PL86966B1 - - Google Patents

Description

***** ¦ I Twórcawynalazku: Uprawmony z patentu: Eli Lilly and Company, Indianapolis (Stany Zjednoczone Ameryki) Sposób wytwarzania nowego kompleksu soli insuliny i protaminy Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania nowego kompleksu soli insuliny i protaminy, który stosuje sie Jako skladnik aktywny w srodkach hypoglikemicznych. Nowy kompleks soli insuliny i protaminy charakteryzuje sie przedluzonym dzialaniem, jak wszystkie znane preparaty insulinowó-protaminowe, lecz w odróznieniu od nich charakteryzuje sie szybkim, prawie natychmiastowym zadzialaniem. Ponadto kompleks ten fest trwaly i moze byc przechowywany przez dluzsze okresy czasu w stanie suchym lub w postaci zawiesin.Znane preparaty insulinowó-protaminowe np. opisany przez Hagerdorna i innych wJ.Am.med.Assoc.t.106,177 (1936) kompleks insulinowo-protaminowy otrzymany na drodze traktowania insuliny protamina w buforze fosforanowym, czy insulina cynkowo-protaminowa opisana przez Scotta i Fischera w J. Pharmacol.exper.Therapeut., t.58,78 (1936) i opisie patentowym St. Zjedn. Amer. nr 2 143 591, sa prepara¬ tami trudnorozpuszczalnymi i wchlaniaja sie powoli.Znane preparaty, otrzymywane na drodze mieszania roztworów soli cynkowych krystalicznej lub bezposta¬ ciowej insuliny z insulina cynkowo-protaminowa lub insulina protaminowa, charakteryzuja sie stosunkowo mala stabilnoscia ze wzgledu na degradacje protaminy i wytracanie rozpuszczalnego skladnika insulinowego przez nadmiar protaminy, obecnej w mieszaninie.Sposród innych preparatów insulinowych o przedluzonym dzialaniu znane sa, np. z polskiego opisu patentowego nr 36324, zawiesiny insuliny krystalicznej z cynkiem lub innymi metalami ciezkimi. Wprowadzone w ostatnich latach na rynek preparaty insulinowe, zawierajace roztwory cynkowej insuliny krystalicznej, pochodzacej z trzustki wieprzowej, czy zawiesiny krystalicznej insuliny wolowej o wysokiej zawartosci cynku, równiez nie sa wolne od wad. Stosunkowo mala czystosc, niestabilnosc, zabarwienia, zanieczyszczenia czynnikami hiperglikemicznymi np. glukagonem i antygenowymi wysokoczasteczkowymi proteinami, wystepuja¬ ce w preparatach insuliny cynkowej stanowia powazny problem.Sposobem wedlug wynalazku wytwarza sie kompleks soli insuliny z metalem alkalicznym lub soli amonowej insuliny z protamina przez wprowadzenie protaminy i soli insuliny z metalem alkalicznym lub soli amonowej insuliny do srodowiska wodnego opH = 6,5-8,0 w ilosci 0,2-1,5 mg protaminy na 100 jednostek insuliny, w wyniku czego tworzy sie zawiesina nierozpuszczalnego kompleksu. Kompleks pozostaje zawieszony w srodowisku plynnym i nadaje sie do injekcji; pozostawiony w srodowisku plynnym jest stabilny i niewykazuje2 86 966 utraty mocy przez okres co najmniej jednego roku. Kompleks soli insuliny z protamina, otrzymany sposobem wedlug wynalazku jest substancja krystaliczna, która mozna równiez wydzielic np. przez odsaczenie, a nastepnie wysuszyc. Kompleks w stanie suchym mozna przechowywac przez dlugi okres czasu bez zmiany wlasciwosci.Przed injekcja sucha substancje wprowadza sie do srodowiska wodnego, korzystnie do roztworu izotonicznego 0 pH okolo 6,5—8,0, tworzac homogeniczna zawiesine. Otrzymana zawiesina w formie pojedynczej injekcji daje natychmiastowe zadzialanie przy jednoczesnym dzialaniu przedluzonym.Charakter wiazania miedzy sola insuliny i protamina nie jest dokladnie znany, jednakze wiazanie to jest na tyle mocne, ze nierozpuszczalny kompleks mozna z latwoscia wydzielic ze srodowiska cieklego i wysuszyc dla latwiejszego przechowywania i transportu. Produkt w stanie suchym moze byc przetrzymywany przez nieokres¬ lony okres czasu.Poczatkowo sadzono, ze szybkie zadzialanie obserwowane w preparatach soli insuliny i protaminy zwiazane jest z wystepowaniem w cieczy macierzystej wolnej insuliny, jednakze na podstawie analiz stwierdzono, ze tylko 0,015% calkowitej ilosci insuliny, zawartej w preparacie, pozostaje w postaci rozpuszczalnej. Z tego wynika, ze polaczenie insuliny z protamina jest raczej luzne, w zwiazku z czym insulina szybko ulega absorpcji po wstrzyknieciu. Charakter tego kompleksu wydaje sie byc równiez inny, niz w znajdujacych sie w sprzedazy preparatach insuliny cynkowo-protaminowej, w których dysocjacja insuliny jest znacznie powolniejsza w tkan¬ kach i w zwiazku z czym preparaty nie wykazuja szybkiego zadzialania.Do wytwarzania kompleksu soli insuliny i protaminy stosuje sie sól insuliny w zasadzie wolna od cynku, tj. o zawartosci cynku ponizej 0,05%, otrzymywana na drodze alkalicznej krystalizacji insuliny przy uzyciu wodorotlenku metalu alkalicznego lub amoniaku. Po krystalizacji krysztaly przemywa sie i suszy sie do zawartosci wilgoci ponizej 10%. Sól insuliny rozpuszcza sie w wodzie przy pH obojetnym i moze byc przechowywana w roztworze bez zmian wlasciwosci do trzech miesiecy.Odpowiednimi jonami metalu alkalicznego lub metaloidów, które stosuje sie do wytwarzania soli insuliny sa jony sodu, potasu litu, cezu i amonu.Sól metalu alkalicznego insuliny otrzymuje sie przez dzialanie jonami metalu alkalicznego na surowa insuline, co powoduje krystalizacje insuliny w postaci soli metalu alkalicznego.Ze wzgledów ekonomicznych i latwe poslugiwanie sie korzystnie jako zródlo jonów metalu alkalicznego stosuje sie wodorotlenek sodowy. Sól sodowa otrzymuje sie, dzialajac w roztworze wodnym surowej insuliny wodorotlenkiem sodowym, w takiej ilosci, aby uzyskac wartosc pH =8—8,5. Roztwór alkaliczny miesza sie lagodnie w ciagu co najmniej 15 minut, korzystnie w ciagu okolo 1 godziny lub wiecej. W tym czasie wytraca sie osad soli sodowej insuliny, który latwo oddziela sie przez dekantacje, odwirowanie, saczenie lub innym sposobem. Sól sodowa insuliny mozna oczyscic przez kolejne rozpuszczenie soli i ponowne wytracenie osadu w postaci krysztalów. Wedlug analizy sól sodowa insuliny zawiera okolo 1 moi sodu na okolo 1 mol insuliny.Krysztaly insuliny sodowej pochodzenia wieprzowego lub wolowego sa dobrze rozpuszczalne w wodzie i roztworach izotonicznych o pH bliskich odczynu obojetnego.Protamine na ogól stosuje sie w postaci siarczanu protaminy lub w postaci innej rozpuszczalnej soli.Kompleks soli insuliny i protaminy otrzymuje sie w srodowisku cieklym przy wartosci pH = 6,5—8,0, korzystnie okolo 7,2—7,6. Jesli jako srodowisko ciekle stosuje sie roztwór izotoniczny, korzystnie winien on zawierac srodki konserwujace jak np. p-hydroksybenzoesan fenylu lub metylu.Aktywnosc biologiczna kompleksu insuliny i protaminy oznaczano na królikach. Próby prowadzono w sposób nastepujacy. 36 królików, nie karmionych przed próba przez 24 godziny podzielono na dwie równe grupy, w czasie badania nie podawano im wody, ani pozywienia. Dla oznaczenia poczatkowej zawartosci cukru we krwi pobierano próbke krwi z zyly brzeznej ucha. Grupie kontrolnej królików wstrzykiwano uprzednio oznaczona dawke obojetnej insuliny protaminowej Hagedorn (NPH). Grupie testowej wstrzykiwano kompleks soli sodowej insuliny z protamina (PSI). Pojedyncza dawka na kazdy test wynosila 1,0 jednostek na królika, co w przyblizeniu stanowi 0,01 ml preparatu insulinowego. Pierwsze próbki krwi pobierano od kazdego królika po uplywie minut, dalsze próbki po uplywie 1,5, 3,0, 5,0, 7,0 i 9,0 godzin od chwili injekcji i analizowano na zawartosc cukru. Wyniki wyrazono w mg % glikozy. Obliczano przecietne stezenie cukru we krwi w poszczególnych czasach krwawienia dla obydwu grup. W przypadku testu krzyzowego królikom, które otrzymaly próbke kontrolna, wstrzykiwano kompleks insuliny protaminowo-sodowej i vice versa. Testy takie prowadzono przez przeciag tygodnia od zakonczenia wlasciwych testów* Wyniki wyrazono jako przecietne stezenie cukru we krwi w mg % 1 przedstawiono na fig. 1 i ponizej w tablicy 1.86 966 3 Tablica 1 Czas Poziom cukru we krwi, mg % w godzinach 0 0,5 1,5 3,0 5,0 7,0 9,0 Próba kontrolna na(NPH) 83,8 64,9 43,3 41,3 64,6 67,4 69,8 Próba wlasciwa (PSI) 80,1 51,1 36,9 36,1 51,1 60,6 70,9 Z powyzszych danych wynika, ze kompleks soli sodowej insuliny i protaminy wywoluje szybkie dzialanie i bardzie] przedluzone dzialanie, niz produkt NPH.Insuline protaminowa-sodowa (PSI) porównywano z mieszanina kwasnej normalnej insuliny (ARO oraz NPH w stosunku 1 :1 w przeliczeniu na aktywnosc. Stezenie siarczanu protaminy wynosilo 0,8 mg/ml.Próby prowadzono z 36 królikami systemem krzyzowym, przy czym kazdemu wstrzykiwano okolo 0,1 ml insuliny tak, aby kazdy otrzymal 1 jednostke insuliny na injekcje. Uzyskane wyniki przedstawiono na fig. 2 i w ponizszej tablicy 2.Tablica 2 Czas Poziom cukru we krwi, mg % w godzinach 0 0,5 1,5 3,0 5,0 7,0 9,0 Próba kontrolna ARI oraz NPH 88,0 45,9 34,2 43,5 71,6 84,2 88,6 Próba wlasciwa PSI 87,2 59,3 47,1 45,2 51,9 58,0 64,3 Wyniki potwierdzaja szybkie zadzialanie, jak i przedluzone dzialanie.Nastepna próbe porównawcza przeprowadzono na trzech rodzajach obojetnej insuliny protaminowo-sodo- we| w polaczeniu z 0,02 mg cynku na 100 jednostek insuliny. Cynk dodawano, aby stwierdzic, czy przeszkadza on, czy taz nie przeszkadza, szybkiemu zadzialaniu lub przedluzonemu dzialaniu, wywolanemu kompleksem biauHfiy proterolnowo^sodowej. forówneno trzy .produkty, insuline wieprzowa, wolowa oraz mieszanine, zawierajaca 75% insuliny wolowe) i 25% insuliny wieprzowej.Kazdy test prowadzono na 6 królikach, wstrzykujac po okolo 0,01 ml insuliny, co odpowiada okolo jednej Jednostce insuliny. Wyniki przedstawiono na fig. 3 oraz w ponizszej tablicy 3.Tablica 3 Czas Poziom cukru we krwi, mg % w godzinach 0 1,5 3,0 5,0 7,0 9,0 Insulina wieprzowa 80,3 41,5 44,5 53,4 73,0 76,6 mieszana 80,2 40,5 37,6 53,1 60,7 65,6 wolowa 85,5 42,6 35,3 38,5 53,4 63,0 Insulina wieprzowa wykazuje szybkie zadzialanie, chociaz trwanie dzialania bylo krótsze niz innych insulin. Insulina wolowa i mieszana wywoluja zadzialanie szybkie i dlugotrwale.Nalezy zwrócic uwage, ze do kompleksu soli sodowej insuliny i protaminy dodano mala ilosc cynku i stwierdzono, ze dwuwartosciowy metal taki, jak cynk, nie powinien znajdowac sie w znaczacych ilosciach w trakcie tworzenia sie soli sodowej insuliny. Cynk dodano do kompleksu soli sodowej insuliny i protaminy dla4 86 966 upewnienia sie, czy cynk wywiera jakies dzialanie na kompleks insuliny. Na podstawie wyników uznano, ie cynk nie wywiera zadnego wplywu na wartosc lecznicza insuliny.Podane nizej przyklady wyjasniaja blizej sposób wedlug wynalazku.Przyklad I. Przyklad ten ilustruje wytwarzanie kompleksu protaminy i insuliny w postaci odpowied¬ nich dawek do podawania. Krystaliczna sól sodowa insuliny wolowej przygotowano nastepujaco.Insuline ekstrahowano z trzustki wolowej zakwaszonym roztworem wodno-alkoholowym, zageszczano pod zmniejszonym cisnieniem i czesciowo oczyszczano przez frakcjonowanie wytracanie chlorkiem sodowym, a nastepnie wytracanie w punkcie izoelektrycznym. Insuline dalej krystalizowano przy wartosci pH-8,2, otrzymane krysztaly rozpuszczano w 0,5 n kwasie octowym i ponownie frakcjonowano przez filtracje zelowa na Sephadexie G-50 (produkcji Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Szwecja).Wyciek, którym byl roztwór insuliny w 0,5 n kwasie octowym zobojetniono do wartosci pH -8,2 wodorotlenkiem sodowym 1 n i mieszano wciagu jednej godziny w temperaturze pokojowej. Krysztaly insuliny sodowej odsaczono, przemyto 2% roztworem chlorku sodowego, zadano nadmiarem alkoholu absolutnego, energicznie mieszajac, po czym przesaczono i zebrano osad. Po drugim przemyciu alkoholem absolutnym krysztaly przemyto eterem i osuszono pod zmniejszonym cisnieniem. Otrzymane krysztaly wolowej insuliny sodowej wykazuja moc 25,08 jednostek/mg, zawartosc azotu 15,82%, zawartosc wilgoci 8,0%, wskaznik barwy 0,005 dla 1 % roztworu przy 340 m/t. 3,98 g suchej insuliny sodowej rozpuszczono w 990 ml apyrogennej wody, zawierajacej 2,27 g cieklego fenolu oraz 1,5 ml 1% kwasu solnego. Wartosc pH roztworu doprowadzono do 7,4, dodajac 1,7 ml 10% wodorotlenku sodowego. Próby immunologiczne, zgodnie z wymogami standartu Farmakologii Stanów Zjedno* czonych Ameryki, wykazaly aktywnosc insuliny 101,3 jednostek/ml. Roztwór ten saczono jalowo, a nastepnie napelniano fiolki po 1,0 ml i liofilizowano aseptycznie. Tak otrzymana sucha insuline sodowa przechowywano.Do kazdej fiolki z insulina dodano odpowiednia ilosc rozcienczalnika izotonicznego tak, aby uzyskac stezenie 101,3 jednostek insuliny na 1 ml plynu. Izotoniczny rozcienczalnik o wartosci pH ¦ 7,4 zawiera 0,4 mg siarczanu protaminy/ml, 1,6% gliceryny oraz 0,25% fenolu w % wagowych w przeliczeniu na objetosc. W trakcie dodawania plynu izotonicznego do suchej insuliny sodowej natychmiast powstaje kompleks insuliny protamino wo-sodowej w postaci homogenicznej zawiesiny w wodnym rozcienczalniku tak, ze do strzykawki wprowadza sie równowazne ilosci insuliny na kazda wprowadzona dawke.Przyklad II. Przeprowadzono próbe dla zilustrowania doskonalej stabilnosci kompleksu. Neutralny kompleks soli sodowej insuliny z protamina (PSI) otrzymano sposobem wedlug przykladu I, z tym, ze izotoniczny rozcienczalnik zawieral 1,2 mg protaminy/ml. Testy przeprowadzono na 9 królikach. Kompleks insuliny protaminowo-sodowej zawieszano w izotonicznym rozpuszczalniku, a w przerwach miedzy testami przechowywano go w temperaturze 25°C. Królikom wstrzykiwano, jak poprzednio, 0,01 ml insuliny.Uzyskane wyniki przedstawiono na fig. 4 oraz w ponizszej tablicy 4.T a b I i c a 4 Czas Poziom cukru we krwi, mg % w godzinach 0 1,5 3,0 5,0 7,0 9,0 Poczatkowo 91,0 51,2 43,4 54,0 59,5 65,8 Po tygodniu 84,1 49,3 43,2 48,4 52,1 61,2 Po 2 tygodniach 78,3 45,0 33,5 37,6 48,9 54,6 Po 4 tygodniach 95,3 40,9 29,8 36,6 45,7 55,8 Jak wynika z powyzszej tablicy zawieszony roztwór izotoniczny, zawierajacy kompleks insuliny protanninc* wo-sodowej, przechowywany w temperaturze 25°C, wykazuje duza stabilnosc aktywnosci insuliny wraz z utrzy¬ maniem wlasciwosci zarówno szybkiego zadzialania i dlugotrwalego dzialania. * Przyklad III. Wytwarzanie i zastosowanie kompleksu protaminowego insuliny amonowej, litowej i potasowej oraz sodowej.Kazda z wyzej wymienionych soli insuliny, wytworzono sposobem, opisanym w przykladzie I, po czym zmieszano z roztworem izotonicznym, zawierajacym 0,4 mg siarczanu protaminy/ml i wstrzykiwano 18 królikom w sposób, podany w przykladzie I. Uzyskane wyniki przedstawiono na fig. 5 oraz w ponizszej tablicy 5.86 966 6 Tablica 5 Czas Poziom cukru we krwi, mg % w godzinach 0 1,5 3,0 5,0 7,0 9,0 Kation Amon 86,1 42,1 51,6 84,5 79,4 88,9 Lit 87,1 38,6 38,6 60,0 75,9 81,1 Potas 86,6 42,9 50,8 67,1 74,6 79,4 Sód 80,1 36,9 36,1 51,1 60,6 70,9 Chociaz dzialanie insuliny sodowej trwalo dluzej, kazda z innych kompozycji wykazuje istotne zmniejsze¬ nie poziomu cukru we krwi.Przyklad IV. Przyklad ilustruje stabilnosc kompleksu insuliny protaminowo-sodowej. Kompleks przygotowano sposobem wedlug przykladu I, stosujac 0,4 mg/ml siarczanu protaminy w roztworze izotonicz- nym. Pó przygotowaniu kompleks umieszczono w kilku próbkach w wirówce. Po odwirowaniu plynny superna- tant dekantowano. Oddzielony osad przemyto okolo 15 ml alkoholu absolutnego, a nastepnie okolo 15 ml eteru. Przemyty osad suszono pod zmniejszonym cisnieniem w temperaturze pokojowej.Sucha substancje ponownie zawieszono w obojetnym roztworze izotonicznym, jak opisano wyzej z tym, ze nie dodawano siarczanu protaminy. Aktywnosc otrzymanej substancji wynosi 88—95 jednostek/ml, przy czym stwierdzono nieznaczna strate substancji w czasie przemywania kompleksu insuliny protaminowo-sodowej przed tuszeniem. Testy, jak poprzednio, prowadzono na 9 królikach. Uzyskane wyniki podano w ponizszej tablicy 6.Substancje liofilizowano po ponownym zawieszeniu w wodzie.Tablica 6 Czas Poziom cukru we krwi, mg % w godzinach 0 0,5 1,0 3,0 5,0 7,0 9,0 Suszenie pod zmniejszonym cisnieniem Liofilizacja Kazdy zliofilizowany kompleks insuliny po podaniu zmniejszal zasadniczo poziom cukru we krwi. PL

Claims (3)

1. Zastrzezenia patentowe 1. Sposób wytwarzania nowego kompleksu soli insuliny i protaminy, znamienny tym, ze do srodowiska wodnego opH = 6,5—8,0 wprowadza sie protamine i sól insuliny z metalem alkalicznym lub sól amonowa insuliny, w ilosci 0,2-1,5 mg protaminy na 100 jednostek insuliny.
2. 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jako srodowisko wodne stosuje sie roztwór izotoniczny.
3. 3. Sposób wedlug zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, ze jako sól insuliny stosuje sie sól sodowa insuliny. 82,0 52,5 57,3 67,8 76,7 74,3 77,3 85,4 44,7 45,6 53,1 77,9 80,7 80,0s86 966 FI6.3 not FIG. 4 FIG. 5 PL