH反应产物的双链DNA和单链DNA所形成的杂交体的电泳分离中，通过存在嵌入剂而形成LH反应产物与嵌入剂的结合物并将其分离，其分离识别能力格外地提高。

实施例3 IDH1基因序列中的单碱基置换变异R132H和R132C的识别检测(丙烯酰胺聚合凝胶电泳)

(1)变异导入PCR用的引物的制备

为了将R132H(CGT>CAT)和R132C(CGT>TGT)人为地引入靶标DNA中，制备了2种变异导入PCR用的引物。将它们的序列示于下述表中。

[表4]

(2)来自人血液的人基因组DNA的制备和变异导入PCR

使用QIAamp DNA Blood Midi Kit(Qiagen社)，根据试剂盒所附的方案用蛋白酶K对人全血2ml在70℃处理10分钟，之后添加乙醇。进一步，将所得到的溶液离心分离，将其上清付于QIAmp Midi柱，提取人基因组DNA。准备2种此处得到的DNA提取液30μL(50ng/uL)中的1μL(50ng)，将该DNA作为模板，利用AccuPrime Taq聚合酶系统(PCR反应用试剂盒、Invitrogen社制造)进行变异导入PCR反应，得到2种DNA。需要说明的是，在该2种变异导入PCR反应中，1种是使用IDH1F(caaatggcaccatacgaaatattc[序列号22])作为正向引物、使用上述表4中的IDH1m3R作为反向引物，另一种是使用IDH1F作为正向引物、使用上述表4中的IDH1m4R作为反向引物。

具体来说，根据试剂盒所附的制品方案使用各10μM的反向和正向引物1.0μL和试剂盒所附的PCR反应缓冲液2.0μL、AccuPrime Taq酶0.5μL、ddH₂O 16.5μL，制备PCR用反应液20.0μL。使用该PCR用试样，利用DNA热循环仪(DNA EnginePTC200、MJ Research社)在下述的反应条件下进行了36个循环的PCR反应。

*PCR反应条件

热变性：95℃、15秒

退火：55℃、15秒

聚合反应：68℃、47秒

(3)样品DNA的扩增

接着，将由上述变异导入PCR反应得到的2种DNA分别稀释1000倍，之后将其1μL作为PCR扩增的模板，利用AccuPrime Taq聚合酶系统(PCR反应用试剂盒、Invitrogen社制造)进行PCR反应。即，首先，根据试剂盒所附的制品方案使用各10μM的引物(正向侧的IDH1F：caaatggcaccatacgaaatattc[序列号22]和反向侧的IDH1S：ttgccaacatgacttacttgatcc[序列号23])1.0μL和试剂盒所附的PCR反应缓冲液2.0μL、AccuPrime Taq酶0.5μL、ddH₂O 16.5μL，制备PCR用反应液20.0μL。使用该PCR用反应液，利用MJ Research社的DNA热循环仪(DNA Engine PTC200)在下述的反应条件下进行了30个循环的PCR反应。

*PCR反应条件

热变性：95℃、15秒

退火：55℃、15秒

聚合反应：68℃、47秒

另一方面，在制备来自野生型的序列的样品DNA时，将上述(2)中制备的来自人血液的DNA提取液1μL(50ng)作为直接的模板，与上述方法同样地进行了PCR反应。

(4)LH探针的制作

在形成野生型DNA以及变异型DNA的杂交体时，按照在作为靶标的基因组DNA上形成环结构的方式来设计探针，合成了LH探针(IDH1D7S)。

ttgccaacatgacttacttgatccccataagcatgacgtgataggttttacccatccac[序列号24]

需要说明的是，在下述LH反应中，使用了以Cy5(Amersham Biosciences社)对该LH探针的5’端进行了荧光修饰的探针。

在使用该探针时，与野生型DNA的杂交体用tcataggt形成环结构。另一方面，在与变异型(R132H)DNA形成杂交体时，用tcataggtcg形成环结构，在与变异型(R132C)DNA形成杂交体时，用tcataggtc形成环结构。

(5)LH反应

对于上述(3)中得到的3种PCR反应产物4.5μL，分别以最终浓度200nM添加LH探针(ID.＝IDH1D7S)，使用DNA热循环仪(DNA Engine PTC200、MJ Research社制造)在下述的反应条件下进行了1个循环反应。

*LH反应

PCR反应产物 4.5μl

LH探针 0.5μl(2μM)

105℃ 热盖

95℃ 2分钟

55℃ 0-30秒

68℃ 4分钟

4℃ 反应停止

(6)基于LH反应的杂交体的分离检测(丙烯酰胺聚合凝胶电泳)

向3种各1.5μl的在上述(5)中利用LH探针得到的LH反应产物(杂交产物)中分别添加凝胶加样缓冲液1.5μl，从而制成电泳用的试样。此处，为了确认LH反应产物和嵌入剂在共存的状态下被分离检测时的影响，对嵌入剂的添加浓度所产生的影响进行了研究。嵌入剂分别使用GelRed(和光纯药工业株式会社)和Cellstain PI Solution(碘化丙啶1mg/ml水溶液、同仁化学株式会社)，使嵌入剂浓度的终浓度相对于原液浓度分别为1/100倍、1/1000倍、1/10000倍，从而分别进行了实验。

电泳用的聚丙烯酰胺凝胶使用非变性10％、7cmx7cm的压缩凝胶(压缩凝胶C10L、ATTO社制造)，将Tris·甘氨酸缓冲液(37.5mM Tris,288mM Glycine)作为泳动缓冲液并利用小型电泳装置(ATTO社、AE-7300压缩PAGE)在室温下进行泳动。泳动后，利用激光成像扫描仪(Amersham社、STORM 860)进行Cy5的荧光检测(激发波长635nm、检测滤波器650LP)。

图8中示出使用GelRed作为嵌入剂所得到的结果。需要说明的是，条带4～6表示嵌入剂的终浓度为1/10000时的泳动结果，条带7～9表示嵌入剂的终浓度为1/1000时的泳动结果，条带10～12表示嵌入剂的终浓度为1/100时的泳动结果。另外，各条带中，Wt表示将野生型用作测定对象的结果，M3表示将R132H变异型用作测定对象的结果，M4表示将R132C变异型用作测定对象的结果。

比较例6 IDH1基因序列中的单碱基置换变异R132H和R132C的在嵌入剂非共存下的识别检测

在实施例3的(6)的基于LH反应的杂交体的分离检测中，除了不向电泳用试样中添加嵌入剂以外，与实施例3同样地进行实验。

将其结果与实施例3的结果一并示于图8。需要说明的是，图中，条带1～3是未添加嵌入剂而进行的结果。另外，Wt表示将野生型用作测定对象的结果，M3表示将R132H变异型用作测定对象的结果，M3表示将R132C变异型用作测定对象的结果。

由图8的结果可知，在嵌入剂非共存下的LH反应产物的电泳分离检测中，由于来自野生型和R132C变异型的样品的泳动带位置重叠，因此无法分离检测。与此相对：通过共存嵌入剂，从而可以明确地对在非共存下无法分离的LH反应产物进行分离。即，可知能够依赖于嵌入剂浓度地对来自野生型样品的泳动带和2种变异型(R132H、R132C)进行识别检测。另外，虽然图中未示出，但是在共存碘化丙啶而进行实验的结果中，也与共存GelRed的情况同样地，确认到来自野生型和R132C变异型的样品的泳动带的分离能力得到了改善。

实施例4 IDH1基因序列中的单碱基置换变异R132H和R132C的识别检测(微芯片电泳)

对于上述实施例3(5)中得到的3种LH反应产物(杂交产物)，使用Agilent2100生物分析仪系统(Agilent社)供微芯片电泳方法。

即，使用作为专用试剂的Agilent DNA1000 Assay试剂盒(Agilent社制造)，施加各反应产物1.0μL。作为嵌入剂，代替试剂盒附属的嵌入剂染料而使用GelRed(和光纯药工业株式会社)或者SYTO62(Molecular Probe社)。需要说明的是，关于本实施例中使用的该LH探针，使用了以Cy5对5’端进行了荧光修饰的探针，因此如本申请比较例1和比较例3所示，能够对利用了生物分析仪系统的检测波长区域的微芯片电泳中的LH反应产物进行检测。即，作为验证实验，是指可得到不被嵌入剂染料所具有的荧光波长区域及添加的有无本身所影响的峰检测结果。电泳后的峰解析中使用系统附属的Agilent2100专家软件，进行了波形解析和峰移动度的计算。

将作为嵌入剂而存在GelRed x1/1000终浓度时的结果示于图9。

比较例7 IDH1基因序列中的单碱基置换变异R132H和R132C的在嵌入剂非共存下的识别检测

除了不添加嵌入剂以外，与实施例4同样地进行实验。

将其结果示于图10。

如图10的结果所示，在嵌入剂非共存下的LH反应产物的电泳分离检测中，由于来自野生型(Wt)和R132C变异型的样品的泳动带位置重叠，因而无法分离检测。与此相对，在共存GelRed而进行实验的结果的图9中，能够明确地对在非共存下无法分离的LH反应产物进行分离。另外，虽然图中未示出，但是在共存SYTO62而进行实验的结果中，也与共存GelRed的情况同样地，带位置不重叠而能够分离检测3个DNA。即，可知：通过使用嵌入剂，分离精度提高，能够识别检测来自野生型DNA(Wt)的泳动带和来自2种变异型DNA(R132H、R132C)的泳动带。

实施例5、比较例8 ALDH2基因序列中的单碱基置多态性的识别检测(丙烯酰胺聚合凝胶电泳)

(1)包含ALDH2基因多态性的来自人血液的人基因组DNA的制备

利用QIAamp DNA Blood Midi Kit(Qiagen社)，根据试剂盒所附的方案用蛋白酶K对人全血2ml在70℃处理10分钟，之后添加乙醇。进一步，将所得到的溶液离心分离，将其上清付于QIAmp Midi柱，提取人基因组DNA。接着，将所得到的DNA提取液中的50ng作为PCR的模板材料，使用AccuPrime Taq聚合酶系统(PCR反应用试剂盒、Invitrogen社制造)进行PCR反应。

即，首先，根据试剂盒所附的制品方案使用各10μM的引物溶液(ALDHF；ggtcaactgctatgatgtgtttg[序列号25]和ALDHR；cagcaggtcccacactcac[序列号26])各0.5μL、以及试剂盒所附的PCR反应缓冲液2.0μL、AccuPrime Taq酶0.5μL、和ddH₂O 16.5μL，制备PCR用反应液20.0μL。其后，将上述得到的各人基因组DNA 50ng悬浮添加到PCR用反应液20μL中，作为PCR用试样。使用该PCR用试样，利用MJ Research社的DNA热循环仪(DNA Engine PTC200)在下述的反应条件下进行了36个循环的PCR反应。

*PCR反应条件：

热变性：95℃、15秒

退火：55℃、15秒

聚合反应：68℃、47秒

PCR反应后，将通过Millipore社的Montage PCR纯化后的扩增DNA作为样品DNA，将引物ALDHF[ggtcaactgctatgatgtgtttg；序列号25]用作测序引物，通过与前述的合成例1的(2)同样的方法进行测序确认。从其中得到第504位的氨基酸由谷氨酸(GAA)置换为赖氨酸(AAA)的ALDH2*2多态性的同源物、以及野生型DNA和ALDH2*2多态性的异源物、野生型DNA的同源物这3种样本，将它们作为试样。

(2)LH探针的制作

在与野生型DNA以及具有ALDH2*2多态性的DNA的杂交体形成时，按照在作为靶标的基因组DNA上形成环结构的方式进行设计，合成了下述LH探针(ALDH2D13R)。

cagcaggtcccacactcacagttttcacttcagcccgtactcgcccaactcccg[序列号27]

在使用该探针时，与野生型DNA的杂交体用gcaggcatacact形成环结构。另一方面，在与ALDH2*2多态性DNA的杂交体形成时，用gcaggcatacactg形成环结构。

(3)LH反应

对于上述(2)中得到的3种PCR反应产物4.5μL，分别以最终浓度200nM添加LH探针(ID.＝ALDH2D13R)，使用DNA热循环仪(DNA Engine PTC200、MJ Research社制造)在下述的反应条件下进行了1个循环反应。

*LH反应

PCR反应产物 4.5μl

LH探针 0.5μl(2μM)

105℃ 热盖

95℃ 2分钟

55℃ 0-30秒

68℃ 4分钟

4℃ 反应停止

(4)基于LH反应的杂交体的分离检测(丙烯酰胺聚合凝胶电泳)

向上述(3)中得到的LH反应产物(杂交产物)中的同源的样品1.5μl中分别添加凝胶加样缓冲液1.5μl，从而制成电泳用的试样。此处，为了确认LH反应产物和嵌入剂在共存的状态下被分离检测时的影响，作为嵌入剂使用GelRed(和光纯药工业株式会社)或者SYBR Green(Molecular Probe社)，各自以x1/1000终浓度的方式添加到上述电泳用试样中，进行实验。

此外，另一方面，作为比较实验，平行地进行嵌入剂非共存下的LH反应产物的分离检测(比较例8)。

将所得到的结果示于图11。需要说明的是，条带1表示在嵌入剂非共存下进行的实验结果，条带2表示在1/1000终浓度的GelRed共存下进行实验的结果，条带3表示在1/1000终浓度的SYBR Green共存下进行实验的结果。

由图11的结果可知，在嵌入剂非共存下的LH反应产物的电泳分离检测中，由于来自野生型“G”和ALDH2*2多态性“A”的各自的泳动带位置重叠，因而无法分离检测。与此相对，通过共存嵌入剂，能够明确地分离在非共存下无法分离的LH反应产物。进而，在SYBR Green共存下，与Gel Red共存下相比分离能力格外地提高，因而暗示通过嵌入剂的选择能够更有效地进行分离。

实施例6、比较例9 ALDH2基因序列中的单碱基置多态性的识别检测(微芯片电泳)

对于上述实施例5(3)中得到的3种LH反应产物(杂交产物)，使用Agilent2100生物分析仪系统(Agilent社)供微芯片电泳方法。

即，使用作为专用试剂的Agilent DNA1000 Assay试剂盒(Agilent社制造)，施加各反应产物1.0μL。作为嵌入剂，使用试剂盒附属的嵌入剂染料或GelRed(和光纯药工业株式会社)。均是预先与泳动用聚合物混合后再使用。

另一方面，为了进行与这些检定比较的实验，根据与本申请比较例1和比较例7所进行的同样的步骤，进行了嵌入剂非共存下的LH反应产物的分离检测。需要说明的是，针对本实施例中使用的该LH探针，制作了以Cy5对5’端进行了荧光修饰的探针，因此能够利用生物分析仪系统的检测波长区域对微芯片电泳中的LH反应产物进行检测。即，作为验证实验，是指可得到不被嵌入剂染料所具有的荧光波长区域及添加的有无本身所影响的峰检测结果。

电泳后的峰解析中使用系统附属的Agilent2100专家软件，进行了图12波形解析和峰移动度的计算。

将其结果示于图12-a和图12-b、图12-c。在图12-a和图12-b中，将分别测定野生型DNA的同源物和ALDH2*2多态性的同源物这2种样品所得到的泳动峰重叠示出。图12-a是在试剂盒附属的嵌入剂染料共存下的实验，图12-b是在嵌入剂非共存下的结果(比较例9)。图12-c测定了野生型DNA和ALDH2*2多态性的异源型样品，是作为嵌入剂将GelRed在x1/1000终浓度共存下进行的实验结果。

如图12-b的结果所示，在嵌入剂非共存下的LH反应产物的电泳分离检测中，由于来自野生型“G”和ALDH2*2多态性“A”的各自的泳动带位置重叠，因此无法分离检测。与此相对，在通过共存嵌入剂而进行了验证的图12-a或者图12-c中，能够明确地分离在非共存下无法分离的LH反应产物。即，可知能够识别检测来自野生型“G”的泳动带和来自ALDH2*2多态性“A”的泳动带。

实施例7以EGFR基因外显子19上的变异型DNA作为测定对象的在嵌入剂共存下的LH反应产物的分离检测(丙烯酰胺聚合凝胶电泳)

基于比较例3中得到的结果，确认了在丙烯酰胺聚合凝胶电泳的过程中在LH反应产物和嵌入剂共存的状态下对LH体进行分离检测时的影响。

具体来说，使用实施例1(2)的LH反应中得到的6种LH反应产物如下进行电泳。首先，向各1.5μl的6个样品中分别添加凝胶加样缓冲液1.5μl，从而制成电泳用的试样。向嵌入剂中以x1/1000终浓度加入GelRed(和光纯药工业株式会社)，并添加到上述电泳用试样中，调查其效果。

将如此得到的结果示于图13。需要说明的是，图中，条带1表示使用了变异型DNA(G1)的结果，条带2表示使用了变异型DNA(G2)的结果，条带3表示使用了变异型DNA(G3)的结果，条带4表示使用了变异型DNA(G4)的结果，条带5表示使用了变异型DNA(G5)的结果，条带6表示使用了野生型DNA(N)的结果。

图13的结果表明，针对比较例3中难以完全分离检测的来自G1～G5的样品克隆的泳动带，能够确认到本发明的效果，同时能够完全地识别检测各自的变异型。特别是，箭头(→)表示的变异型DNA(G2)、变异型DNA(G3)、变异型DNA(G5)的分离能力显著提高。

Claims

1.一种变异型DNA或/和野生型DNA的检测方法，其包括以下的工序(1)～(3)：

(1)使变异型DNA中的至少1种或/和野生型DNA与和两单链DNA杂交的探针接触，形成与变异型DNA的杂交体即变异型杂交体或/和与野生型DNA的杂交体即野生型杂交体的工序，所述变异型DNA是具有置换碱基、缺损碱基区域、或者插入碱基区域的单链DNA，所述野生型DNA是与所述变异型DNA中的至少1种对应的野生型单链DNA，其中，变异型杂交体和野生型杂交体中的至少1种具有环结构；

(2)使所得到的变异型杂交体或/和野生型杂交体与嵌入剂接触的工序；和

2.如权利要求1所述的方法，其中，环结构包含置换碱基、缺损碱基区域或插入碱基区域，或者包含正常碱基或正常碱基区域。

3.如权利要求1所述的方法，其中，环结构具有茎结构。

4.如权利要求1所述的方法，其中，对变异型杂交体与嵌入剂的结合体或/和野生型杂交体与嵌入剂的结合体进行分离的方法为电泳法。

5.如权利要求1所述的方法，其中，嵌入剂是吖啶色素、乙锭化合物、碘化合物、7-氨基放线菌素D(7-AAD)、花青二聚物系色素、花青单体系色素、SYTOX系色素、GelRed系色素、与DNA双螺旋的小沟结合的物质、或者与腺嘌呤-胸腺嘧啶序列特异性结合的物质。