CS209458B2

CS209458B2 - Method of making the complex of the insuline salt with the protamine

Info

Publication number: CS209458B2
Application number: CS722923A
Authority: CS
Inventors: Richard L Jackson
Original assignee: Richard L Jackson
Priority date: 1971-04-30
Filing date: 1972-04-28
Publication date: 1981-12-31
Also published as: CA976085A; YU36155B; DK131760C; RO64387A; NL178258B; DK131760B; NL7205865A; DD100708A5; HU166989B; DE2219635B2; GB1385086A; ZA722243B; PL86966B1; FI49773C; ES402176A1; FR2134658A1; CH566784A5; NO137178C; BE782651A; DE2219635C3

Description

Vynález - se týká způsobu výroby komplexu inzulínové soli s protaminem.

Předmětem vynálezu je tedy způsob výroby komplexu inzulínové soli -s protaminem, vyznačující se tím, že se při pH 6,5 až 8,0 uvede v reakci ve vodném prostředí protaminu a zinku a těžkých kovů prostá sůl inzulínu s alkalickým -kovem nebo- amonná sůl inzulínu tak, že na každých 100 jednotek inzulínu se přidá 0,2 až 1,5 mg protaminu, za vzniku suspenze ve vodě nerozpustného komplexu.

Současné inzulínové preparáty se obvykle rozdělují na krátkodobé, středně dlouhé nebo s prodlouženým účinkem s - ohledem na jejich biologickou účinnost. U mno/ ha případů cukrovky je žádaným -preparátem k terapeutickému užití takový, jež má rychlý nástup účinku a prodloužené trvání působení. Takové dvojité působení k účinému potlačení hyperglykemie, používající jediné injekce, nevykazuje dosud žádná z obchodně dosažitelných inzulínových směsí.

Přestože v posledních letech předem smíšené inzulínové přípravky, mající žádané krátkodobé a středně dlouhodobé hypoglykemické působení, byly zavedeny na trh, vyžadují tyto- preparáty stále ještě speciální skladování a konzervaci a vyžadují zlep2 šení. Předem smíšené preparáty se skládají z roztoku - krystalického zink-inzulínu -získaného z prasečích pankreatů a krystalického hovězího inzulínu s vysokým -obsahem zinku. Ostatní - dřívější - preparáty, ve - kterých se smísí roztoky krystalického zink-inzulínu nebo amorfního -inzulínu s preparáty protamin-zink-inzulínu, narážely na problémy stability vyvolané rozkladem protaminu a rovněž precipitací rozpustné - inzulínové vložky přebytkem protaminu - ve směsi. Mnoho problémů jako je nízká - čistota, nedostatečná stabilita barva, znečištění hyperglykemickým hormonem - (glukagonem) a antigenními proteiny s velkou molekulární vahou, brzdily vývoj přípravku majícího jak rychlý nástup, tak dlouhotrvající hypoglykemické působení.

Jednou z předností tohoto vynálezu je, že umožňuje jednotlivou injekci inzulínové suspenze, která po aplikaci vede jak k rychlému -nástupu účinku, tak k jeho - prolongovanému trvání. - Další předností je, že inzulínový komplex -nebo -suspenze mohou být skladovány po dlouhou dobu bez podstatného rozkladu.

Na obr. 1, 2, -3, 4 a 5 jsou grafy, -kde jsou vyneseny hladiny krevního cukru dosažené injekcemi řady různých inzulínových preparátů u zvířat.

Obr. 1 obsahuje graf . srovnávající účinek injekce preparátu natrium-protamin-inzulínového a isophanininzulínového (NPH). Na ose úseček je uveden čas v hodinách, na ose pořadnic hladina cukru v krvi v mg%.

Obr. 2 jde o graf · srovnávající účinek komplexu nebo suspenze připravené podle tohoto vynálezu s účinkem směsi kyselého obyčejného inzulínu a isophan-inzulín^u. Na ose úseček je uveden čas . v hodinách, na ose pořadnic ' hladinu cukru v krvi v mg ·%ol. Křivka 1 znázorňuje průběh hladiny cukru · v případě směsi běžného inzulínu a isophan-inzulínu, křivka ·2 v případě komplexu podle · vynálezu.

Obr. 3 jde o graf srovnávající tři suspenze připravené podle vynálezu a to, hovězího· inzulínu, vepřového inzulínu a jejich směsi. Na ose úseček je uveden čas v hodinách, na ose pořadnic hladina cukru v krvi v mg %. Křivka 1 znázorňuje vliv vepřového inzulínu, křivka 2 vliv směsi vepřového a hovězího inzulínu [75 % : 25 %) a křivka 3 vliv hovězího inzulínu.

Obr. 4 jde o· graf porovnávající účinnost komplexu podle vynálezu po· skladování. Na ose úseček je uveden v hodinách, na ose pořadnic hladina · cukru v krvi v mg %. Na křivce 1 je účinek ' · při · použití ihned po · výrobě při 25 °C, · na křivce 2 účinek po 1 týdnu při 25 °C, křivce 3 účinek po 4 týdnech při 25 °C. Je zřejmé, že účinnost je v podstatě stálá.

Obr, 5 obsahuje graf srovnávající příkla· dy komplexů a suspenzí připravených podle vynálezu. Na ose úseček je uveden č.as v hodinách, na se pořadnic hladina cukru v krvi v mg °/o. Na· křivce 1 je účinek amonné · soli, · na · křivce 2 lithné soli na křivce 3 draselné soli a · na křivce 4 sodné soli. Je zřejmé, že · sodná sůl je nejvýhodnější.

Obr. 6 · obsahuje graf, získaný podáním komplexu · podle vynálezu [křivka 1) a směsi · natriumprotaímininzulínu s ísophan-inzulínem· NPH (křivka 2) čtyřem osobám na lačno¹ [od půlnoci do 17 hodin). · Bylo podáno · vždy 0,25 jednotek/kg. Na ose úseček je uveden čas v hodinách, na ose pořadnic hladina cukru v krvi v mg %. Je zřejmé, že účinek komplexu podle vynálezu je podstatně příznivější.

Komplex inzulínové soli s protaminem utvořený způsobem podle vynálezu je užitečný jako aktivní složka v hypoglykemícké směsi mající jak rychlý· nástup, tak prolongovaný účinek. Inzulínová sůl je buď solí alkalického kovu, nebo solí amonnou a protamin se s výhodou užívá jako sulfát v poměru na každých 100 jednotek inzulínu od 0,2 do 1,5 mg, s · výhodou od 0,4 do 0,8 mg.

Inzulínová sůl, která je v podstatě zbavena zinku nebo jiného těžkého· kovu se s výhodou připraví krystalizaci inzulínu v alkalickém prostředí s užitím hydroxidu sodného, hydridu alkalického kovu nebo' hydroxidu amonného. Po krystalizaci se krystaly · promyjí a usuší na vlhký zbytek nepřesáhující 10 %) obsahu · vody. Inzulínová sůl je rychle rozpustná ve vodě za . .. neutrálního pH a může být v roztoku skladována po dobu tří měsíců bez podstatných změn.

V souhlasu se způsobem podle vynálezu se · svrchu popsaná inzulínová sůl a protamin smísí ve vodném prostředí, a tak vytvoří komplex inzulínové soli a protaminu. Vodné prostředí má pH kolem 6,5 do 8,0. Komplex protaminu a inzulínové soli může být snadno oddělen filtrací nebo podobnými způsoby od tekutého prostředí a usušen. Komplex může být v suché formě . skladován nejméně po· dobu jednoho roku i déle bez poškození. Je-li třeba použít komplex protaminu a inzulínové soli, suchý · materiál se rekonstituuje ve vodném prostředí, s výhodou se užívá jako rozpouštědla izotonických roztoků o pH · 6,5 až 8,0. Po rekonstituci je komplex připraven k injekci. Pacient, jemuž byl rekonstituovaný preparát * aplikován, pocítí jak rychlý nástup, tak prodloužené trvání hypoglykemícké aktivity.

Typická metoda k přípravě · komplexu protaminu s inzulínovou solí zahrnuje přípravu · sodné soli inzulínu takovým · způsobem, že natrium inzulín je prakticky bezzinkový, to znamená, že obsahuje méně než 0,05 % zinku. Sodná ·· sůl je krystalická, · ale je rozpustná ve vodě a v izotonických rozpouštědlech. Po · přípravě se sodná sůl rozpustí v tekutém prostředí a to v poměru 90 až 115 jednotek na 100 ml tekutého média. Do· tekutého· média se přidá přiměřené množství protaminsulfátu. Ihned se vytvoří nerozpustný komplex ve formě velmi jemného· precipitátu. Precipitát rozptýlený na jemné částečky zůstává dobře suspendován v tekutém médiu a · dovoluje uživateli ·snadnou injekční · aplikaci. Je-li komplex skladován v tekutém médiu, zůstává stálý a · nevykazuje žádnou ztrátu účinnosti po dobu nejméně jednoho roku. Jestliže · se sušený komplex protaminu · a inzulínové soli rekonstituje, je · žádoucí míchat komplexem v tekutém prostředí, aby se precipitát rovnoměrně v tekutině distribuoval k injekčnímu použití.

Přesná povaha asociace mezi inzulínovou solí a protaminem není známa, avšak aso- * ciace je dostatečně pevná, takže nerozpustný komplex je snadno separovatelný z tekutého prostředí a dá se vysušit, což usnadňuje zacházení při distribuci přípravku · % a umožňuje dlouhodobé skladování. Výro- * bek v suché formě může · být skladován bez časového omezení.

Nejprve · · se mělo za to, že rychlý · nástup účinku pozorovaný · s preparáty · komplexu protaminu s inzulínovou solí je způsoben volným inzulínem v mateřském tekutém médiu, avšak analýza ukázala, že jenom 0,015 °/o celkové inzulínové aktivity přípravku zůstává v rozpustné formě.

Z toho plyne, že · spojení inzulínu · s · protaminem není příliš pevné, a tak inzulín může · být brzy po· injekci schopen absorpce.

Také je možné, že povaha tohoto komplexu je odlišná od známých komerčních preparátů protamin-zink-inzulínových, u nichž je disociace inzulínu z komplexu ve tkáních mnohem pomalejší a kde nedochází к žádnému rychlému nástupu v působení.

Komplex inzulínové soli s protaminem se tvoří v kapalném prostředí o pH 6,5 až 8,0, s výhodou 7,2 až 7,6.

Sůl inzulínu s alkalickým kovem se získá tak, že se uvede surový inzulín ve styk s ionty alkalického kovu, čímž dojde ke Krystalizací inzulínu ve formě soli s alkalickým kovem. Z ekonomických důvodů a pro snadné provedení tohoto postupu je ja* ко zdroj iontu alkalického kovu nejvýhod^ nější hydroxid sodný. Sodná sůl se připraví tak, že se vodný roztok surového inzulínu uvede ve styk s hydroxidem sodným v množství, které je dostatečné к zajištění pH 8,0 až 8,5. Postup se provádí za míchání alkalického roztoku alespoň 15 minut, s výhodou hoainu nebo delší dohu. Sodná sůl inzulínu se vysráží a lze ji snadno izolovat odstředěním, filtrací, slitím apod. Produkt může být čištěn rozpuštěním a opětovaným vysrážením tak dlouho, až se získá sraženina, podobná krystalkům. Analýzou bylo prokázáno, že v případě sodné soli inzulínu, sůl obsahuje 1 mol sodíku na 1 mol inzulínu. Krystaly sodné soli inzulínu mohou být vyrobeny z inzulínu hovězího nebo vepřového, jsou velmi rozpustné ve vodě a v izotonických roztocích při neutrálním pH.

Vhodnými alkalickými kovy nebo kovy alkalických zemin, kterých lze užít к přípravě inzulínových solí, jsou zejména draslík, lithium, cesium, sodík a amonný iont.

Protamin se obvykle užije ve formě síranu nebo jakékoli jiné vhodné, ve vodě rozpustné formě.

V případě, že se jako kapalného prostředí pro síran protaminu a inzulínovou sůl užije izotonický roztok běžného typu, je výhodné, aby obsahoval ještě konzervační prostředek, například fenol, nebo methylparahydrcxybenzoát.

Biologická účinnost komplexu inzulínu s protaminem byla stanovena na králících následujícím způsobem: 36 králíků bylo rozděleno na dvě stejně veliké skupiny a 24 hodin před pokusem jim nebyla podávána potrava, v průběhu testu nedostávala zvířata potravu ani vodu. Vzořek krve byl odebrán z ušní žíly a ve vzorku byla stanovena počáteční koncentrace krevního cukru. Kontrolní skupině králíků byl podán neutrální Hagedornův protamininzulín (NPH) v předem stanovené dávce. Zkušební skupina dostala komplex sodné soli inzulínu s protaminem (PSI). Jednotlivá dávka byla 1,0 jednotky pro králíka, tato dávka byla podána v objemu přibližně 0,01 ml. První vzorky krve byly u každého králíka odebrány po 1/2 hodině, další vzorky za 1,5 hodin, 3,0 hodin, 5,0, 7,0 a 9,0 hodin po injekci. Každý vzorek krve byl zkoumán na hladinu krevního- cukru, výsledky byly vyjádřeny v mg % glukózy. Pro obě skupiny byla potem vypočítána průměrná hladina krevního cukru při každém odběru.

Po týdnu byl pokus opakován se stejnými skupinami králíků až na to, že obě skupiny byly zaměněny, to znamená, že původní kontrolní skupina nyní obdržela komplex sodné soli inzulínu s protaminem a obráceně. Výsledky jsou vyjádřeny jako průměrná hladina krevního cukru v mg % na obr. 1 a v tabulce 1.

T a b u 1 к a 1

Hladina krevního cukru mg %

Cas v hodinách 0 0,5 1,5 3,0 5,0 7,09,0 kontrola (NPH) 83,8 64,9

PSI 80,1 51,1

43,3 41,3 64,6 67,469,8

36,9 36,1 51,1 60,670,9

Je zřejmé, že komplex sodné soli inzulínu s protaminem zajistí rychlejší nástup účinku a delší trvání účinku než přípravek, který byl užit pro srovnání.

PSI (sodná sůl inzulínu s protaminem) býla srovnávána se směsí ARI (běžný inzulín kyselé povahy) a NPH v poměru 1 : 1.

Koncentrace protaminsulfátu byla 0,8 mg na ml.

Při tomto testu bylo užito 36 králíků opět dvakrát. Každý králík dostal 0,01 ml inzulínu, tak aby toto množství tvořilo jednu inzulínovou jednotku. Výsledky jsou uvedeny na obr. 2 a v tabulce 2.

1,5 3,0

5,0 7,0 9,0

Tabulka 2

Oas v hodinách 0 0,5

ARI a NPH 88,0 45,9

PSI 87,2 59,3

34,2	43,5	71,6	84,2	88,6
47,1	45,2	51,9	58,0	64,3

Uvedené výsledky potvrzují rychlý nástup áčinku u komplexu protaminu s inzulínem stejně jako dlouhé trvání tohoto účinku.

Bylo· provedeno srovnání tří typů neutrálního protaminu a sodné soli inzulínu v kombinaci s O,02 mg zinku na 100 jednotek inzulínu. Každý z inzulínových přípravků obsahoval 0,02 mg zinku na 100 inzulínových jednotek. Zinek byl přidáván proto, aby mohlo být stanoveno případné působení zinku na rychlý nástup účinku nebo na prodloužené působení přípravku. Jak je z vý sledků zřejmé, nebyl zjištěn žádný nepříznivý účinek v tomto smyslu.

Srovnávány byly tři přípravky, a to vepřový inzulín, hovězí inzulín a směs obsahující 75 % hovězího inzulínu a 25 % vepřového Inzulínu.

Každá ze zkoušek byla provedena na šesti králících, a to jedinou injekcí 0,01 ml přípravku s obsahem 1 jednotky inzulínu. Výsledky jsou uvedeny na obr. 3 a v tabulce

3.

Tabulka 3

Čas v nudinách 0

Hladina krevního cukru mg %

1,5 3,0 5,0

7,0

9,0

vepřový inzulín	80,3	41,5
směs	80,2	40,5
hovězí inzulín	85,5	42,6

44.5 55,4 73,076,7

37.6 53,1 60,765,6

35,3 38,5 53,463,0

Vepřový inzulín má rychlý nástup účinku, přestože trvání účinku nebývá tak dlouhé, jako u ostatních inzulínových přípravků. Hovězí inzulín a smíšený přípravek mají i rychlý nástup účinku i dlouhé trvání.

Mimoto je třeba se zmínit o tom, že malé množství zinku bylo přidáváno i ke komplexu sodné soli inzulínu s protaminem. Bylo totiž zijštěno, že dvojmocné kovy, jako je zinek nemají být přítomny ve velkých množstvích již v průběhu tvorby sodné so-li inzulínu. Inzulín byl ke komplexu přidáván proto, aby bylo prokázáno, zda má zinek nějaký vliv na inzulínový komplex. Z výsledků je zřejmé, že zinek ani nesnižoval ani nezvyšoval léčebnou hodnotu přípravku.

Vynález bude osvětlen následujícími příklady.

Píklail

Krystalický hovězí inzulín ve formě své sodné soli byl připraven takto:

Inzulín byl extrahován z hovězí slinivky břišní okyselenou směsí vody a alkoholu, extrakt byl koncentrován destilací ve vakuu a částečně čištěn frakčním srážením chloridem sodným a izoelektrickým srážením. Inzulín . byl dále čištěn krystalizací v alkalickém prostředí při pH 8,2. Výsledné krystalky byly rozpuštěny v 0,5 N kyselině octové a dále podrobeny gelové filtraci na přípravku Sephadex G-50 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Švédsko).

Eluát, který sestával z 0,5 N roztoku kyseliny octové a obsahoval inzulín, byl alkaúčinnost dusík obsah vody barevný index lizován až na pH 8,2 1,0 N roztokem hydroxidu sodného a míchán 1 hodinu při teplotě místnosti. Krystalky sodné soli inzulínu byly odděleny filtrací a promyty - 2% roztokem chloridu sodného. Promyté krystaly byly pak smíseny s absolutním alkoholem za energického míchání a odděleny filtrací. Po druhém promytí absolutním . alkoholem byly krystaly promyty éterem' - a usušeny ve vakuu.

Výsledná krystalická sodná sůl hovězího inzulínu měla tyto vlastnosti:

25,08 jednote-k/tóg 15,82 . % 8,0 · - ' % 0,005 pro 1% roztok při 340 nfn.

3,98 g sodné soli inzulínu bylo rozpuštěno v 990 ml apyrogenní - vody -s obsahem 2,27 g fenolu a 1,5 ml 10% kyseliny solné. pH tohoto roztoku . bylo pak upraveno - ^: na

7,4 přidáním 1,7 ml 10% hydroxidu sodného. Imunologické zkoušky ukázaly, že účinnost inzulínu je 101,3 jednotek/ml. Tento roztok byl sterilizován filtrací, pak byl plněn do ampulí v množství 1,0 ml na ampúli a ampule byly i s obsahem lyofilizovány za sterilních podmínek, čímž byl získán · v každé ampuli sušený přípravek sodné soli inzulínu. Tento přípravek byl v - této formě skladován až do použití.

Do- každé z ampulí bylo uvedeno dostatečné množství isotonického ředidla a -inzulín byl rekonstituován tak, že obsahoval

101,3 jednotek inzulínu v 1 ml prostředí.

Izotonické ředidlo sestávalo z 0,4 mg protaminsulfátu/ml, 1,6 . glycerinu a 0,25 % fenolu (váha/objem). Ředidlo· mělo pH 7,4. Po přidání této ' kapaliny k sušené sodné soli inzulínu došlo okamžitě ke tvorbě komplexu protaminu se sodnou solí inzulínu. Tento komplex bylo možno pozorovat jako velmi jemně rozptýlenou sraženinu. Tato sraženina vytvořila suspenzi dostatečně jemnou, takže ji bylo možno odebírat injekční stříkačkou a přitom bylo možno zajistit stejné množství inzulínu v každém z odebraných podílů.

P ř í k 1 a d 2 losí komplexu protaminu s inzulínem. Neutrální PSI, užitý v tomto příkladu, byl připraven podle příkladu 1 ' s tím · rozdílem, že izotonické ředidlo obsahovalo 1,2 mg protaminu v ml.

Každá ze zkoušek byla provedena na 9 králících. Přípravek byl skladován při teplotě 25 °C v intervalu mezi jednotlivými zkouškami ve formě suspenze v izotonickém ředidle. Stejně jako v předchozích pokusech bylo králíkům injekčně aplikováno 0,01 ml přípravku.

Výsledky jsou znázorněny na obr. 4 a uvedeny v tabulce 4.

V příkladu 2 je prokázána výborná stáTabulka 4

Hladina krevního cukru v mg %

Cas v hodinách	0	1,5	3,0	5,0	7,0	9,0
na počátku	91,0	51,2	43,4	54,0	59,5	65,8
po 1 týdnu	84,1	49,3	43,2	48,4	52,1	61,2
po 2 týdnech	78,3	45,D	33,5	37,6	48,9	54,6
po 4 týdnech	95,3	40,9	29,8	36,6	45,7	55,8

Údaje v tabulce 4 jasně prokazují, že i když je izotonický roztok komplexu protaminu se sodnou solí inzulínu skladován . při 25 °C, je velmi stálý v tom smyslu, že účinnost inzulínu je uchována i pokud jde o rychlý nástup účinku i pokud jde o jeho dlouhé trvání.

Příklad 3

V příkladu je uvedena tvorba komplexu protaminu s amonnou solí inzulínu, lithnou solí inzulínu a 'draselnou solí inzulínu, stejně jako se sodnou solí inzulínu z příkladu i.

Každá ze svrchu zmíněných solí byla utvořena způsobem podle příkladu 1, to znamená, že po tvorbě soli byl její roztok smíšen s izotonickým roztokem, který obsahoval 0,4 mg protaminsulfátu na ml. Výsledný roztok byl pak injekčně podán 18 králíkům způsobem. stejným jako v příkladu 1. Výsledky jsou znázorněny na obr. 5 a v tabulce 5.

Tabulka 5

Hladina krevního cukru v mg %

Čas v hodinách	0	1,5	3,0	5,0	7,0	9,0
amonná sůl	86,1	42,1	51,6	81,5	79,4	88,9
lithná sůl	87,1	38,6	38,6	60,2	75,9	81,1
draselná sůl	86,6	42,9	50,8	67,1	74,6	79,4
sodná sůl	80,1	36,9	36,1	51,1	60,6	. 70,9

Přestože ' sodná sůl má dlouhodobý účinek i ostatní typy solí mají poměrně velmi dlouhodobé účinky na snížení krevního cukru.

Příklad 4

Příklad dokládá stálost komplexu protaminu se sodnou solí inzulínu. Komplex byl připraven stejně jako v příkladu 1 použitím protaminsulfátu v koncentraci 0,4 mg/ml v izotonickém ředidle. Hotový komplex byl rozdělen do několika zkumavek, které byly odstředěny a supernatant byl slit. Sraženi na byla promyta 15 ml absolutního alkoholu a pak 15 ml éteru. Promytá sraženina byla pak usušena ve vakuu při teplotě místnosti.

Takto usušený výsledný produkt byl znovu rozpuštěn nebo uveden v suspenzi v neutrálním izotonickém ředidle, stejného složení jako svrchu až na to, že neobsahoval protaminsulfátu. Pak byla určena účinnost této suspenze a bylo zjištěno, že se pohybuje v rozmezí 88 až 95 jednotek/ml, takže zřejmě došlo k malým ztrátám inzulínu při promývání komplexu protaminu se sodnou solí inzulínu před sušením ve vakuu.

Zkoušky byly prováděny stejně jako v předchozích příkladech na 9 králících. Údaje jsou uvedeny v tabulce 6. Pokus s lyofilizovaným materiálem byl proveden tak, že komplex byl lyofilizován až po· vytvoření druhé suspenze ve vodě.

Tabulka 6

Hladina krevního cukru mg °/o

Cas v hodinách	0	0,5	1,0	3,0	5,0	. 7,0	9,0
sušeno ve vakui	82,0	52,5	57,3	67,8	76,7	74,3	77,3
lyofilizováno	85,4	44,7	45,6	53,1	78,9	80,7	80,0

Oba přípravky způsobovaly podstané snížení hladiny krevního cukru.

Claims

1. Způsob výroby komplexu inzulínové soli s protaminem, vyznačující se tím, že se při pH 6,5 až 8,0 uvede v reakci ve vodném prostředí protamin a zinku a těžkých kovů prostá sůl inzulínu s alkalickým kovem nebo amonná sůl inzulínu tak, že na každých 100 jednotek inzulínu se přidá 0,2 až 1,5 mg protaminu, za vzniku suspenze ve vodě nerozpustného komplexu.

2. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že jako vodného prostředí se užije izotonického roztoku.

3. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že jako inzulínové soli se užije sodné soli inzulínu.

4. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se získaný nerozpustný komplex izoluje z vodného prostředí a jeho obsah vody se sníží pod 10 hmotnostních %.